Summary
在这个协议中，我们描述了两种策略，同时抑制这两个基因在蜜蜂（双基因敲除）。然后，我们提出了如何用长鼻延伸反应（PER）的检测，以研究双基因敲除对蜜蜂的味觉感知的效果。
Abstract
此视频演示新颖的RNA干扰（RNAi）技术下调两个基因同时使用双链RNA（dsRNA）的注射液的蜜蜂。同时还介绍了协议的长鼻扩展响应（PER）检测味觉感知测量。
RNAi介导的基因敲除技术是一种有效的下调靶基因的表达。这种技术通常用于单基因操作，但是它有局限性来检测基因之间的相互作用和共同作用。在这段视频的第一部分中，我们提出了两种策略，同时打掉两个基因的（称为双基因敲除）。我们表明这两种策略都能够有效地抑制这两个基因，卵黄蛋白原（VG）和ultraspiracle（USP），这是在调节反馈回路。这双基因敲除的方法可以用来分析基因之间的相互关系，可以很容易地应用在不同的昆虫种类。
该视频的第二部分是蜜蜂双基因敲除的治疗后长鼻扩展响应（PER）检测示范。市盈率法是一种标准的测试测量味觉感知的蜜蜂，这是一个重要的征兆，一个蜜蜂的行为成熟的速度有多快。大巢蜜蜂表示味觉感知行为发展的增加往往与花粉的觅食觅食专业化的发病年龄提前。此外，每次检测可用于识别代谢蜜蜂在饱食或饥饿状态。最后，结合配对不同的刺激气味，空调的蜜蜂也被广泛用于学习和记忆研究蜜蜂每次检测。
Introduction
RNA干扰（RNAi）是基于RNA的转录后基因沉默，这发生在各种各样的真核生物。 RNAi过程被触发时由内源性或外源性的双链RNA（dsRNA）的前体。双链RNA激活核糖核酸酶蛋白Dicer酶结合并切割双链RNA小片段（20-25个基点）。然后，小片段的双链RNA导Argonaute蛋白的mRNA互补的识别和切割RNA诱导的沉默复合物（RISC），催化剂组分。在哺乳动物中，超过30 nt的双链RNA，激活抗病毒反应（IFN）干扰素反应，从而导致非特异性降解RNA转录2。然而，长dsRNA已被证明是有效的，具体的昆虫，因为有一个缺乏这IFN 3。
长双链RNA下调靶基因已被用于在不同的昆虫种类。蜜蜂是一个π介子能效比昆虫生物，其中许多重要功能基因的开发和行为已被揭露出来使用双链4,5。几个dsRNA的交付方法，已进行了蜜蜂的dsRNA喂养蜜蜂幼虫6有效下调靶基因的表达，而在蜜蜂胚胎和成年蜜蜂7,8双链RNA注射液是一种有效的基因敲除的方法。
展出的昆虫双链RNA的基因敲除的影响是短暂和局部的。有研究表明，腹腔注射双链RNA和胸双链RNA注射，有效地抑制靶基因的表达，腹部脂肪体细胞的昆虫9,10。双链RNA注射到腹腔和胸腔和脂肪体细胞能够采取双链RNA细胞血淋巴沐浴10。然而，基因在其他器官，如卵巢和大脑，不能有针对性要么腹腔或胸腔注射。以目标基因在蜜蜂的大脑，大脑的dsRNA注入也被执行，有效地影响局部脑区11靶基因的表达。在这里，我们只记录腹双链RNA注射，这是较为常用的成年蜜蜂。
RNA干扰已被主要用于针对一个单一的基因，一直是一个强大的工具来揭示基因功能。然而，任何基因从别人不是孤立的，它是在复杂的调控网络。了解生物过程的一个关键是解剖与对方，这需要同时操作多个基因，而不是一个单一的基因敲除基因如何相互作用。在哺乳动物细胞系同时抑制两种或三种基因，科学家们已经成功地通过输送系统12多的microRNA（miRNA）的发夹设计13。但在昆虫，多基因击倒仍未经验证。这里，我们PRESEN了吨不同注射的策略可以实现双基因敲除。我们的目标是两种基因：卵黄蛋白原（VG），它编码一个卵黄蛋白的前体，和ultraspiracle（ 美国药典 ），保幼激素（JH），编码一个假定的受体可能作为一种转录因子介导的反应在蜜蜂JH 14。 Vg和JH相互调节在反馈回路15，并参与了蜜蜂行为调节9。使用双基因敲除，我们扰乱Vg和JH途径，并发现它们是如何共同影响蜜蜂的行为和生理VG，USP和JH如何互动9。
味觉感知是一种行为预测蜜蜂社会行为16。行为的发展，巢蜜蜂高味觉感知行为成熟的快，通常在生命早期的牧草，喜欢收集花粉16,17。虽然监管米相关echanisms味觉感知目前仍不清楚，有研究表明，味觉的感知与内部能量代谢9，荷尔蒙分泌18,19和生物遗传胺通路20。 Vg和JH重要的荷尔蒙调节调节味觉感知7,21。在实验室中，味觉感知蜜蜂的变化进行评估测试长鼻延伸反应（PER）的不同的蔗糖溶液。每个蜂测试升序一系列浓度为0.1，0.3，1，3，10，30％的蔗糖的液滴的水通过触摸她的触角。注意，如果蜜蜂完全延伸她的长鼻液滴的水或蔗糖时，每个天线被触摸到的正响应。理想的反应溶液的数量的基础上，每一个人的味觉感知水平，可确定16。但是，应用程序的PER并不限于测量克感知ustatory。市盈率也是一种有效的方法来测试，如饱食与饥饿的代谢状态的蜜蜂。蜜蜂蔗糖有较大的反应一般是饿（王Amdam的，未发表的数据）。此外，市盈率的模式也可以被用来在联想学习和记忆的蜜蜂。在这种情况下，蜜蜂将接受培训，蔗糖水与气味是否存在关联。当蜜蜂学习的联想，只有存在的气味能唤起积极长鼻响应，没有奖励他们与蔗糖22,23。在这段视频中，我们将展示如何执行市盈率评估味觉感知，已与VG和USP双击倒在先前的研究9。
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Protocol
第1部分：RNAi介导的双基因敲除
1。双链RNA合成
- 设计针对VG，USP和控制基因编码绿色荧光蛋白（GFP），这是不是在蜜蜂基因组的双链RNA引物设计引物，利用网上免费软件引物（ http://frodo.wi.mit.edu/ ） 。
- 合成的双链RNA为VG，USP和GFP：利用RiboMax T7 RNA生产系统在体外转录自Promega。
- 双链RNA纯化：
- 变性和复性：热的dsRNA到85°C为5分钟，让它冷却下来，在室温下1小时。
- 的DNase I处理：加1微升的DNase I到每个dsRNA的反应，并把它们通过轻弹管。在37℃下孵育15分钟
- 加入150μl无核酸酶的水和750微升TRIZOL - LS的每一个反应，轻轻混匀投资耳听管。孵育样品在30℃下5分钟
- 添加到每个样品200μL氯仿。大力混合，持续20秒。离心样品在4℃下以12,000×g的15分钟
- 将上清转移相到每一个新的管中，并添加到各管中加入500μl异丙醇。将它们混合颠倒离心管。孵育混合物于-20℃下的20分钟离心机在4℃下以12,000×g的10分钟
- 去上清，使用1,000微升75％乙醇洗涤沉淀。后5分钟，以7500×g离心管在4℃，空气干燥的双链RNA沉淀，用无核酸酶的水，以溶解沉淀。为了保证疗效的基因的下调，双链RNA的浓度应为约9-10微克/微升。
2。腹腔注射双链RNA
双基因敲除，有两种策略：1）单注：混合两种基因的双链RNA和仁济克拉的混合物，2）双天注射剂：注射针对一个基因的第一天的第一个双链RNA，并注入第二双链RNA，在第二天到相同的蜜蜂。
- 冰寒新出现蜜蜂在4℃冰箱1-2分钟。当蜜蜂被固定，安装3-4蜜蜂在培养皿昆虫针其腹部和thoraces之间越过固体蜡并行。
- 再次在4℃冰箱冷藏蜜蜂。确保蜜蜂是完全不动。它需要大约1-2分钟。蜜蜂看起来应该松动。如果蜜蜂变得卷曲或扭曲，这意味着他们都是冰鲜太长，应加以避免。冷太多造成很高的死亡率，但完整的固定是非常重要的，因为任何运动伤口的大小和死亡率增加。
- 汉密尔顿微量注射器，将一次性30 G针（BD）。 3微升的双链RNA，并确保在注射器中有没有气泡。针被插入到侧腹部，以避免损坏晋内脏。按注射器柱塞慢慢地使被吸收的双链RNA。由于双链RNA非常粘稠，需要2-3秒被完全驱逐出注射器。完全倒推柱塞后，留下的针在伤口上，持续4-5秒。观察蜜蜂注射后3-5秒。如果从伤口的血淋巴滴泄漏，丢弃的蜜蜂。
- 使用不同的颜色来标记他们的thoraces对应不同的治疗方法。此时如果使用单次注射战略，蜜蜂可以被放置到一个殖民地1小时后观察。但是，如果使用两日的喷射策略，在被注射与第一次的dsRNA，蜜蜂应放置在气缸内的网笼的一侧供给的蜂蜜，并保持在孵化器在34℃和80％湿度。
- 第二天，按照步骤2.2和2.3寒意在笼蜜蜂，它们安装在蜡板。进行注射，因为它是与第二双链RNA的说明步骤2.4的床。
- 让蜜蜂在室温下恢复1小时，并介绍他们到一个殖民地。
注意：击倒效果可以由定量RT-PCR（实时定量RT-PCR）和免疫印迹检测。在一般情况下，击倒效果各不相同，取决于很多因素。在我们的研究中，可以检测单一注射后第7天，为期两天的注射双基因敲除。
第2部分：长鼻扩展响应（PER）检测
1。收集蜜蜂从蜂巢
注射后第6天，收集处理后的蜜蜂从殖民地，而不吸烟者。收集蜜蜂金属网筒笼。保持每笼3只蜜蜂。
2。安装蜜蜂为每
冷藏的蜜蜂在4°C，直到他们完全固定。在每只蜜蜂垂直安装成一个塑料管，专为市盈率。全光照，保持管内的腹部G两个小块胶带，保持头部伸出的管子。将机架上有两排小塑料柱管，并分配一个ID号每个管（蜂）。成一个孵化器（34°C和80％的湿度），然后把处理后的蜜蜂在机架上，并让他们在孵化器2个小时。
3。准备蔗糖水解决方案系列
准备0％，0.1％，0.3％，1％，3％，10％和30％的蔗糖水溶液和加载的成15-20ĝ针的注射器的解决方案。
4。每次试验
0％的溶液（水），然后通过0.1％，0.3％，1％，3％，10％和30％的蔗糖水溶液液滴的触摸蜜蜂的天线。测试所有的蜜蜂先用清水允许使用各解决方案之间的间隔至少两分钟。因此，我们通常至少有20蜜蜂每次试验。如果蜜蜂完全伸出长鼻，积极响应计算。
5。数据管理
总结每一个人的积极响应，味觉反应得分（GRS）。进行适当的统计分析数据。
第3部分。基因击倒验证的
脂肪体解剖从7日龄治疗的蜜蜂另一套。程序是用一个标准的TRIZOL RNA提取，随后通过DNA酶I处理24。Vg和美国药典的基因表达分析通过两个步骤的实时定量RT-PCR。 肌动蛋白被用作参照基因，因为它具有在不同组织中的表达稳定蜜蜂。发布时间实时PCR vg的和美国药典基因的引物，用于在本实验中24。数据分析使用三角洲三角洲CT方法25。
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Representative Results
无论是单次注射，为期两天的注射策略明显减少VG（单因素方差分析，P <0.001）（ 图2A）和USP（单因素方差分析，P <0.001）（ 图2B）转录水平的蜜蜂6天之后的双链RNA注射。通过与双链RNA的混合物的单次注射和vg的第一和第二美国药典（vg的 / 美国药典 ）2天注射的美国药典转录抑制是显着低于两日的注射用美国药典 （ 美国药典 / vg的第一和vg秒） （事后分析，对混合与USP / VG = 0.013，P VG / USP与USP / VG = 0.019）。
在双击倒蜜蜂GRS明显高于GFP控制蜜蜂（学生t检验，P = 0.0496）（ 图3）。
图1。的RNA干扰（RNAi）/长鼻延长的反应（PER）的检测。四组50新出现的蜜蜂流程图分别注射双链RNA（dsRNA）的卵黄蛋白原（VG）和ultraspiracle（ 美国药典 ），通过使用不同的组合策略，或与绿色荧光蛋白（GFP）基因的蜜蜂基因组中不存在双链RNA。蜜蜂放在一个蜂巢注射后，收集了6天之后。通过采用实时PCR的基因敲除验证每个组收集了16个蜜蜂，每团30人长鼻扩展响应（PER）的检测。 GFP的dsRNA表示蜜蜂注射GFP双链RNA; VG + USP混合物'表示蜜蜂遭离弃与VG和USP双链RNA混合物;，“VG / USP'表示蜜蜂注射与VG双链RNA上的第一天，第二天再注射USP双链RNA; USP / VG'表示USP双链RNA注射蜜蜂的第一天，注射vg的双链RNA在第二天。
图2。双基因敲除采用实时荧光定量PCR验证。登录变换处理后的蜜蜂腹部脂肪体mRNA的相对值（平均值±SEM）。 mRNA的相对值进行了计算使用三角洲三角洲CT法（A）VG表达双链RNA注射后第6天。 VG成绩单明显下调三双K nockdown方法（单因素方差分析，P <0.001），（B）USP表达双链RNA注射后第6天。 USP成绩单明显减少三双敲除方法（单因素方差分析，P <0.001）。然而，USP表达双链RNA混合物和VG / USP注射蜜蜂远低于注射USP / VG（事后分析，p 混合物与USP / VG = 0.013，P VG / USP蜜蜂与美国药典 / vg的 = 0.019），这表明vg的，可以是伯的vg和JH调节回路调节器在。 “RQ”表示相对定量的靶基因的转录水平。上述酒吧不同的字母表示治疗组之间的显着差异。
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图3。味觉反应评分（GRS）使用长鼻延伸反应（PER）的检测。vg 的美国药典双链RNA的混合物被注射蜜蜂有较高的比GFP控制GRS，表明他们是更敏感的蔗糖。上述酒吧不同的字母表示治疗组之间的显着差异（学生t检验，P = 0.0496）。
图4。可能的调控基因网络发现使用VG和USP双敲除的方法。保幼激素（JH）在蜜蜂大脑中产生和分泌到血淋巴。卵黄蛋白原（VG）是由脂肪体细胞蛋黄蛋白前体。 Vg和JH在反馈回路调节代谢的生理学OGY，味觉感知，以及在蜜蜂觅食，觅食偏好发病年龄。的研究表明，ultraspiracle（USP），是一种假定JH受体可能作为一种转录因子。我们的双击倒VG和USP透露VG中起着中心作用之间的关系，VG，USP和JH的。我们发现双击倒VG和USP造成了较大的增长比VG单击倒在JH，和USP单击倒并没有引起任何变化JH。这表明，不仅抑制卵黄蛋白原JH生产，但抑制反馈JH反应到USP击倒（A）。双击倒，从降低的JH生产结果抑制Vg的急剧增加引起VG击倒和一种代偿性反应降低JH传导引起的USP击倒（B）2。我们发现USP转录丰度明显降低由USP双链RNA时，主要是VG或同时下调，说明VG的USP mRNAto的双链RNA抑制的敏感性。 VG如何参与RNA干扰（RNAi）？ VG调节蜜蜂的免疫防御和RNAi抗病毒先天免疫系统的一部分。我们以前的研究表明Argonaute蛋白3（GB19389 PIWI），RNA诱导的沉默复合体（RISC）的重要组成部分，是影响蜜蜂的社会行为（味觉感知，发病年龄在觅食，觅食优先）的候选基因之一，这是VG / JH模块控制。因此，一种可能性是，Vg的可能抑制ARGONAUTE的影响RISC（A）的活性的蛋白质。 VG是下调时，USP双链RNA能更有效地降低的USP表达（B）3。我们的双击倒研究还表明，USP不VG生产脂肪体介导的抑制作用JH，因为既不是单一的USP击倒影响VG的转录丰，也不双VG和USP击倒导致进一步减少VG成绩单点击这里查看大图 。
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Discussion
我们的研究是第一次努力，同时打掉两个基因在成虫。我们的研究结果表明，这两种策略（单次注射，为期两天的注射双链RNA注射）双基因抑制，同时基因沉默的VG和USP是有效的，可以测试后第6天的双链RNA注射到蜜蜂8,9。然而，基因敲除的功效不同的靶基因，蛋白质周转率和双链RNA的细胞或器官的吸收效率取决于转录水平不同的昆虫种类。此外，RNA干扰的效果是剂量依赖性的。我们发现新出现的蜜蜂可以接受4微升的dsRNA，但死亡率迅速增加，如果超过4微升的dsRNA注入。因此，两日的喷射策略做了一个试验，这需要较高量的注射体积比单次注射到更适合。
在这里，双基因敲除9
例如Vg和JH是在反馈环路中，调节蜜蜂生理和行为成熟26,27。以往的研究表明，蜜蜂28 VG的基因敲除可以增加JH水平，而可以减少局部应用JH VG表达29。此外，研究人员建议USP是一个公认的JH受体，可能介导JH作为转录因子14,30。然而，如何VG调制JH滴度和USP是是否参与调节VG JH仍然知之甚少。使用双敲除的方法，我们已经发现了详细的VG，USP和JH之间的相互关系（
市盈率是一个标准的味觉感知的蜜蜂，它已被用于作为预测35蜜蜂社会行为的发展，用于测量检测。蜜蜂，具有灵敏度高糖通常在生命早期开始觅食，喜欢收集花粉。味觉感知，也可以测试在任何其他大规模的行为进行研究，预测社会行为的治疗效果。此外，我们已经表明，味觉的感知与内部代谢状态9因此，市盈率可以用来识别饱食和饥饿程度。此外，每雇用气味条件配对学习学习蜜蜂和记忆。总的来说，每法是一种非常有用的技术，用于研究蜜蜂的行为和生理代谢。然而，每敏感的处理方法36。例如，蜜蜂寒心麻醉或CO 2反应更灵敏蔗糖比对照组36。白天每也各不相同，环境条件和应力敏感。因此，它是非常重要的环境和一致的程序，在实验过程中保持。在一般情况下，我们每早晨完成，并在随后的日子里按照相同的时间表。我们通常在清晨开始收集蜜蜂上午8:00开始，准备进行它需要3个小时。如果PER需要进行跨数天，这是重要的，它在很短的情况下，环境的变化而变化的期间内完成。市盈率应采取组，每组包括20多蜜蜂，因为至少2分钟的间隔之间要保持不同concentrati的蔗糖解决方案的组件。我们已经做了每组75-100蜜蜂。
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Acknowledgments
笔者想，感谢Erin Fennern的协助实验。这项工作是由挪威研究理事会（180504，185306和191699），皮尤慈善信托基金，国家衰老研究所（NIA P01 AG22500）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
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