Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג'ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות שבו זמנית לדכא שני גנים (מציאה גן כפולה) בדבורי דבש. לאחר מכן אנו מציגים כיצד להשתמש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay כדי לחקור את ההשפעה של מציאה גן כפולה על תפיסה התעוררה אצל דבורת דבש.

Abstract

וידאו זה מדגים טכניקות חדשניות של התערבות RNA (RNAi) אשר downregulate שני גנים בו זמנית בשימוש בדבורי דבש פעמיים התקועות RNA (dsRNA) זריקות. הוא גם מציג פרוטוקול של הארכת תגובת חוטם (PER) assay למדידת בחוש טעם.

מציאה גן RNAi בתיווך היא טכניקה יעילה downregulating ביטוי יעד גן. טכניקה זו משמשת בדרך כלל למניפולצית גן יחידה, אך יש לו מגבלות לזהות אינטראקציות והשפעות משותפות בין גנים. בחלקו הראשון של הסרטון הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות כדי להפיל בו זמנית שני גנים (הנקרא מציאה גן כפולה). אנחנו מראים את שתי האסטרטגיות מסוגלים לדכא ביעילות שני גנים, vitellogenin (טוב מאוד) וultraspiracle (USP), הנמצאים בלולאת משוב רגולטורים. גישת מציאה הגן הכפולה הזה יכול לשמש כדי לנתח יחסי גומלין בין הגנים ויכולה להיות מיושמת בקלות במיני חרקים שונים.

בחלקו השני של הסרטון הזה הוא הפגנה של תגובת assay הארכת חוטם (PER) בדבורי דבש לאחר הטיפול במציאת גן כפול. Assay PER הוא מבחן סטנדרטי למדידת בחוש טעם בדבורי דבש, אשר הוא מנבא מפתח עבור כמה מהר התבגרות ההתנהגות של דבורת דבש היא. בחוש טעם גדול יותר של דבורי קינון מצביע על התפתחות התנהגותית שעלתה קשורה לעתים קרובות עם גיל מוקדם יותר בתחילתו של חיפוש אחר מזון וליקוט התמחות באבקת פרחים. בנוסף, יכול להיות מיושם לכל assay לזהות מדינות המטבולית של שובע או רעב בדבורי דבש. לבסוף, לכל assay בשילוב עם זיווג גירויי ריח שונים למיזוג הדבורים גם בשימוש נרחב ללמידה ולזכרון מחקרים בדבורי דבש.

Introduction

התערבות RNA (RNAi) היא השתקת RNA המבוסס לאחר תעתיק גן, אשר מתרחשת במגוון רחב של אורגניזמים אוקריוטים. התהליך של RNAi מופעל על ידי אנדוגני או אקסוגני RNA (dsRNA) מבשרי פעמיים תקועים. DsRNA מפעילה דייסר חלבון ribonuclease אשר נקשר ודבק dsRNA לרסיסים קטנים (20-25 נקודות בסיס). ואז את שברים הקטנים של מדריך dsRNA הכרה ומחשוף של mRNAs משלימה על ידי חלבוני argonaute, מרכיב הקטליטי של RNA-Induced השתקה מורכב (RISC) 1. ביונקים, dsRNAs ארוכה יותר מ -30 NT, להפעיל תגובה אנטי (תגובת אינטרפרון, IFN) שמובילה להשפלה ספציפיות של RNA תעתיקים 2. עם זאת, dsRNAs הארוך הוכיח להיות יעיל וספציפי בחרקים שכן יש חוסר של IFN זה 3.

dsRNAs ארוך היה בשימוש במשך downregulation של גני המטרה במינים חרקים שונים. דבורי דבש הם אחד Pionאורגניזמים חרקים EER שבו פונקציות של גנים רבים וחשובים בהתפתחות וההתנהגות נחשפו באמצעות dsRNA 4,5. שיטות משלוח dsRNA כמה בוצעו בדבורי דבש: האכלת dsRNA יעילות downregulates ביטוי גן המטרה בדבש זחלי דבורה 6, ואילו הזרקת dsRNA היא גישה יעילה למציאת גן בעוברי דבורת דבש ודבורים 4 מבוגרים 7,8.

השפעות מציאה הגן הוצגו על ידי יישום dsRNA לחרקים הן זמניות ומקומיות. מחקרים הראו כי שתי זריקות dsRNA בטן וזריקות dsRNA בית חזה בצורה יעילה לדכא את ביטוי גן המטרה בתאי גוף שומן בבטן של חרקים 9,10. DsRNA מוזרק לתוך חללי בטן ובית החזה ותאי שומן בגוף הם מסוגל לקחת את dsRNA מhemolymph שבו התאים הם רחצו 10. עם זאת, לא יכולים להיות ממוקדים הגנים באיברים אחרים, כגון השחלות ומוח, או על ידיזריקות בטן או בית החזה. על מנת למקד את גנים במוח דבורת דבש, הזרקת המוח של dsRNA יש גם ביצע, אשר למעשה משפיע על ביטוי גני היעד באזורים במוח מקומי 11. כאן, אנו לתעד הזרקת dsRNA בטן שהיא נפוצה יותר בדבורי דבש למבוגרים בלבד.

RNAi כבר משמש בעיקר כדי למקד את גן יחיד וכבר כלי רב עוצמה כדי לחשוף את תפקוד הגן. עם זאת, כל גן אינו מבודד מאחרים, הוא ברשתות רגולציה מורכבות. מפתח להבנת תהליך ביולוגי הוא לנתח כיצד גנים לתקשר אחד עם השני, שדורש מניפולציות בו זמניות של מספר רב של גנים ולא במציאת גן יחידה. בשורות תאי יונקים, מדענים הצליחו בגנים של שניים או שלושה בו זמנית על ידי שימוש בעיכוב אספקת מערכות 12 או עיצובים חדים רב microRNA (מירנה) 13. אבל בחרקים, knockdowns גנים מרובים עדיין לא נבדק. כאן, אנו presenאסטרטגיות שונות להזרקת t אשר יכול להשיג מציאה גן כפולה. אנחנו למקד שני גנים: vitellogenin (טוב מאוד) אשר מקודד חלבון מקדים חלמון, וultraspiracle (USP) אשר מקודד קולט משוער להורמון נעורים (JH) ועשויה לשמש כגורם שעתוק מתווך תגובות לJH 14 בדבורי דבש. VG וJH לווסת את זה בלולאת משוב 15 ומעורבים בדבש דבורים התנהגותי בתקנה 9. באמצעות מציאה הגן הכפולה, אנחנו להפריע גם מסלולי JH VG ו, ולגלות כיצד הם משפיעים על התנהגות במשותף דבש דבורים ופיזיולוגיה ואיך VG, USP וJH אינטראקציה 9.

בחוש הטעם הוא מנבא התנהגות לדבורת דבש התנהגות חברתית 16. במונחים של פיתוח, דבורים התנהגותיות קן עם בחוש טעם גבוה התנהגותית מהירה הבוגר, ובדרך כלל מספוא השלב מוקדם בחיים ומעדיפים לאסוף אבקה 16,17. למרות מ 'לתקנותechanisms העומד בבסיס תפיסה התעוררה אצלם עדיין אינו ברור, מחקרים הראו כי תפיסה התעוררה אצלם קשורה לחילוף החומרים פנימיים אנרגיה 9, פרשה הורמונלית 18,19 וbiogenetic אמין מסלולי 20. שניהם VG וJH הם רגולטורים הורמונליים חשובים תפיסה 7,21 ויסות התעוררה אצלם. במעבדה, וריאציה של תפיסה התעוררה אצלם בדבורי דבש יכולה להיות מוערכת על ידי בדיקת תגובת הארכה חוטם (PER) לסוכרוז פתרונות שונים. כל דבורה היא נבדק על ידי נגיעה גם האנטנות שלה עם טיפה של מים ואחריו סדרה עולה ריכוז של 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30% סוכרוז. תגובה חיובית יצוין אם דבורה משתרעת במלוא חוטמה, כאשר טיפה של מים או סוכרוז היא נגעה לכל אנטנה. בהתבסס על המספר של תגובות חיוביות לפתרונים, ניתן לקבוע את רמת בחוש טעמו של כל אדם 16. עם זאת, היישום של PER אינו מוגבל למדידה גרםתפיסת ustatory. PER הוא גם שיטה יעילה כדי לבחון את המצב מטבולי של דבורים כגון שובע לעומת רעב. את הדבורים בתגובה חזק יותר לסוכרוז הם רעבים יותר באופן כללי (וואנג וAmdam, נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, הפרדיגמה לכל יכולה לשמש גם בלמידה ובזיכרון אסוציאטיביים בדבורי דבש. במקרה זה דבורים יוכשרו לשייך את הנוכחות של המים סוכרוז עם ריח. כאשר הדבורים ללמוד עמותה, רק הנוכחות של הריח יכולה לעורר תגובה חיובית חוטם בלי לתגמל אותם עם סוכרוז 22,23. בסרטון הזה, אנו מראים כיצד לבצע PER להעריך בחוש טעם אשר כבר מחובר עם מציאה כפולה VG וUSP במחקר קודם 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חלק 1: מציאה גן כפולה RNAi בתיווך

1. הסינתזה dsRNA

  1. פריימרים עיצוב של dsRNAs מיקוד VG, USP וחלבון בקרה גנטי קידוד ירוק הקרינה (GFP) שהוא לא בדבש דבורי הגנום: Primers תוכננו באמצעות תוכנה החופשית באינטרנט Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) .
  2. סינתזת dsRNA לVG, USP ו-GFP: להשתמש במערכת RiboMax T7-RNA ייצור מPromega לשעתוק במבחנה.
  3. טיהור dsRNA:
    1. Denaturation וrenaturation: חום dsRNA עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולתת לו להתקרר בטמפרטורת חדר במשך שעה 1.
    2. טיפול אני DNase: להוסיף 1 μl DNase אני לכל תגובת dsRNA ולערבב אותם על ידי מצליף את הצינורות. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C.
    3. הוסף מי nuclease μl 150 ו750 Trizol μl - LS לכל תגובה, ולערבב בעדינות אותם על ידי inverting הצינור. דגירה הדגימות למשך 5 דקות בשעה 30 ° C.
    4. הוסף 200 כלורופורם μl לכל דגימה. מערבבים נמרצות במשך 20 שניות. צנטריפוגה הדגימות במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.
    5. מעבירים את שלב supernatant לצינור אחד חדש ולהוסיף 500 אלכוהול איזופרופיל μl לתוך צינור אחד. לערבב אותם על ידי צינור היפוך. דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב -20 ° C. צנטריפוגה אותו למשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.
    6. הסר את supernatant ולהשתמש 1,000 75% אתנול לμl לשטוף את הכדור. לאחר centrifuging הצינור במשך 5 דקות ב 7500 XG ב 4 מעלות צלזיוס, אוויר יבש גלולה dsRNA, ולהשתמש במים ללא nuclease לפזר את גלולה. על מנת להבטיח את יעילותו של הגן למטה רגולציה, ריכוז dsRNA צריך להיות בסביבות 9 -10 מיקרוגרם / μl.

2. הזרקת בטן dsRNA

למציאת גן כפולה, יש שתי אסטרטגיות: 1) זריקה אחת: dsRNA שילוב של שני גנים וinjeCT התערובת, 2) שני ימי הזרקה: להזריק dsRNA הראשונה מיקוד גן אחד ביום הראשון, ולהזריק לתוך dsRNA השני את אותן הדבורים ביום השני.

  1. צינה שזה עתה יצאה דבורים במקרר 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות. כאשר הדבורים הם משותקים, הר דבורים 3-4 במקביל על צלחות פטרי מלאות בשעווה מוצקה עם סיכות חרקים חצו בין הבטן וthoraces.
  2. לצנן את הדבורים שוב ב4 ° C מקרר. ודא שהדבורים הם נייחים לגמרי. זה לוקח בערך 1-2 דקות. הדבורים צריכים להיראות רפויים. אם הדבורים הפכו מסולסלים או מעוותת, זה אומר שהם הקפיאו יותר מדי זמן שיש להימנע. מצמרר יותר מדי גורם לתמותה גבוהה, אבל חוסר תנועה מוחלטת היא חשובה כמו כל תנועה מגבירה את גודל הפצע והתמותה.
  3. לשים 30 G פנויה מחט (BD) במזרק מייקר המילטון. קח 3 dsRNA μl ולוודא שאין בועת אוויר במזרק. המחט מוחדרת לצד של הבטן, כדי למנוע Damaגינג איברים פנימיים. לחץ על בוכנת המזרק באיטיות כדי לאפשר dsRNA להיקלט. מאז dsRNA הוא צמיג מאוד, זה לוקח 2-3 שניות להיות מגורש לחלוטין מהמזרק. לאחר הלחיצה למטה לחלוטין את הבוכנה, להשאיר את המחט בפצע עבור 4-5 שניות. שים לב לדבורים במשך 3-5 שניות לאחר זריקות. אם hemolymph הדלפות רביב מהפצע, לבטל את הדבורה.
  4. השתמש בצבעים שונים כדי לסמן thoraces המתאים לטיפולים שונים. בשלב זה, אם הייתה בשימוש באסטרטגית הזריקה אחת, ניתן להציב בחזרה את הדבורים למושבה לאחר תצפית 1 שעה. עם זאת, אם נעשה שימוש באסטרטגית ההזרקה של יומיים, לאחר שהזריק dsRNA הראשון, הדבורים צריכים להיות ממוקמים בכלוב רשת גליל עם דבש סיפקה בצד ולהיות כל הזמן באינקובטור ב 34 ° C ו 80% לחות .
  5. ביום השני, בצע את השלבים 2.2 ו 2.3 לצנן את הדבורים בכלובי הרשת ולעלות אותם על צלחות שעווה. לבצע זריקות עם dsRNA השנייה כפי שהוא descriמיטה בשלב 2.4.
  6. תן לדבורים להחלים בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 ולהציג אותם למושבה.

הערה: ניתן לאתר השפעות על ידי מציאה כמותי RT-PCR (qRT-PCR) ומערבי סופג. באופן כללי, יעילות מציאה משתנה ותלויה בגורמים רבים. במחקר שלנו, ניתן לאתר במציאת הגן הכפולה 7 ימים לאחר זריקות בודדות וזריקות של ימים.

חלק 2: תגובת assay הארכת החוטם (PER)

1. איסוף דבורים מהכוורת

ביום 6 לאחר הזריקות, לאסוף דבורים שטופלו מהמושבה ללא שימוש מעשן. איסוף דבורים בכלובי צילינדר רשת מתכת. שמור על 3 דבורים בכל כלוב.

2. דבורי הרכבת PER

לצנן את הדבורים על 4 מעלות צלזיוס עד שהם משותקים לחלוטין. הר דבורה כל אחד בצורה אנכית לתוך צינור פלסטיק שתוכנן במיוחד לPER. שמור על הבטן בתוך הצינור על ידי מנצליםשתי חתיכות קטנות של קלטת גרם, ולשמור את הראש המבצבץ של הצינור. לשים את הצינורות על מדף עם שתי שורות עמודי פלסטיק קטנים, ולהקצות לכל צינור (דבורה) עם מספר תעודת זהות. ואז לשים את הדבורים שטופלו על המדפים לתוך אינקובטור (34 מעלות צלזיוס ולחות% 80) ולשמור אותם בחממה במשך שעה 2.

3. הכנת סדרה של פתרונות מים סוכרוז

הכן 0%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ופתרונות מים סוכרוז 30% ולטעון את פתרונות למזרקים עם מחטי G 15-20.

4. PER Assay

לגעת באנטנה של הדבורה עם טיפה של פתרון 0% (מים) ואחריו 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% ופתרונות מים סוכרוז 30%. לבדוק את כל הדבורים עם מים הראשון ולאפשר משמש לפחות שתי דקות בפרק הזמן שבין כל פתרון. לכן, בדרך כלל יש לנו לפחות 20 דבורים לכל ניסוי. אם דבורה משתרעת במלוא חוטמה, תגובה חיובית נספר.

5.ניהול נתונים

לסכם את התגובות החיוביות הכולל עבור כל אחד ואחד לציון התגובה התעורר אצלם (GRS). בצע ניתוח סטטיסטי מתאים על הנתונים.

חלק 3. אימות מציאה גן

גופי שומן הם גזורים מקבוצה נוספת של דבורים שטופלו ישנים 7 ימים. הליך Trizol סטנדרטי משמש להפקת RNA, אשר מלווה DNase טיפול אני 24. VG וביטוי גני USP מנותח על ידי qRT-PCR. אקטין שני שלבים משמש כגן התייחסות מאז יש לו ביטויים יציבים ברקמות שונות של דבורי דבש. primers PCR בזמן אמת פורסם לVG וUSP גן משמש בניסוי הזה 24. הנתונים נותחו באמצעות שיטת דלתא דלתא-CT 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שתי יום הזרקת אסטרטגיות שניהם ההזרקה חד והקטינו VG (כיוון אחד ANOVA, p <0.001) (איור 2 א) וUSP (כיוון אחד ANOVA, p <0.001) (איור 2) באופן משמעותי את רמות תמליל בדבורי דבש שישה ימים לאחר שהוזרק dsRNA. דיכוי תמליל USP באמצעות זריקה אחת עם תערובת dsRNA וההזרקה של יומיים עם VG הראשון וUSP השני (טוב מאוד / USP) היה נמוך באופן משמעותי מההזרקה של יומיים עם USP הראשון והשני VG (USP / VG) (הודעה ניתוח נתונים, תערובת עמ 'לעומת USP / VG = 0.013, עמ' VG / USP לעומת USP / VG = 0.019).

GRS במציאה הכפול הדבורים היה גבוה באופן משמעותי מדבורי בקרת GFP (סטודנט T בדיקה, p = 0.0496) (איור 3).

= עבור "jove_content": לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. תרשים זרימה של התערבות RNA (RNAi) / תגובת חוטם הרחב (PER) assay. ארבע קבוצות של 50 דבורים יצאו זה עתה הוזרק פעמיים תקועים RNA (dsRNA) של vitellogenin (טוב מאוד) וultraspiracle (USP) על ידי שימוש באסטרטגיות שונות או שילוב עם dsRNA של חלבון פלואורסצנטי גן ירוק (GFP), שאינו קיימות בגנום דבורת הדבש. הדבורים הונחו חזרה לכוורת לאחר הזריקות, ונאספו לאחר 6 ימים. שש עשרה דבורים לכל קבוצה נאספו לאימות מציאה גן באמצעות PCR בזמן אמת, ושלשים לכל קבוצה היו להארכת תגובת חוטם (PER) assay. "ה-GFP dsRNA 'מציין את הדבורים מוזרקים עם GFP dsRNA;' VG + תערובת USP 'מציינת את הדבורים בjected עם VG ותערובת dsRNA USP; 'VG / USP' מציין את הדבורים שהוזרקו עם VG dsRNA ביום הראשון, ולאחר מכן הזריקו dsRNA USP ביום השני; 'USP / VG' מציין את הדבורים שהוזרקו עם USP dsRNA על ביום הראשון, והזריק VG dsRNA ביום השני.

איור 2
איור 2. אימות מציאה גן כפולה על ידי שימוש בזמן אמת PCR. התחבר שינה ערך יחסי mRNA (ממוצע ± SEM) בגוף של שומן בבטן של הדבורים שטופלו. הערך היחסי mRNA היה מחושב על ידי שימוש בשיטת CT-דלתא דלתא. () ביטוי VG 6 ימים לאחר זריקות dsRNA. את תמלילי VG היו באופן משמעותי כלפי מטה מוסדרים על ידי שלושה k הכפול גישות nockdown (כיוון אחד ANOVA, p <0.001). (ב ') ביטוי Usp 6 ימים לאחר זריקות dsRNA. את תמלילי USP הופחתו באופן משמעותי על ידי שלוש גישות מציאה כפולות (כיוון אחד ANOVA, p <0.001). עם זאת, ביטוי USP בדבורים הוזרקו תערובת dsRNA וVG / USP היה נמוך בהרבה מזה שבדבורים שהוזרקו עם USP / VG (פוסט הוק ניתוח, עמ 'תערובת לעומת USP / VG = 0.013, עמ' VG / USP לעומת USP / VG = 0.019), המציין כי VG עשוי להיות רגולטור עיקרי בלולאת הרגולציה VG וJH. "RQ" מציין רמת כימות היחסית של תעתיקי גן המטרה. האותיות השונות מעל הסורגים לציין הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול.

ig3.jpg "/>
איור 3. ציון התשובה התעורר אצלם (GRS) על ידי שימוש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay. הדבורים שהוזרקו VG ותערובת dsRNA USP היה GRS גבוה מפקדי GFP, המציין שהם היו רגישים יותר לסוכרוז. האותיות השונות מעל הסורגים לציין הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול (סטודנט T בדיקה, p = 0.0496).

איור 4
איור 4. רשתות גנים רגולטוריים אפשריות מתגלות על ידי שימוש בגישת VG ומציאה כפולה USP. הורמון נעורים (JH) מיוצר במוח דבורת הדבש ומופרש לhemolymph. Vitellogenin (VG) הוא מבשר חלבון חלמון מיוצר על ידי תאי שומן בגוף. VG וJH נמצא בלולאת משוב ויסות חילוף החומרים Physiology, בחוש טעם, וגיל בעת תחילתו של חיפוש אחר מזון וליקוט העדפה של דבורי דבש. מחקרים מראים כי ultraspiracle (USP) הוא קולטן המשוערת לJH ועשויה לשמש כגורם שעתוק. מציאה הכפולה שלנו של VG וUSP חשפה VG ממלא תפקידים מרכזיים ביחסים בין VG, USP וJH. 1. מצאנו מציאה כפולה של VG וUSP גרם לעלייה גדולה יותר בJH מאשר מציאה אחת VG, ומציאה אחת USP לא לגרום לכל שינוי בJH. זה מצביע על כך שמעכב את ייצור VG JH לא רק, אבל מעכב תגובת משוב של JH למציאת USP (). בknockdowns הכפול, העלייה הדרמטית של תוצאות ייצור JH מעיכוב מופחת מVG נגרמת על ידי מציאה VG ותגובה מפצה לתמרת JH מופחתת נגרמת על ידי מציאה USP (ב '). 2. מצאנו USPשפע תמליל היה יותר הופחת ב USP dsRNA כאשר VG היה בעיקר או בו זמנית downregulated, דבר המצביע VG מדכא את הרגישות של USP mRNAto dsRNA שלה. איך יכול להיות מעורב בVG התערבות RNA (RNAi)? VG מסדיר דבש דבורים חיסונית וההגנה RNAi הוא חלק ממערכת החיסון מולדת אנטי. המחקר הקודם שלנו מראה argonaute 3 (GB19389, piwi), מרכיב חשוב של RNA-Induced השתקה מורכב (RISC), הוא אחד של גני המועמדים המשפיעים על התנהגות חברתית דבורת דבש (בחוש טעם, גיל בעת תחילת חיפוש אחר מזון וליקוט העדפה), שהוא נשלט על ידי מודול VG / JH. לכן, אפשרות אחת היא שVG עלול לדכא את חלבוני argonaute המשפיעים על הפעילות של RISC (). כאשר VG הוא downregulated, USP dsRNA הוא מסוגל להשפיל mRNA USP (ב '). 3 בצורה יעילה יותר. מחקר מציאה הכפול גם מגלה כי USP עושהלא לתווך השפעה מעכבת של JH בייצור VG בשומן בגוף, כי לא מציאה USP אחת משפיעה שפע תמליל VG, ולא כפול VG ומציאת USP גורם להפחתה נוספת של תמלילי VG. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המחקר שלנו הוא המאמץ הראשון לדפוק בו זמנית במורד שני גנים בחרקים בוגרים. התוצאות שלנו מראות כי שתי האסטרטגיות של dsRNA זריקות (זריקה אחת וזריקה של יומיים) הן יעילות לדיכוי הגן הכפול, והשתקת גנים בו זמנית של VG וUSP ניתן לבדוק 6 ימים לאחר הזריקות לתוך dsRNA דבורים 8,9. עם זאת, יעילות מציאה הגן משתנה במינים חרקים שונים בהתאם לרמת תעתיק של גן המטרה, שיעורי מחזור החלבון ויעילות ספיגה dsRNA על ידי תאים או איברים. בנוסף, ההשפעה של RNAi היא תלויה במינון. מצאנו דבורה שזה עתה הגיח גם יכל לקבל 4 dsRNA μl, אבל התמותה מוגברת במהירות אם יותר מ 4 dsRNA μl הייתה מוזרקת. לכן, אסטרטגית ההזרקה של יומיים יכולה להיות מתאימה יותר מאשר זריקה אחת לניסוי אשר דורש סכום גבוה יותר של עוצמת זריקה.

הנה, מציאה הגן הכפולה 9

לדוגמא VG וJH נמצא בלולאת משוב ויסות דבש דבורי פיזיולוגיה 9 והתבגרות התנהגותי 26,27. מחקרים קודמים הראו שמציאת גן VG יכולה להגדיל את רמת JH בדבורי דבש 28, ואילו יישום מקומי של JH יכול להפחית VG ביטוי 29. בנוסף, המחקרים הראו USP הוא קולטן המשוערת לJH, ועשויים לתווך תגובות לJH כגורם שעתוק 14,30. עם זאת, איך VG מודולציה JH כייל והאם USP מעורב בוויסות של VG ידי JH עדיין הם הבינו היטב. שימוש בגישת מציאה הכפולה, שגילינו גומלין מפורט בין VG, USP וJH ( VG משחק תפקיד מרכזי בקרב VG, USP וJH. רמה גבוהה של VG מעכבת לא רק JH ייצור 15, אבל מעכבת תגובת משוב שיטתית למציאת USP (איור 4 א). בVG ודבורי מציאה כפול USP, ייצור JH הוגדל יותר מזה 9 בknockdowns בודד VG. הסבר אפשרי הוא שהגידול הדרמטי של JH בתוצאות knockdowns כפולים מירידה משמעותית בהשפעה השלילית של VG בJH נגרמים על ידי מציאה VG ותגובה מפצה לתמרת JH מופחתת נגרמת על ידי מציאה USP (איור 4). שנית, מציאה של VG הראשון ושנייה או מציאה סימולטני USP של שניהם ירידה של יותר נגרם USP ממה שמציאה אחת של USP עשתה. זה אולי מצביע על כך שVG מעכב את הרגישות של USP mRNAto DS שלהRNA. תוצאה זו היא ראשונה לקשר VG עם תהליכי RNAi. VG מעורב בהגנה חיסונית בדבורי דבש 31 וRNAi הוא אחת מני רבים מערכות אנטי 32 באורגניזמים אוקריוטים. מחקרים הראו כי התהליך כרוך RNAi חלבוני argonaute הנשמרים לאורך אאוקריוטים 33. מעניין לציין, שמצאנו בעבר כי argonaute 3 (GB19389, piwi) הוא אחד של גני המועמדים המסדירים את ההתנהגות חברתית דבורת דבש שבו מודול VG / JH ממלא תפקידים מרכזיים 34. לכן, הסבר חלופי הוא שVG מדכא פונקציות של חלבוני argonaute משפיעים השפלה mRNA (איור 4 א). כאשר VG הוא downregulated, argonautes באופן פעיל יותר לתרום להידרדרות mRNA USP נגרמת על ידי dsRNA (איור 4). לבסוף, מצאנו שפע תמליל VG לא השתנה על ידי מציאה USP, והוא הופחת על ידי מציאה כפולה VG וUSP בדואר ברמה דומה לזו שעל ידי מציאה אחד VG. תוצאות אלו מצביעות על כך שUSP אינו מעורב בהשפעה הבולמת של JH בVG. בסך הכל, מציאה הגן הכפולה ככל הנראה היא גישה רב עוצמה כדי לעזור לנו להבין את הרגולציה ברשת גני פרטים.

PER הוא assay סטנדרטי למדידת בחוש טעם בדבורי דבש, אשר שמש כסמן להתפתחות של דבורת דבש התנהגות החברתית 35. דבורים עם רגישות גבוהה לסוכר בדרך כלל מתחילים בשלב מוקדם בחיים חיפוש אחרים מזון ומעדיפים לאסוף אבקה. בחוש טעם גם יכול להיבדק לניבוי השפעת הטיפול בהתנהגויות חברתיות לפני כל מחקרי התנהגות בקנה מידה גדולים אחרים שבוצעו. בנוסף, יש לנו הראינו כי בחוש טעם הוא מתואם עם המדינה 9 לכן חילוף חומרים פנימי, לכל יכול להיות מנוצל כדי לזהות שובע ורמות רעב. יתר על כן, לזיווג עם תנאי ריח הוא מועסק ללימוד למידהוזיכרון בדבורי דבש. באופן קולקטיבי, לכל assay היא טכניקה שימושית מאוד לחקר התנהגות דבורת דבש ופיזיולוגיה מטבולית. עם זאת, לכל רגיש לטיפול בשיטות 36. לדוגמה, דבורים שהיו מורדמים על ידי מצמרר או CO 2 היו קשובים יותר לסוכרוז מפקדים 36. PER גם משתנה במהלך היום, והוא רגיש לתנאים ולחץ סביבתיים. לכן, חשוב מאוד לשמור על הסביבה והנהלים עקביים במהלך הניסוי. באופן כללי, שנסיים PER בבוקר ולבצע את אותו לוח הזמנים בימים הבאים. בדרך כלל אנחנו מתחילים לאסוף דבורים בשעתי הבוקר מוקדמים בשעת 8:00 בבוקר, וזה לוקח 3 שעות להתכונן לPER. אם צרכי לעמוד כדי להתבצע על פני כמה ימים, חשוב לסיים אותו בתוך פרק זמן קצר במקרה של השינויים בסביבה. PER צריך להילקח בקבוצות וכל קבוצה צריכה לכלול יותר מ -20 דבורים בגלל מרווח של לפחות 2 דקות צריך להיות כל הזמן בין concentrati שונהתוספות של פתרונות סוכרוז. שעשינו 75-100 דבורים לכל קבוצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לארין Fennern לסיוע לניסוי. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר של נורבגיה (180,504, 185,306 ו191,699), קרן הצדקה PEW, ומכון הלאומי להזדקנות (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Tags

Neuroscience גיליון 77 גנטיקה התנהגות נוירוביולוגיה ביולוגיה מולקולרית כימיה ביוכימיה ביולוגיה (כללי) גנטיקה (בעלי חיים וצמחים) ביולוגיה בעלי החיים התערבות RNA RNAi RNA גדילים הכפול dsRNA מציאה גן כפולה גן vitellogenin , Ultraspiracle גן, חלבון vitellogenin VG חלבון ultraspiracle USP חלבון פלואורסצנטי ירוק GFP בחוש טעם בתגובת ארכה חוטם לכל דבורי דבש, מודל חיה assay
מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter