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Neuroscience

मधु मक्खियों में आरएनएआई की मध्यस्थता डबल जीन मारकर गिरा दिया और स्वाद बोध मापन ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक साथ मधु मक्खियों में दो जीन (डबल जीन पछाड़ना) को दबाने कि दो रणनीतियों का वर्णन है. तो फिर हम मधु मक्खी स्वाद धारणा पर डबल जीन पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख का उपयोग कैसे प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

इस वीडियो डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) इंजेक्शन का उपयोग कर मधु मक्खियों में एक साथ दो जीन downregulate जो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) के उपन्यास तकनीक को दर्शाता है. यह भी स्वाद धारणा को मापने के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.

आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति downregulating एक प्रभावी तकनीक है. इस तकनीक को आम तौर पर एक जीन में गड़बड़ी के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन यह बातचीत और जीन के बीच संयुक्त प्रभाव का पता लगाने के लिए सीमाएँ हैं. इस वीडियो के पहले भाग में, हम एक साथ दो जीन (डबल जीन पछाड़ना कहा जाता है) नीचे दस्तक करने के लिए दो रणनीतियों उपस्थित थे. हम दोनों रणनीतियों को प्रभावी ढंग से एक नियामक प्रतिक्रिया पाश में हैं जो दो जीन, vitellogenin (वीजी) और ultraspiracle (खासियत), को दबाने में सक्षम हैं दिखा. इस दोहरे जीन पछाड़ना दृष्टिकोण जीन के बीच अंतर्संबंधों टुकड़े करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आसानी से लागू किया जा सकता हैविभिन्न कीट प्रजातियों.

इस वीडियो के दूसरे भाग डबल जीन पछाड़ना के इलाज के बाद मधु मक्खियों में सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख का एक प्रदर्शन है. प्रति परख मधु मक्खियों, एक मधु मक्खी के व्यवहार परिपक्वता है कि कितनी तेजी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है जिसमें स्वाद धारणा को मापने के लिए एक मानक परीक्षण है. घोंसला मधुमक्खियों के ग्रेटर स्वाद धारणा अक्सर पराग में विशेषज्ञता foraging और foraging की शुरुआत में एक पहले की उम्र के साथ जुड़ा हुआ है, जो वृद्धि हुई व्यवहार के विकास को दर्शाता है. इसके अलावा, प्रति परख मधु मक्खियों में तुष्टि या भूख की चयापचय राज्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है. अंत में, परख प्रति मधुमक्खियों भी व्यापक रूप से मधु मक्खियों में सीखने और स्मृति के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है कंडीशनिंग के लिए अलग गंध उत्तेजनाओं बाँधना के साथ संयुक्त.

Introduction

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) यूकेरियोटिक जीवों की एक विस्तृत विविधता में पाया जाता है जो आरएनए आधारित बाद ट्रांसक्रिप्शनल जीन मुंह बंद है. आरएनएआई की प्रक्रिया अंतर्जात या exogenous डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) व्यापारियों से शुरू हो रहा है. dsRNA बांध और छोटे टुकड़े (20-25 बीपी) को dsRNA cleaves जो ribonuclease प्रोटीन पासा खेलनेवाला सक्रिय. फिर dsRNA गाइड के छोटे टुकड़े आर्गोनॉट प्रोटीन से पूरक mRNAs की एक पहचान है और दरार, आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (आरआईएससी) 1 का एक उत्प्रेरक घटक. स्तनधारियों में, 30 NT के तुलना में अब dsRNAs, शाही सेना टेप 2 की अविशिष्ट गिरावट की ओर जाता है जो एक antiviral प्रतिक्रिया (इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया, IFN) को सक्रिय करें. हालांकि, लंबे dsRNAs इस IFN 3 की कमी के बाद से वहाँ कीड़े में प्रभावी और विशिष्ट साबित किया है.

लांग dsRNAs विभिन्न कीट प्रजातियों में लक्ष्य जीन के डाउनरेगुलेशन के लिए इस्तेमाल किया गया है. मधुमक्खियां pion में से एक हैंEER कीट जीवों में जो विकास और व्यवहार में कई महत्वपूर्ण जीनों के कार्यों dsRNA 4,5 का उपयोग करके खुलासा किया गया है. कई dsRNA प्रसव के तरीके मधु मक्खियों में प्रदर्शन किया गया है: dsRNA इंजेक्शन मधु मक्खी भ्रूण 4 और वयस्क मधुमक्खियों 7,8 में जीन पछाड़ना के लिए एक प्रभावी तरीका है, जबकि dsRNA खिला कुशलता, मधु मक्खी लार्वा 6 में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति downregulates.

कीड़ों के लिए dsRNA लगाने से प्रदर्शित जीन पछाड़ना प्रभाव क्षणिक और स्थानीय हैं. अध्ययन पेट dsRNA इंजेक्शन और वक्ष dsRNA इंजेक्शन दोनों को प्रभावी ढंग से कीड़े 9,10 के पेट की चर्बी शरीर की कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को दबाने दिखाया है. DsRNA कोशिकाओं 10 स्नान कर रहे हैं जहां hemolymph से dsRNA लेने के लिए सक्षम हैं, पेट और वक्ष cavities और वसा शरीर की कोशिकाओं में इंजेक्ट किया जाता है. हालांकि, इस तरह के अंडाशय और दिमाग के रूप में अन्य अंगों में जीन या तो द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकताउदर या वक्ष इंजेक्शन. मधु मक्खी के मस्तिष्क में जीन को लक्षित करने के लिए, dsRNA के मस्तिष्क इंजेक्शन भी प्रभावी ढंग से स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों के 11 में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है, जो प्रदर्शन किया गया है. यहाँ, हम केवल वयस्क मधु मक्खियों में अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया है, जो पेट dsRNA इंजेक्शन दस्तावेज़.

आरएनएआई मुख्य रूप से एक जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और जीन समारोह प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है. हालांकि, किसी भी जीन दूसरों से अलग नहीं है, यह जटिल विनियामक नेटवर्क में है. एक जैविक प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण जीन कई जीनों के एक साथ जोड़तोड़ के बजाय एक ही जीन पछाड़ना की आवश्यकता है, जो एक दूसरे के साथ बातचीत कैसे काटना है. स्तनधारी सेल लाइनों में वैज्ञानिकों वितरण प्रणाली 12 या बहु microRNA (miRNA) बाल के लिये कांटा डिजाइन 13 का उपयोग करते हुए एक साथ बाधा दो या तीन जीनों में सफल रहा है. लेकिन कीड़ों में, कई जीन knockdowns अभी भी untested हैं. यहाँ, हम presenएक डबल जीन पछाड़ना प्राप्त कर सकते हैं जो टी अलग इंजेक्शन रणनीतियों. एक जर्दी प्रोटीन अग्रदूत encodes, और किशोर हार्मोन (जे) के लिए एक ख्यात रिसेप्टर encodes और जो ultraspiracle (खासियत) मधु मक्खियों में जेएच 14 के लिए प्रतिक्रियाओं mediating एक प्रतिलेखन कारक के रूप में सेवा कर सकता है जो vitellogenin (वीजी): हम दो जीन लक्ष्य. वी.जी. और झा एक राय पाश 15 में एक दूसरे को विनियमित करने और मधु मक्खी व्यवहार विनियमन 9 में शामिल रहे हैं. डबल जीन पछाड़ना का उपयोग करना, हम उपद्रव वी.जी. दोनों और झा रास्ते, और वे संयुक्त रूप से मधु मक्खी व्यवहार और शरीर विज्ञान और कैसे वी.जी., खासियत और झा 9 बातचीत को प्रभावित कैसे पता चलता है.

स्वाद धारणा मधु मक्खी सामाजिक व्यवहार 16 के लिए एक व्यवहार कारक है. उच्च स्वाद धारणा के साथ व्यवहार के विकास, घोंसला मधुमक्खियों behaviorally परिपक्व तेजी से, और आमतौर पर प्रारंभिक जीवन में चारे के संदर्भ में और पराग 16,17 एकत्र करने के लिए पसंद करते हैं. हालांकि नियामक मीटरस्वाद धारणा अंतर्निहित echanisms पढ़ाई स्वाद धारणा आंतरिक ऊर्जा metabolisms के 9, हार्मोनल स्राव 18,19 और biogenetic अमाइन 20 रास्ते से जुड़ा हुआ है पता चला है कि, अभी भी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. वी.जी. और झा दोनों नियमन स्वाद धारणा 7,21 महत्वपूर्ण हार्मोन संबंधी नियामकों हैं. प्रयोगशाला में, मधु मक्खियों में स्वाद धारणा के विभिन्नता अलग sucrose के समाधान के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) के परीक्षण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. प्रत्येक मधुमक्खी 0.1 की एक आरोही एकाग्रता श्रृंखला, 0.3, 1, 3, 10, 30% sucrose के द्वारा पीछा पानी की एक छोटी बूंद के साथ उसके एंटीना दोनों छू द्वारा परीक्षण किया जाता है. पानी या सूक्रोज की एक छोटी बूंद प्रत्येक एंटीना को छुआ है जब एक मधुमक्खी पूरी तरह से उसे सूंड फैली अगर सकारात्मक प्रतिक्रिया उल्लेख किया है. समाधान के लिए सकारात्मक प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर, प्रत्येक व्यक्ति के स्वाद धारणा स्तर 16 निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, प्रति के आवेदन जी मापने तक सीमित नहीं हैustatory धारणा. प्रति भी ऐसी तुष्टि बनाम भूख के रूप में मधुमक्खियों के चयापचय राज्य का परीक्षण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है. सुक्रोज के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं के साथ मधुमक्खियों सामान्य में hungrier (वैंग और Amdam, अप्रकाशित डेटा) हैं. इसके अलावा, प्रति प्रतिमान मधु मक्खियों में साहचर्य सीखने और स्मृति में भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में मधुमक्खियों का एक गंध के साथ sucrose पानी की मौजूदगी संबद्ध करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा. मधुमक्खियों संघ जानने के लिए, गंध की केवल उपस्थिति सूक्रोज 22,23 साथ उन्हें पुरस्कृत बिना एक सकारात्मक सूंड प्रतिक्रिया पैदा कर सकते हैं. इस वीडियो में, हम पिछले एक अध्ययन 9 में वी.जी. और खासियत डबल पछाड़ना के साथ जोड़ा गया है, जो स्वाद धारणा का मूल्यांकन करने के प्रति प्रदर्शन करने के लिए दिखा.

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Protocol

भाग 1: आरएनएआई की मध्यस्थता डबल जीन पछाड़ना

1. dsRNA संश्लेषण

  1. वीजी, खासियत और मधु मक्खी जीनोम में नहीं है जो एक नियंत्रण जीन एन्कोडिंग हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) को लक्षित dsRNAs के डिजाइन प्राइमरों: प्राइमरों ऑनलाइन मुफ्त सॉफ्टवेयर Primer3 (का उपयोग कर बनाया गया http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. वीजी, खासियत और GFP के लिए dsRNA संश्लेषण: इन विट्रो प्रतिलेखन में लिए Promega से उपयोग RiboMax T7 शाही सेना उत्पादन प्रणाली.
  3. dsRNA शुद्धि:
    1. विकृतीकरण और renaturation: गर्मी 85 से dsRNA डिग्री सेल्सियस 5 मिनट और यह 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शांत हो जाने के लिए.
    2. DNase मैं उपचार: प्रत्येक dsRNA प्रतिक्रिया में 1 μl DNase मैं जोड़ने और ट्यूब flicking द्वारा उन्हें मिश्रण. 37 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    3. प्रत्येक प्रतिक्रिया में रास, और धीरे निवेश संबंधी निर्णय से उन्हें मिश्रण - 150 μl nuclease मुफ्त पानी और 750 μl TRIzol जोड़ेंट्यूब erting. 30 से कम 5 मिनट के लिए नमूने सेते डिग्री सेल्सियस
    4. प्रत्येक नमूने में 200 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें. 20 सेकंड के लिए सख्ती से मिलाएं. 4 पर 12,000 XG पर 15 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    5. प्रत्येक नया ट्यूब तैरनेवाला चरण स्थानांतरण और प्रत्येक ट्यूब में 500 μl isopropyl शराब जोड़ें. Inverting के ट्यूब से उन्हें मिश्रण. -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते 4 पर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली धोने के लिए 1,000 μl 75% इथेनॉल का उपयोग करें. 4 में 7500 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूब centrifuging के बाद डिग्री सेल्सियस, हवा शुष्क dsRNA गोली, और गोली भंग करने nuclease मुफ्त पानी का उपयोग करें. जीन नीचे विनियमन की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, dsRNA एकाग्रता -10 लगभग 9 ग्राम / μl होना चाहिए.

2. dsRNA पेट इंजेक्शन

डबल जीन पछाड़ना के लिए, दो रणनीतियों रहे हैं: 1) एक इंजेक्शन: दो जीन की मिश्रण dsRNA और injeसीटी मिश्रण, 2) दो दिवसीय इंजेक्शन: पहले दिन एक जीन को लक्षित पहले dsRNA इंजेक्षन, और दूसरे दिन ही मधुमक्खियों में दूसरा dsRNA इंजेक्षन.

  1. सर्द नव 1-2 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में मधुमक्खियों उभरा. मधुमक्खियों स्थिर रहे हैं, उनके पेट और वक्ष स्थल के बीच पार कर कीट पिन के साथ ठोस मोम का पूरा पेट्री डिश पर समानांतर में 3-4 मधुमक्खियों माउंट.
  2. एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में फिर मधुमक्खियों शांत रहो. मधुमक्खियों पूरी तरह से स्थिर हैं सुनिश्चित करें. इसके बारे में 1-2 मिनट लगते हैं. मधुमक्खियों ढीला दिखना चाहिए. मधुमक्खियों कर्ल करवाने या पीला पड़ बन गया है, तो यह है कि वे भी लंबे समय से बचा जाना चाहिए, जो ठंडा कर रहे हैं. द्रुतशीतन बहुत ज्यादा उच्च मृत्यु दर का कारण बनता है, लेकिन किसी भी आंदोलन घाव और मृत्यु दर का आकार बढ़ता ही पूरा स्थिरीकरण महत्वपूर्ण है.
  3. एक हैमिल्टन सूक्ष्म सिरिंज पर एक डिस्पोजेबल 30 जी सुई (बी) रखो. 3 μl dsRNA लो और सिरिंज में कोई हवा बुलबुला है सुनिश्चित करें. सुई दामा से बचने के लिए पेट के एक तरफ करने के लिए डाला जाता हैआंतरिक अंगों ging. DsRNA अवशोषित करने की अनुमति देने के लिए धीरे धीरे सिरिंज सवार दबाएं. DsRNA बहुत चिपचिपा है, यह पूरी तरह से सिरिंज से निष्कासित कर दिया जाएगा करने के लिए 2-3 सेकंड लेता है. पूरी तरह से सवार नीचे धकेलने के बाद, 4-5 सेकंड के लिए घाव में सुई छोड़ दें. इंजेक्शन के बाद 3-5 सेकंड के लिए मधुमक्खियों को ध्यान से देखें. घाव से एक hemolymph छोटी बूंद लीक है, मधुमक्खी त्यागें.
  4. अलग उपचार के लिए इसी उनके वक्ष स्थल चिह्नित करने के लिए अलग अलग रंग का उपयोग करें. एक इंजेक्शन रणनीति का प्रयोग किया गया था, यदि इस बिंदु पर, मधुमक्खियों 1 घंटा अवलोकन के बाद एक कॉलोनी में वापस रखा जा सकता है. दो दिवसीय इंजेक्शन रणनीति का प्रयोग किया गया था हालांकि, अगर पहले dsRNA इंजेक्शन के साथ किया जा रहा है के बाद, मधुमक्खियों ओर आपूर्ति शहद के साथ एक सिलेंडर जाल पिंजरे में रखा जाना चाहिए और 34 पर एक मशीन में रखा जा डिग्री सेल्सियस और 80% आर्द्रता .
  5. दूसरे दिन, जाल पिंजरों में मधुमक्खियों ठंडा और मोम प्लेटों पर उन्हें माउंट करने के लिए कदम 2.2 और 2.3 का पालन करें. यह descri है के रूप में दूसरा dsRNA साथ इंजेक्शन प्रदर्शन करना2.4 चरण में बिस्तर.
  6. मधुमक्खियों के 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ठीक हो और एक कॉलोनी में उन्हें परिचय.

नोट: पछाड़ना प्रभाव मात्रात्मक RT-पीसीआर (QRT-पीसीआर) और पश्चिमी सोख्ता से पता लगाया जा सकता है. सामान्य में, पछाड़ना प्रभावकारिता बदलता है और कई कारकों पर निर्भर करता है. हमारे अध्ययन में, डबल जीन पछाड़ना 7 दिनों एक इंजेक्शन और दो दिवसीय इंजेक्शन के बाद पता लगाया जा सकता है.

भाग 2: सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख

1. छत्ता से मधुमक्खियों का संग्रह

इंजेक्शन के बाद सुबह 6 पर, एक धूम्रपान न करने का उपयोग किए बिना कॉलोनी से इलाज मधुमक्खियों इकट्ठा. धातु जाल सिलेंडर पिंजरों में मधुमक्खियों लीजिए. प्रत्येक पिंजरे में 3 मधुमक्खियों रखें.

2. प्रति के लिए बढ़ते मधुमक्खियों

वे पूरी तरह से स्थिर हैं डिग्री सेल्सियस तक 4 में मधुमक्खियों शांत रहो. विशेष रूप से प्रति के लिए बनाया गया एक प्लास्टिक की ट्यूब में खड़ी प्रत्येक मधुमक्खी माउंट. Usin से ट्यूब के अंदर पेट रखेंछ दो छोटे टेप के टुकड़े, और ट्यूब के बाहर चिपके हुए सिर रखना. छोटे प्लास्टिक के स्तंभों की दो पंक्तियों के साथ एक रैक पर ट्यूब डाल दिया, और एक आईडी नंबर के साथ प्रत्येक ट्यूब (मधुमक्खी) आवंटित. फिर एक मशीन (34 डिग्री सेल्सियस और 80% आर्द्रता) में रैक पर इलाज मधुमक्खियों डाल दिया और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में उन्हें रखने के लिए.

3. सुक्रोज जल समाधान की एक श्रृंखला की तैयारी

0%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% और 30% sucrose के पानी समाधान तैयार है और 15-20 जी सुइयों के साथ सीरिंज में समाधान लोड.

4. परख प्रतिशत

0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% और 30% sucrose के पानी समाधान द्वारा पीछा 0% समाधान (जल) की एक छोटी बूंद के साथ मधुमक्खी का एंटीना स्पर्श करें. पहले पानी के साथ सभी मधुमक्खियों टेस्ट और प्रत्येक समाधान के बीच अंतराल के रूप में कम से कम दो मिनट के लिए किया जाता है की अनुमति देते हैं. इसलिए, हम आम तौर पर हर परीक्षण के लिए कम से कम 20 मधुमक्खियों है. एक मधुमक्खी पूरी तरह से उसे सूंड फैली हुई है, तो एक सकारात्मक प्रतिक्रिया में गिना जाता है.

5.आँकड़ा प्रबंधन

स्वाद प्रतिक्रिया स्कोर (GRS) के लिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए कुल सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को योग. आंकड़ों पर एक उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन.

भाग 3. जीन पछाड़ना सत्यापन

फैट निकायों 7 दिन पुरानी इलाज मधुमक्खियों का एक और सेट से विच्छेदित कर रहे हैं. एक मानक TRIzol प्रक्रिया DNase मैं उपचार 24 से पीछा किया है जो शाही सेना निकासी के लिए प्रयोग किया जाता है. वी.जी. और खासियत जीन अभिव्यक्ति एक दो कदम QRT-पीसीआर. एक्टिन से विश्लेषण किया है कि यह विभिन्न ऊतकों में स्थिर भाव के बाद से एक संदर्भ जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है मधु मक्खियों की. वी.जी. और खासियत जीन के लिए प्रकाशित वास्तविक समय पीसीआर प्राइमरों इस प्रयोग 24 में उपयोग किया जाता है. डाटा डेल्टा डेल्टा सीटी विधि 25 का उपयोग करके विश्लेषण कर रहे हैं.

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Representative Results

एकल इंजेक्शन और दो ​​दिन इंजेक्शन रणनीतियों दोनों काफी मधु मक्खियों में प्रतिलेख के स्तर vg (एक तरह से एनोवा, पी <0.001) (2A चित्रा) और खासियत (एक तरह से एनोवा, पी <0.001) (चित्रा 2B) कम dsRNA के बाद छह दिनों इंजेक्ट किया गया था. dsRNA मिश्रण के साथ एक इंजेक्शन और वी.जी. पहले और खासियत दूसरा (वी.जी. / खासियत) के साथ दो दिवसीय इंजेक्शन का उपयोग करके खासियत प्रतिलेख के दमन खासियत पहले और वी.जी. दूसरा (खासियत / VG) के साथ दो दिवसीय इंजेक्शन की तुलना में काफी कम थी (के बाद अस्थायी विश्लेषण, पी मिश्रण बनाम खासियत / VG = 0.013, पी वी.जी. / खासियत बनाम खासियत / VG = 0.019).

डबल पछाड़ना मधुमक्खियों में GRS GFP नियंत्रण मधुमक्खियों (छात्र टी परीक्षण, पी = 0.0496) (चित्रा 3) की तुलना में काफी अधिक था.


चित्रा 1. शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) / सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख. 50 नव उभरा मधुमक्खियों के चार समूहों में से फ़्लोचार्ट या अलग संयोजन रणनीतियों का उपयोग करके डबल असहाय vitellogenin की शाही सेना (dsRNA) (वीजी) और ultraspiracle (खासियत) के साथ थे इंजेक्शन मधु मक्खी जीनोम में मौजूद नहीं है जो हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) जीन की dsRNA साथ. मधुमक्खियों इंजेक्शन के बाद एक छत्ते को वापस रखा गया था, और 6 दिन बाद एकत्र किए गए थे. समूह के अनुसार सोलह मधुमक्खियों वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके जीन पछाड़ना सत्यापन के लिए एकत्र, और समूह प्रति तीस सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख के लिए गए थे. 'GFP dsRNA' GFP dsRNA इंजेक्शन के साथ मधुमक्खियों को इंगित करता है, 'वी.जी. + खासियत मिश्रण' में मधुमक्खियों का संकेत हैवी.जी. और खासियत dsRNA मिश्रण के साथ खारिज कर दिया, 'वी.जी. / खासियत' तो दूसरे दिन खासियत dsRNA इंजेक्शन के साथ पहले दिन वी.जी. dsRNA इंजेक्शन के साथ मधुमक्खियों, इंगित करता है, 'खासियत / VG' पर खासियत dsRNA इंजेक्शन के साथ मधुमक्खियों को इंगित करता है पहले दिन और दूसरे दिन वी.जी. dsRNA इंजेक्शन के साथ.

चित्रा 2
चित्रा 2. वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके डबल जीन पछाड़ना सत्यापन. इलाज मधुमक्खियों के पेट की चर्बी शरीर में तब्दील mRNA के सापेक्ष मूल्य (± SEM मतलब है) लॉग ऑन करें. mRNA के सापेक्ष मूल्य डेल्टा डेल्टा सीटी विधि का उपयोग कर की गणना की गई. (ए) वी.जी. अभिव्यक्ति 6 दिनों dsRNA इंजेक्शन के बाद. वी.जी. टेप काफी तीन डबल कश्मीर से नीचे विनियमित गया nockdown दृष्टिकोण (एक तरह से एनोवा, पी <0.001). 6 दिनों dsRNA इंजेक्शन के बाद (बी) खासियत अभिव्यक्ति. खासियत टेप काफी तीन डबल पछाड़ना दृष्टिकोण (एक तरह से एनोवा, पी <0.001) से कम हो गई थी. हालांकि, dsRNA मिश्रण और वी.जी. / खासियत इंजेक्शन के साथ मधुमक्खियों में खासियत अभिव्यक्ति खासियत / VG (के बाद अस्थायी विश्लेषण, पी मिश्रण बनाम खासियत / VG = 0.013, पी वी.जी. / खासियत इंजेक्शन के साथ मक्खियों की तुलना में काफी कम था बनाम खासियत / VG = 0.019), VG वी.जी. और झा नियामक पाश में एक प्राथमिक नियामक हो सकता है कि यह दर्शाता है. 'RQ' लक्ष्य जीन टेप के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव स्तर इंगित करता है. सलाखों के ऊपर विभिन्न पत्र उपचार समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं.

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चित्रा 3. सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख का उपयोग करके स्वाद प्रतिक्रिया स्कोर (GRS). वी.जी. और खासियत dsRNA मिश्रण इंजेक्शन के साथ थे जो मधुमक्खियों वे sucrose के लिए अधिक संवेदनशील थे, यह दर्शाता GFP के नियंत्रण से अधिक GRS था. सलाखों के ऊपर विभिन्न पत्र उपचार समूहों (छात्र टी परीक्षण, पी = 0.0496) के बीच महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं.

चित्रा 4
4 चित्रा. संभव नियामक जीन नेटवर्क वी.जी. और खासियत डबल पछाड़ना दृष्टिकोण का उपयोग करके पता चला. किशोर हार्मोन (झा) मधु मक्खी के मस्तिष्क में उत्पादित और hemolymph को स्रावित होता है. Vitellogenin (वी.जी.) शरीर में वसा कोशिकाओं द्वारा निर्मित एक जर्दी प्रोटीन अग्रदूत है. वी.जी. और झा चयापचय Physiol विनियमन एक राय पाश में हैंogy, स्वाद धारणा है, और मधु मक्खियों की वरीयता foraging और foraging की शुरुआत में उम्र. अध्ययन ultraspiracle (खासियत) झा के लिए एक ख्यात रिसेप्टर है और एक प्रतिलेखन कारक के रूप में काम कर सकता है. वी.जी. और खासियत के हमारे डबल पछाड़ना एक वी.जी. एकल पछाड़ना से झारखंड में एक बड़ी वृद्धि के कारण हम वी.जी. और खासियत के दोहरे पछाड़ना पाया. VG वी.जी., खासियत और झा के बीच संबंध. 1 में केंद्रीय भूमिका निभाता है पता चला है, और एक खासियत ही मारकर गिरा दिया गया है झा में कोई बदलाव प्रेरित नहीं था. यह वी.जी. झा उत्पादन रोकता है कि न केवल पता चलता है, लेकिन खासियत पछाड़ना (ए) को झा की एक प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया को रोकता है. डबल knockdowns में, वी.जी. से एक कम निषेध से झा उत्पादन परिणामों की नाटकीय वृद्धि वी.जी. मारकर गिरा दिया और खासियत पछाड़ना (बी). 2 की वजह से एक कम झा पारगमन के लिए एक प्रतिपूरक प्रतिक्रिया की वजह से. हम खासियत पायाVG वी.जी. खासियत mRNAto अपने dsRNA की संवेदनशीलता को दबा सुझाव है, मुख्य रूप से या एक साथ downregulated था जब प्रतिलिपि बहुतायत अधिक खासियत dsRNA से कम हो गया था. कैसे वी.जी. शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) में शामिल किया जा सकता है? वी.जी. मधु मक्खी प्रतिरक्षा रक्षा और आरएनएआई एंटीवायरल सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का एक हिस्सा है नियंत्रित करता है. हमारे पिछले अध्ययन है जो आर्गोनॉट 3 (GB19389, Piwi), आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (आरआईएससी) का एक महत्वपूर्ण घटक, मधु मक्खी सामाजिक व्यवहार (स्वाद धारणा, शुरुआत में उम्र वरीयता foraging और foraging) को प्रभावित उम्मीदवार जीनों में से एक है, से पता चलता है वी.जी. / झा मॉड्यूल द्वारा नियंत्रित किया. इसलिए, एक संभावना वी.जी. आरआईएससी (ए) की गतिविधि को प्रभावित आर्गोनॉट प्रोटीन को दबा सकते हैं. वी.जी. downregulated है, जब खासियत dsRNA अधिक कुशलता खासियत mRNA के (बी). 3 नीचा करने में सक्षम है. हमारे डबल पछाड़ना अध्ययन में यह भी है कि खासियत करता है पता चलता हैन तो एक खासियत पछाड़ना वी.जी. प्रतिलिपि बहुतायत को प्रभावित करता है, और न ही डबल वी.जी. और खासियत पछाड़ना वी.जी. टेप की और कमी का कारण बनता है क्योंकि वसा शरीर में वी.जी. उत्पादन पर झा की निरोधात्मक प्रभाव मध्यस्थता नहीं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

हमारे अध्ययन से एक साथ वयस्क कीड़े में दो जीन नीचे दस्तक करने के लिए पहला प्रयास है. हमारे परिणाम dsRNA इंजेक्शन (एक इंजेक्शन और दो ​​दिवसीय इंजेक्शन) के दो रणनीतियों डबल जीन दमन, और वी.जी. और खासियत के एक साथ जीन मुंह बंद करने के लिए प्रभावी रहे हैं 6 दिनों मधुमक्खियों 8,9 में dsRNA इंजेक्शन के बाद परीक्षण किया जा सकता है. हालांकि, जीन पछाड़ना प्रभावकारिता कोशिकाओं और अंगों द्वारा लक्ष्य जीन, प्रोटीन कारोबार दरों और dsRNA तेज दक्षता की प्रतिलिपि स्तर के आधार पर विभिन्न कीट प्रजातियों में बदलता है. इसके अलावा, आरएनएआई के प्रभाव खुराक निर्भर है. हम एक नव उभरा मधुमक्खी अच्छी तरह से 4 μl dsRNA स्वीकार कर सकता है पाया है, लेकिन अधिक से अधिक 4 μl dsRNA इंजेक्शन था अगर मृत्यु दर में तेजी से वृद्धि हुई है. इसलिए, दो दिवसीय इंजेक्शन रणनीति इंजेक्शन की मात्रा का अधिक राशि की आवश्यकता है जो एक प्रयोग के लिए एक इंजेक्शन की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकता है.

इधर, डबल जीन पछाड़ना 9

उदाहरण के लिए वी.जी. और झा मधु मक्खी फिजियोलॉजी 9 और व्यवहार परिपक्वता 26,27 विनियमन एक राय पाश में हैं. पिछले अध्ययनों झा की सामयिक आवेदन वी.जी. अभिव्यक्ति 29 को कम कर सकते हैं जबकि वी.जी. जीन मारकर गिरा दिया, मधु मक्खियों 28 में झा स्तर को बढ़ा सकते हैं कि पता चला है. इसके अलावा, पढ़ाई खासियत झा के लिए एक ख्यात रिसेप्टर है सुझाव दिया है, और एक प्रतिलेखन कारक 14,30 रूप झा को प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता कर सकते हैं. हालांकि, कैसे वी.जी. झा अनुमापांक modulates और खासियत झा द्वारा वी.जी. के विनियमन में शामिल है कि क्या अभी भी खराब समझ रहे हैं. डबल पछाड़ना दृष्टिकोण का प्रयोग, हम वी.जी., खासियत और झा (बीच में विस्तृत अंतर्संबंधों की खोज की है VG वी.जी., खासियत और झा के बीच में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है सुझाव देते हैं. वी.जी. के उच्च स्तर झा उत्पादन 15 को रोकता है, लेकिन खासियत पछाड़ना (चित्रा -4 ए) के लिए एक व्यवस्थित प्रतिक्रिया की प्रतिक्रिया को रोकता नहीं है. वी.जी. और खासियत डबल पछाड़ना मधुमक्खियों में, झा उत्पादन वी.जी. एकल knockdowns में है कि अधिक से 9 और अधिक बढ़ा दिया गया था. एक संभावित व्याख्या झा पर वी.जी. के नकारात्मक प्रभाव में एक महत्वपूर्ण कमी से डबल knockdowns परिणामों में झा की नाटकीय वृद्धि वी.जी. मारकर गिरा दिया और खासियत पछाड़ना (चित्रा 4 बी) की वजह से एक कम झा पारगमन के लिए एक प्रतिपूरक प्रतिक्रिया के कारण होता है. दूसरे, वी.जी. पहले और खासियत की एक भी पछाड़ना क्या किया से खासियत की वजह से अधिक कमी दोनों की खासियत दूसरे या एक साथ पछाड़ना की पछाड़ना. इस वी.जी. खासियत mRNAto की संवेदनशीलता अपने डी एस रोकता सुझाव है कि हो सकता हैशाही सेना. इस परिणाम आरएनएआई प्रक्रियाओं के साथ वी.जी. लिंक करने के लिए पहली बार है. वी.जी. मधु मक्खियों 31 में प्रतिरक्षा रक्षा में शामिल और आरएनएआई यूकेरियोटिक जीवों में 32 कई एंटीवायरल प्रणालियों में से एक है. अध्ययन आरएनएआई प्रक्रिया Eukaryotes 33 भर में संरक्षित कर रहे हैं जो आर्गोनॉट प्रोटीन शामिल है कि पता चला है. दिलचस्प बात यह है कि हम पहले से आर्गोनॉट 3 (GB19389, Piwi) वी.जी. / झा मॉड्यूल केंद्रीय भूमिकाओं 34 निभाता है जिसमें मधु मक्खी सामाजिक व्यवहार को विनियमित उम्मीदवार जीनों में से एक है कि पाया. इसलिए, एक वैकल्पिक व्याख्या वी.जी. mRNA के क्षरण को प्रभावित आर्गोनॉट प्रोटीन के कार्यों (चित्रा -4 ए) को दबा रहा है. वी.जी. downregulated है, जब अधिक सक्रिय रूप से अपने dsRNA (चित्रा 4 बी) के कारण खासियत mRNA के गिरावट में योगदान argonautes. अंत में, हम वी.जी. प्रतिलिपि बहुतायत खासियत पछाड़ना द्वारा बदला नहीं गया था, और यह वें पर वी.जी. और खासियत डबल पछाड़ना की कमी थीवी.जी. एकल पछाड़ना द्वारा उस रूप में ई समान स्तर. इन परिणामों खासियत वी.जी. पर झा का निषेधात्मक प्रभाव में शामिल नहीं है कि सुझाव. कुल मिलाकर, डबल जीन पछाड़ना जाहिरा तौर पर हमें जानकारी में नियामक जीन नेटवर्क को समझने में मदद करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.

प्रति मधु मक्खी सामाजिक व्यवहार 35 के विकास के लिए एक कारक के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो मधु मक्खियों, में स्वाद धारणा को मापने के लिए एक मानक परख है. चीनी के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ मधुमक्खियों आमतौर पर प्रारंभिक जीवन में foraging शुरू और पराग इकट्ठा करने के लिए पसंद करते हैं. स्वाद धारणा को भी किसी भी अन्य बड़े पैमाने पर व्यवहार के अध्ययन के प्रदर्शन कर रहे हैं इससे पहले सामाजिक व्यवहार पर उपचार के प्रभाव की भविष्यवाणी के लिए परीक्षण किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम तुष्टि और भूख के स्तर की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता प्रति स्वाद धारणा, आंतरिक चयापचय राज्य इसलिए 9 के साथ जोड़ा जाता है कि पता चला है. इसके अलावा, प्रति गंध शर्तों के साथ रखा सीखने का अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैमधु मक्खियों में और स्मृति. सामूहिक रूप से, परख प्रति मधु मक्खी व्यवहार और चयापचय शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी तकनीक है. हालांकि, प्रति तरीकों 36 से निपटने के प्रति संवेदनशील है. उदाहरण के लिए, द्रुतशीतन द्वारा anesthetized या सीओ 2 थे कि मधुमक्खियों नियंत्रण 36 से सुक्रोज के लिए उत्तरदायी थे. भी प्रति दिन के दौरान बदलता रहता है और पर्यावरण की स्थिति और तनाव के प्रति संवेदनशील है. इसलिए, यह पर्यावरण और प्रयोग के दौरान लगातार प्रक्रियाओं को रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. सामान्य तौर पर, हम सुबह में प्रति खत्म करने और बाद के दिनों में एक ही शेड्यूल का पालन करें. हम आमतौर पर 8:00 पर सुबह में मधुमक्खियों का संग्रह शुरू, और यह प्रति के लिए तैयार होने के लिए 3 घंटे लगते हैं. प्रति जरूरतों को कई दिन भर में प्रदर्शन किया जा रहा है, तो यह मामला पर्यावरण परिवर्तन में एक छोटी सी अवधि में इसे खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है. कम से कम 2 मिनट के अंतराल अलग concentrati के बीच रखा जाना है क्योंकि प्रति समूहों में रखा जाना चाहिए और प्रत्येक समूह में 20 से अधिक मधुमक्खियों को शामिल करना चाहिएsucrose के समाधान के ons है. हम समूह के प्रति 75-100 मधुमक्खियों किया है.

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Acknowledgments

लेखकों प्रयोग की सहायता के लिए आयलैंड Fennern धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम नॉर्वे के अनुसंधान परिषद (180504, 185306 और 191699), बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट, और उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान (एनआईए P01 AG22500) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

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References

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मधु मक्खियों में आरएनएआई की मध्यस्थता डबल जीन मारकर गिरा दिया और स्वाद बोध मापन (<em&gt; एपीआई mellifera</em&gt;)
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Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

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