Summary
このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。
Abstract
このビデオでは、二本鎖RNA（dsRNA）注射を用いたミツバチで同時に二つの遺伝子をダウンレギュレートするRNA干渉（RNAi）の新規技術を示しています。また、味覚の知覚を測定するための口先拡張応答（PER）アッセイのプロトコルを提示します。
RNAiによる遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーション有効な技術である。この技術は、通常、単一の遺伝子操作に用いられるが、それは相互作用と遺伝子との接合効果を検出するための限界を有している。このビデオの最初の部分で、我々は、同時に2つの遺伝子を（二重遺伝子ノックダウンと呼ばれる）をノックダウンするための2つの戦略を提示する。我々は両方の戦略が効果的に規制のフィードバックループにある2つの遺伝子、ビテロゲニン（VG）とピラクル（USP）を抑制することができますを示しています。この二重の遺伝子ノックダウンのアプローチは、遺伝子間の相互関係を分析するために使用することができ、容易に適用することができ異なる昆虫種。
このビデオの第二部は、二重遺伝子ノックダウンの治療後のミツバチで口先拡張応答（PER）アッセイのデモンストレーションです。 PERアッセイは、ミツバチ、ミツバチの行動の成熟がどれほど速いの鍵な予測因子であるの味覚の知覚を測定するための標準的なテストです。巣ミツバチの大味覚認識は、多くの場合、花粉の特化を餌と餌の発症に早い年齢に関連付けられて増加した行動の発展を示している。また、PERアッセイはミツバチに飽食か飢餓の代謝状態を識別するために適用することができます。最後に、1アッセイあたりミツバチも広くミツバチの学習と記憶研究のために使用されているエアコンに異なる匂い刺激をペアリングと組み合わせる。
Introduction
RNA干渉（RNAi）は、真核生物の多種多様に発生するRNAベースの転写後遺伝子サイレンシングである。 RNAiのプロセスは、内因性又は外因性の二本鎖RNA（dsRNA）前駆物質によって引き起こされる。 dsRNAは、結合して小さな断片（20〜25塩基対）へのdsRNAを切断するリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化する。 dsRNAのガイドの、小さな断片アルゴノートタンパク質による補完的なmRNAの認識と切断、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）1の触媒成分。哺乳類では、30ヌクレオチドより長いdsRNAはは、RNA転写産物2の非特異的な劣化につながる抗ウイルス応答（インターフェロン応答、IFN）を活性化する。しかし、長いdsRNAは、このIFN 3の不足しているため、昆虫に有効かつ特異的であることが証明されている。
長いdsRNAは、異なる昆虫種の標的遺伝子の下方制御に使用されてきた。ミツバチは、パイオンの一つです発達や行動の多くの重要な遺伝子の機能がdsRNAは4,5を使用することによって明らかにされているEER昆虫生物。いくつかのdsRNAの発送方法はミツバチで行われています：dsRNAをインジェクションはミツバチの胚4と成体ミツバチ7,8の遺伝子ノックダウンのための効果的なアプローチであるのに対し、dsRNAを送り、効率的に、ミツバチの幼虫6に標的遺伝子の発現を下方制御する。
昆虫へのdsRNAを適用することにより、展示遺伝子ノックダウン効果は一過性とローカライズされています。研究では、腹部のdsRNA注射胸部のdsRNA注射の両方を効果的に昆虫9,10の腹部脂肪体細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されている。 dsRNAは、細胞が10を浴びている血リンパからのdsRNAを取ることができている腹部や胸部の空洞や脂肪体細胞内に注入される。しかし、そのような卵巣や脳などの他の臓器、の遺伝子のいずれかが対象とすることはできません腹部や胸部注射。ミツバチの脳内の遺伝子を標的とするためには、dsRNAの脳の注入は効果的局所脳領域11内の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、行われている。ここで、我々は唯一の、より一般的に成人のミツバチで使用されている腹部のdsRNA注入を文書化します。
RNAiは、主に単一遺伝子を標的とするために使用されており、遺伝子の機能を明らかにするための強力なツールとなっている。しかし、任意の遺伝子は他から絶縁されていません、それは複雑な制御ネットワークである。生物学的プロセスを理解するための鍵は、遺伝子が複数の遺伝子の同時操作ではなく、単一の遺伝子ノックダウンを必要とする、どのように相互作用するかを詳細に分析することである。哺乳動物細胞株において、科学者は、送達システム12またはマルチマイクロRNA（miRNAの）ヘアピンのデザイン13を用いて同時に阻害する二、三の遺伝子に成功した。しかし昆虫で、複数の遺伝子ノックダウンはまだ未検証です。ここでは、プレゼンテーション二重の遺伝子ノックダウンを達成することができますトンの異なる注入戦略。卵黄タンパク質前駆体をコードしてビテロゲニン（VG）、及び幼若ホルモン（JH）のため推定受容体をコードし、ミツバチにJH 14への応答を仲介する転写因子として働くことができるピラクル（USP）：我々は2つの遺伝子をターゲットにしています。 VGとJHは、フィードバックループ15でお互いを調節し、ミツバチの行動規制9に関与している。二重の遺伝子ノックダウンを使用して、我乱すVgを両方とJH経路、そして、彼らが共同でミツバチの行動と生理機能とどのようにVG、USPとJHは9対話にどのように影響するかを発見する。
味覚認識はミツバチ社会的行動のための16の行動予測因子である。高い味覚認知と行動の発達、巣のミツバチ行動成熟速く、通常人生の早い段階で飼料の観点と花粉16,17を収集することを好む。ものの規制M味覚認識を根底echanismsはまだ不明で、研究は味覚知覚は内部エネルギー代謝9、ホルモン分泌18,19及び生物遺伝アミンにリンクされていることが示されている20の経路。 VgはとJHの両方が変調味覚認知7,21重要なホルモンのレギュレータです。研究室では、ミツバチで味覚知覚の変化が異なるショ糖溶液に口先拡張応答（PER）をテストすることによって評価することができます。各蜂、0.1、0.3、1、3、10、30％スクロースの上昇濃度系列に続いて、水の液滴と彼女のアンテナの両方に触れることによってテストされる。水またはスクロースの液滴は、各アンテナに触れたときのハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合は正の応答が注目される。ソリューションに対する肯定応答の数に基づいて、各個体の味覚知覚レベルが16を決定することができる。しかし、PERの適用はグラム測定に限定されるものではないustatory認識。 PERはまた、このような飽食対飢餓としてミツバチの代謝状態をテストするための有効な方法である。ショ糖へのより大きな応答とミツバチは、一般的にハングリー（王とAmdam、未発表データ）である。また、PERパラダイムはミツバチに連想学習と記憶にも使用することができます。このケースではミツバチは臭気とショ糖水の存在を関連付けるために訓練されます。ミツバチが関連を学ぶとき、臭気の唯一の存在は、スクロース22,23とそれらを報いることなく、正口先応答を呼び起こすことができます。このビデオでは、我々は以前の研究9でVGとUSPダブルノックダウンで接続された味覚の知覚を評価するために、PERを実行する方法を示しています。
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Protocol
パート1：RNAiによる二重の遺伝子ノックダウン
1。 dsRNAを合成
- VG、USPとミツバチのゲノムに含まれていない緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする制御遺伝子を標的dsRNAをの設計プライマー：プライマーはオンラインフリーソフトウェアPrimer3のを（使用して設計されたhttp://frodo.wi.mit.edu/ ） 。
- VG、USPとGFPのためのdsRNA合成：in vitro転写用プロメガからの使用RiboMax T7 RNAの生産システム。
- dsRNAの精製：
- 変性および再生：85への熱のdsRNAを℃で5分間、それを1時間室温で冷ましてみましょう。
- のDNase I処理：それぞれのdsRNA反応に1μlのDNアーゼIを追加し、チューブをフリックでそれらをミックス。 37℃で15分インキュベート
- 各反応にLS、そして優しくINVでそれらをミックス - 150μlのヌクレアーゼフリー水と750μlのトリゾールを追加チューブerting。 30℃で5分のためのサンプルをインキュベート
- 各サンプルに200μlのクロロホルムを追加します。 20秒間激しく混ぜる。 4℃12,000×gで15分間サンプルを遠心℃に
- 各新しいチューブに上清位相を移し、各チューブに500μlのイソプロピルアルコールを追加します。反転チューブでそれらをミックス。 -20℃で20分間混合物をインキュベート4℃で12,000×gで10分間、それを遠心
- 上清を除去し、ペレットを洗浄するために1,000μlの75％エタノールを使用しています。 C、空気乾燥したdsRNAはペレット4℃で7,500×gで5分間チューブを遠心分離した後、ペレットを溶解するヌクレアーゼフリーの水を使用しています。遺伝子の効能ダウンレギュレーションを確保するためには、dsRNA濃度は9 -10μgの/μlの周りでなければなりません。
2。 dsRNAは腹部注射
1）単回注射：ミックス二つの遺伝子のdsRNAと麟蹄二重遺伝子ノックダウンのために、2つの戦略がありますカラットは、混合物、2）2日間注射：初日に一つの遺伝子を標的とする最初のdsRNAを注入し、二日目の同じ蜂に第二のdsRNAを注入。
- 寒さは、新たに1〜2分のために4℃冷蔵庫にミツバチを浮上した。ミツバチが固定化されている場合、それらの腹部とthoraxの複数形の間で交差虫ピンで固形ワックスの完全ペトリ皿上で並列に3-4ミツバチをマウントします。
- 4℃の冷蔵庫に再びミツバチを冷やす。ミツバチは完全に不動であることを確認してください。それは、約1〜2分かかります。ミツバチが緩んでいるはずです。ミツバチが丸まったりねじ曲げなった場合、それは彼らがあまりにも長い間避けるべきであるどの冷やしていることを意味します。なごむはあまり高い死亡率の原因となるが、どんな動きが傷や死亡のサイズが大きくなりますように、完全な固定化は重要です。
- ハミルトンマイクロシリンジで使い捨て30 G針（BD）を入れます。 3μlのdsRNAのを取ると、シリンジ内に気泡がないことを確認してください。針は玉を避けるために、腹部の側面に挿入される内臓パトン。 dsRNAは、吸収されるように徐々にシリンジプランジャを押す。 dsRNAは、非常に粘性があるので、それは完全にシリンジから追放する2-3秒かかります。完全にプランジャーを押し下げた後、4,5秒のために傷口に針を残す。注射後3-5秒間ミツバチを観察します。傷口から血リンパ液滴が漏れた場合は、蜂を捨てる。
- さまざまな治療法に対応した彼らのthoraxの複数形をマークするために異なる色を使用してください。シングル注入戦略が使用された場合、この時点で、蜂、1時間の観察の後にコロニーに戻って配置することができる。しかし、2日間の注入戦略は最初のdsRNAを注射された後、使用された場合、ミツバチは蜂蜜シリンダメッシュケージに置かれるべき側に供給され、34のインキュベーターで保たれる℃、湿度80％ 。
- 二日目は、メッシュケージにミツバチを冷やし、ワックスプレートにマウントするためのステップ2.2および2.3に従ってください。それはdescriあるように、第2のdsRNAで注射を行うステップ2.4のベッド。
- ミツバチが1時間室温で回復し、植民地にそれらを紹介しましょう。
注：ノックダウン効果を定量的RT-PCR（定量RT-PCR）およびウェスタンブロットによって検出することができる。一般的には、ノックダウン効果が変化し、多くの要因に依存する。我々の研究では、二重の遺伝子ノックダウンは7日、シングル注入と二日間の注射後に検出することができます。
パート2：テングザル拡張応答（PER）アッセイ
1。ハイブから集めるミツバチ
注射後6日目に、喫煙者を使用せずに、コロニーからの処理ミツバチを収集します。金属メッシュシリンダーケージでミツバチを収集します。各ケージに3ミツバチを保つ。
2。 PER用取付ミツバチ
彼らが完全に固定化されている°Cまで4でミツバチを冷やす。特別にPERのために設計プラスチックチューブに垂直各蜂をマウントします。ボイジャーによって管内腹部を保つgの二つの小さなテープ片、チューブから突き出頭を維持。小さなプラスチック製のカラムの2行を持つラックにチューブを入れて、ID番号で各チューブ（蜂）を割り当てます。その後、インキュベーター（34℃、湿度80％）にラックで治療ミツバチを入れて、2時間インキュベーターに保管してください。
3。ショ糖水溶液のシリーズの準備
0％、0.1％、0.3％、1％、3％、10％及び30％スクロース水溶液を調製し、15〜20 G針とシリンジにソリューションを読み込む。
4。アッセイPER
0.1％、0.3％、1％、3％、10％および30％スクロース水溶液に続いて0％溶液（水）の液滴と蜂のアンテナをタッチします。最初に水ですべてのミツバチをテストし、各ソリューション間の間隔として、少なくとも2分が使用されていることができます。したがって、我々は、通常、各試験のために少なくとも20蜂を持っている。ハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合、肯定応答がカウントされます。
5。データ管理
味覚応答スコア（GRS）のために、個々の総陽性反応をまとめる。データに適切な統計分析を実行します。
パート3。遺伝子ノックダウンの検証
脂肪体は7日齢扱わミツバチの別のセットから解剖されています。標準トリゾール手順は、DNアーゼI処理24が行われるRNA抽出のために使用される。Vgとし、USPの遺伝子発現は二段階定量RT-PCRによって分析される。 アクチンは、それが、異なる組織で安定した式を有するので、参照遺伝子として用いられるミツバチの。 VG及びUSP遺伝子の公表リアルタイムPCRプライマーは、24本実験で使用されている。データは、デルタデルタCT法25を用いて分析される。
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Representative Results
シングル注入と2日間注入戦略大幅VG（一方向ANOVA、P <0.001）（ 図2A）とUSP（一方向ANOVA、P <0.001）（ 図2B）ミツバチにおける転写レベルを減少させ、両方のdsRNAを注入した6日後。 dsRNAの混合物およびVG第一および第二のUSP（VG / USP）と2日間の注射で単回注射を使用してUSP転写の抑制がUSP第一および第二のVG（USP / VG）で2日間の注射よりも有意に低かった（事後分析、P 混合対USP / VG = 0.013、P VG / USP対USP / VG = 0.019）。
ダブルノックダウンミツバチでGRSは、GFPコントロールミツバチ（スチューデントT検定、p = 0.0496）（ 図3）よりも有意に高かった。
図1。 RNA干渉（RNAi）/口先拡張応答（PER）アッセイ 50新しく登場ミツバチの4つのグループのフローチャートは 、異なる組み合わせの戦略を用いて、二本鎖ビテロゲニンのRNA（dsRNAは）（VG）とピラクル（USP）を注射したミツバチのゲノムに存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子のdsRNAで。ハチは、注射後にハイブに戻した、および6日後に採取した。群当たり十六ハチは、リアルタイムPCRを用いて遺伝子ノックダウンの検証のために収集し、グループごとに30口先拡張応答（PER）アッセイのためであった。 'GFP dsRNAは'は、GFPのdsRNAを注入したミツバチを示し; 'VG + USP混合物'でミツバチを示しVGとUSP dsRNAの混合物とjected; 'VG / USP'は、第2日目にUSPのdsRNAを注入した最初の日にVGのdsRNAを注入したミツバチを示し; 'USP / VG'が上でUSPのdsRNAを注入したミツバチを示し初日、2日目にはVGのdsRNAを注入。
図2。リアルタイムPCRを用いて、二重の遺伝子ノックダウンの検証。扱わミツバチの腹部脂肪体内で変換されたmRNAの相対値（平均±SEM）ログインします。 mRNAの相対値は、デルタデルタCT法を用いて計算した。（A）Vgを発現は、6日間のdsRNA注射の後。 VGの転写産物が大幅に3つの二重kでダウンレギュレートされた nockdownアプローチ（一方向ANOVA、P <0.001）。6日間dsRNAを注射した後（B） のUSP表現。 USPの転写産物が大幅に3つの二重ノックダウンアプローチ（一方向ANOVA、P <0.001）減少した。しかし、dsRNAの混合物およびVG / USPを注入ミツバチでUSPの発現は、USP / VG（事後分析、P 混合対USP / VG = 0.013、P VG / USPを注入ミツバチのそれよりもはるかに低かったUSP / VG対 = 0.019）、VGはVGとJH規制ループ内プライマリレギュレータかもしれないことを示している。 'RQ'は、標的遺伝子の転写産物の相対的定量化レベルを示す。バーは上記異なる文字は、治療群間の有意差を示す。
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図3。口先拡張応答（PER）アッセイを使用することにより味覚応答スコア（GRS）は VGとUSPのdsRNA混合物を注入したミツバチは、彼らが蔗糖に敏感だったことを示す、GFPコントロールよりも高いGRSを持っていた。バーは上記異なる文字は治療群（スチューデントT検定、p = 0.0496）の間に有意差を示す。
図4。 VGとUSPダブルノックダウン·アプローチを使用することによって明らかになった可能性調節遺伝子ネットワーク。幼若ホルモン（JH）は、ミツバチの脳内で産生され、血リンパに分泌される。ビテロジェニン（Vgが）脂肪体細胞により産生さ卵黄タンパク質前駆体である。 VGとJHは、代謝生理学を調整するフィードバックループ内にあるOGY、味覚の知覚、そしてミツバチの好みを餌と餌の発症年齢。研究はピラクル（USP）はJHのための推定受容体であり、転写因子として働くことができることを示唆している。 VGとUSP当社のダブルノックダウンはVGシングルノックダウンよりJHに大きな増加を引き起こした私たちは、VGとUSPのダブルノックダウンを見つけました。VGはVG、USPおよびJHの関係。1で中心的な役割を果たしているが明らかになって、USPシングルノックダウンしているJHの変化を誘発しなかった。それはVgがJHの産生を阻害するが、USPのノックダウン（）にJHのフィードバック応答を阻害するだけでなく、ことを示唆している。ダブルノックダウンで、Vgはから減少抑制からJHの生産結果の劇的な増加は、VGのノックダウンとUSPのノックダウン（B）。2によって引き起こさ減少JH伝達に対する代償性反応によって引き起こされる。我々はUSPを発見VGはVGはUSP mRNAtoそのdsRNAの感度を抑制示唆、主としてまたは同時にダウンレギュレートだったときに転写豊富よりUSP dsRNAを削減しました。どのようにVGは、RNA干渉（RNAi）に関与することができますか？ Vgがミツバチ免疫防御とRNAiは抗ウイルス自然免疫系の一部で規制している。我々の以前の研究では、あるアルゴノート3（GB19389、PIWI）、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）の重要なコンポーネントは、ミツバチ社会的行動（味覚の知覚、発症年齢の好みを餌と餌の）影響を与える候補遺伝子の一つであるを示してVG / JHモジュールによって制御。したがって、一つの可能性は、VgがRISC（A）の活性に影響を及ぼすアルゴノート蛋白質を抑制することができるということである。 Vgがダウンレギュレートされるとき、USPの dsRNAをより効率的USP mRNA の （B）に分解することができる。3。地球ダブルノックダウンの研究はまた、USPはないことを明らかにするどちらも単一のUSPのノックダウンはVGの転写豊富に影響を与え、また、二重VGとUSPノックダウンはVG転写物のさらなる低下を招くため、体脂肪にVgを生産にJHの阻害作用を媒介しない。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
我々の研究は、同時に成虫に二つの遺伝子をノックダウンするための最初の取り組みです。我々の結果は、dsRNAを注射（単回注射と二日間の注射）の2つの戦略は、二重遺伝子抑制に有効であることを示している、とVGとUSPの同時遺伝子サイレン蜂8,9に6日間dsRNAを注射した後にテストすることができます。しかし、遺伝子ノックダウンの効果は、細胞や臓器によって標的遺伝子、タンパク質の代謝回転率とdsRNAの取り込み効率の転写レベルに応じてさまざまな昆虫種が異なります。また、RNAiはの効果は用量依存的である。私たちは、新たに出現し蜂はよく4μlのdsRNAをを受け入れることが見つかりましたが、以上の4μLのdsRNAを注入した場合、死亡率が急速に増加しています。したがって、2日間の注入戦略は、注入量のより高い量を必要とする実験のための単一の注入よりも適切であり得る。
ここでは、二重の遺伝子ノックダウン9
例えばVgはとJHはミツバチ生理学9と行動成熟26,27を規制するフィードバックループ内にある。これまでの研究では、JHの局所適用は、VG式 29を減らすことができるのに対し、VGの遺伝子ノックダウンは、ミツバチ28にJHレベルを上げることができることを示している。また、研究は、USPはJHのための推定受容体であり、転写因子14,30とJHに対する応答を媒介し得る示唆している。しかし、どのようにVGは JH力価を変調し、USPが JHによってVGの調節に関与しているかどうかはまだよく理解されていない。ダブルノックダウン·アプローチを使用して、我々はVG、USPとJH（間の詳細な相互関係を発見した
PERは、ミツバチ社会的行動35の開発のための予測因子として使用されているミツバチに味覚の知覚を測定するための標準的なアッセイである。砂糖に高感度でミツバチは通常、人生の早い段階での採餌開始と花粉を集めることを好む。味覚認識はまた、任意の他の大規模な挙動試験が実行される前に社会的行動に対する治療効果を予測するために試験することができる。さらに、我々は飽食と飢餓レベルを識別するために利用することができるPER味覚認識は、内部の代謝状態従って9と相関していることが示されている。また、臭気条件と対PERは、学習を研究するために用いられるミツバチでとメモリ。総称して、アッセイPERミツバチの行動と代謝生理学を研究するための非常に便利なテクニックです。しかし、PERは、メソッド36を取り扱うに敏感です。例えば、冷えるまたはCO 2で麻酔ミツバチは、コントロール36以上のショ糖より応答だった。また、一日中に変化する環境条件やストレスに敏感です。したがって、実験中の環境および手順の一貫性を保つことが非常に重要である。一般的に、我々は午前中にPERを終えると次の日に同じスケジュールに従ってください。私たちは通常、午前8時に早朝にハチの収集を開始し、それがPERのために準備をする3時間を要する。 PERニーズは数日にわたって行われる場合には、環境が変化した場合の短い期間内に完了することが重要である。 PERグループで撮影する必要があり、少なくとも2分の間隔が異なるconcentratiの間に保たれなければならないので、各グループには、20以上のミツバチを含める必要があります蔗糖ソリューションのアドオン。私たちは、グループごとに75-100ミツバチを行っている。
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Acknowledgments
著者は、実験を支援するエリンFennernに感謝したいと思います。この作品は、ノルウェーの研究評議会（180504、185306及び191699）、ピュー慈善トラスト、および国立老化研究所（NIA P01 AG22500）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
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