Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.
Abstract
Dieses Video zeigt neue Techniken der RNA-Interferenz (RNAi), die zwei Gene gleichzeitig herunterreguliert in Honigbienen mit doppelsträngigen RNA (dsRNA) Injektionen. Es stellt auch ein Protokoll der Rüssel extension response (PER) Assay zur Messung geschmacklichen Wahrnehmung.
RNAi-vermittelte Gene Knockdown ist eine effektive Technik Herunterregulieren Ziel Genexpression. Diese Technik ist in der Regel für einzelne Genmanipulation verwendet, aber es hat seine Grenzen Wechselwirkungen und gemeinsame Wirkung von Genen nachzuweisen. Im ersten Teil dieses Video präsentieren wir zwei Strategien gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene (so genannte Doppel-Gen Knockdown). Wir zeigen beide Strategien sind in der Lage, effektiv zu unterdrücken zwei Gene, Vitellogenin (vg) und Ultraspiracle (usp), die in einer regulatorischen Rückkopplungsschleife sind. Diese doppelte Gen Knockdown Ansatz kann verwendet werden, um Zusammenhänge zwischen Genen sezieren und kann leicht in angewendet werdenverschiedene Insektenarten.
Der zweite Teil dieses Videos ist eine Demonstration der Rüssel extension response (PER)-Assay in Honigbienen nach der Behandlung von Doppel-Gen Knockdown. Die PER-Assay ist ein Standard-Test zur Messung geschmackliche Wahrnehmung in Honigbienen, die ein wichtiger Prädiktor für wie schnell eine Honigbiene Verhaltens Reifung ist. Größere Geschmacks Wahrnehmung Nest Bienen zeigt erhöht Verhaltensstörungen Entwicklung, die oft mit einem früheren Alter bei Beginn der Futtersuche und Futtersuche Spezialisierung in Pollen assoziiert ist. Darüber hinaus können pro Test angewendet, um metabolische Zustände der Sättigung oder Hunger in Honigbienen zu identifizieren. Schließlich PER-Assay mit verschiedenen Paarung Geruch Reize für die Konditionierung die Bienen auch weit verbreitet ist für Lernen und Gedächtnis in Studien Honigbienen kombiniert verwendet.
Introduction
RNA-Interferenz (RNAi) RNA ist auf post-transkriptionale Gen-Silencing, das in einer Vielzahl von eukaryotischen Organismen auftritt. Verfahren nach RNAi durch endogene oder exogene doppelsträngige RNA (dsRNA)-Vorstufen ausgelöst. Die dsRNA aktiviert das Protein Ribonuclease Dicer bindet und spaltet die dsRNA zu kleine Fragmente (20-25 bp). Dann werden die kleinen Fragmenten der dsRNA Führung eine Erkennung und Spaltung der komplementären mRNAs durch argonaute Proteine eine katalytische Komponente des RNA-induced silencing complex (RISC) 1. Bei Säugetieren aktivieren dsRNAs länger als 30 nt, eine antivirale Reaktion (Interferon-Antwort, IFN), die unspezifische Abbau von RNA-Transkripte 2 führt. Allerdings haben lange dsRNAs als wirksam erwiesen und spezifische in Insekten, da ein Mangel an diesem IFN 3.
Lange dsRNAs haben Herunterregulation der Zielgene wurde in verschiedenen Insektenarten verwendet. Honigbienen sind eine der pionEER Insekten Organismen, in denen viele wichtige Funktionen der Gene in der Entwicklung und das Verhalten haben mit dsRNA 4,5 offenbart worden. Mehrere dsRNA Versandmethoden haben in Honigbienen durchgeführt: dsRNA Fütterung effizient herunterreguliert Ziel Genexpression in Honigbienenlarven 6, während dsRNA Injektion ist ein wirksamer Ansatz für die Gen-Knockdown in Honigbiene Embryonen 4 und erwachsenen Bienen 7,8.
Gene Knockdown durch das Aufbringen von dsRNA Insekten ausgestellt sind vorübergehend und lokalisiert. Studien haben gezeigt, dass beide Bauch dsRNA Injektionen und Brust-dsRNA Injektionen wirksam unterdrücken Ziel Genexpression in Bauchfett Körperzellen von Insekten 9,10. DsRNA in Bauch-und Brusthöhle und fetten Körper Zellen injiziert sind in der Lage, sich der dsRNA aus der Hämolymphe, wo die Zellen 10 gebadet werden. Allerdings können Gene in anderen Organen, wie Eierstöcke und Gehirn, nicht entweder gezieltBauch-oder Brust-Injektionen. Um Gene in Honigbiene Gehirn zielen, hat Gehirn Injektion von dsRNA auch durchgeführt worden, die effektiv beeinflusst Zielgenexpression in lokalen Hirnareale 11. Hier haben wir nur dokumentieren Bauch dsRNA Injektion, die häufiger verwendet wird, ist bei erwachsenen Bienen.
RNAi wurde in erster Linie verwendet, um ein einzelnes Gen gezielt und ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genfunktion zu offenbaren. Allerdings ist jedes Gen nicht isoliert von den anderen, es ist in komplexen regulatorischen Netzwerke. Ein Schlüssel für einen biologischen Prozess zu verstehen ist, sezieren, wie Gene miteinander, die eine gleichzeitige Manipulationen von mehreren Genen, anstatt ein einzelnes Gen Knockdown erfordert interagieren. In Säugerzellen, haben Wissenschaftler in gleichzeitig hemmen zwei oder drei Gene mithilfe Delivery-Systeme 12 oder multi-microRNA (miRNA) Haarnadel Designs 13 gelungen. Aber in Insekten, sind mehrere Gen Niederschlägen noch ungetestet. Hier presen wirt verschiedene Injektions-Strategien, die eine doppelte Gen Knockdown erreichen können. Wir haben das Ziel zwei Gene: vitellogenin (VG), die eine Vorläufer-Protein kodiert, Eigelb und Ultraspiracle (USP), die eine putative Rezeptor für Juvenilhormon (JH) codiert und als ein Transkriptionsfaktor Vermittlung antwortet JH 14 in Honigbienen dienen. Vg und JH regulieren sich gegenseitig in einer Rückkopplungsschleife 15 und sind in Honigbiene Verhaltensregulation 9 beteiligt. Mit dem Doppel-Gen Knockdown, entdecken wir stören sowohl Vg und JH Wege, und wie sie gemeinsam beeinflussen Honigbiene Verhalten und Physiologie und wie vg, usp und JH interagieren 9.
Gustatorisch Wahrnehmung ist ein Verhaltens-Prädiktor für die Honigbiene Sozialverhalten 16. In Bezug auf die Entwicklung des Verhaltens, nest Bienen mit hohen geschmacklichen Wahrnehmung behaviorally reifen schnell, und in der Regel Futter früh im Leben und es vorziehen, Pollen sammeln 16,17. Obwohl regulatorische mechanisms zugrunde geschmacklichen Wahrnehmung sind noch unklar, Studien haben gezeigt, dass geschmackliche Wahrnehmung der internen Energiestoffwechsel 9, Hormonausschüttung 18,19 und biogenetische Amin Signalwege 20 verbunden ist. Sowohl Vg und JH sind wichtige hormonellen Regulatoren modulierenden geschmacklichen Wahrnehmung 7,21. Im Labor kann eine Variation der geschmacklichen Wahrnehmung in Honigbienen durch die Prüfung der Rüssel extension response (PER) zu verschiedenen Saccharoselösungen ausgewertet werden. Jede Biene durch Berühren sowohl ihre Antennen mit Wassertröpfchen durch einen aufsteigenden Konzentrationsreihe von 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% Saccharose gefolgt getestet. Eine positive Antwort wird darauf hingewiesen, wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel, wenn ein Tröpfchen von Wasser oder Saccharose zu jeder Antenne berührt wird. Basierend auf der Anzahl der positiven Reaktionen auf der Lösungen kann die geschmackliche Wahrnehmung Ebene der einzelnen 16 bestimmt werden. Jedoch ist die Anwendung der PER nicht auf die Messung begrenzt gustatory Wahrnehmung. Die PRO ist auch eine wirksame Methode, um den metabolischen Zustand der Bienen wie Sättigung gegen Hunger testen. Die Bienen mit mehr Antworten auf Saccharose sind hungriger im Allgemeinen (Wang und Amdam, unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus kann die PER Paradigma auch in assoziativen Lernen und Gedächtnis in Honigbienen verwendet werden. In diesem Fall Bienen ausgebildet, um die Gegenwart von Saccharose Wasser mit einem Duft zu assoziieren werden. Wenn die Bienen den Verein zu erfahren, können nur die Anwesenheit des Geruchs eine positive Antwort ohne Rüssel belohnte sie mit dem Saccharose 22,23 evozieren. In diesem Video zeigen wir, wie Sie ausführen PER gustatory Wahrnehmung, die mit vg und usp Doppel Knockdown in einer früheren Studie 9 angeschlossen wurde evaluieren.
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Protocol
Teil 1: RNAi-vermittelte doppelte Gen Knockdown
1. dsRNA Synthese
- Design-Primer dsRNAs Targeting vg, usp und ein Kontroll-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein (GFP), die nicht in der Honigbiene Genom: Primer wurden mit Online-freie Software Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
- dsRNA-Synthese für vg, usp und GFP: Verwendung RiboMax T7-RNA-Produktion-System von Promega für in-vitro-Transkription.
- dsRNA Reinigung:
- Denaturierung und Renaturierung: Wärme die dsRNA bis 85 ° C für 5 min und abkühlen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- DNase I Behandlung: add 1 ul DNase I in jeder dsRNA Reaktion und mischen sie durch Schwenken der Röhrchen. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C.
- In 150 ul Nuklease-freies Wasser und 750 ul TRIzol - LS in jeder Reaktion und vorsichtig mischen sie von inverting die Röhre. Inkubieren der Proben 5 min bei 30 ° C.
- In 200 ul Chloroform in jeder Probe. Mischen Sie kräftig für 20 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben für 15 min bei 12.000 xg bei 4 ° C.
- Den Überstand Phase zu jedem neuen Rohr und fügen Sie 500 ul Isopropanol in jedes Röhrchen. Mischen Sie sie durch Invertieren des Röhrchens. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei -20 ° C. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 xg bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand und benutzen 1.000 ul 75% Ethanol, um das Pellet zu waschen. Nach Zentrifugieren der Röhrchen 5 min bei 7.500 xg bei 4 ° C, Luft trocknen die dsRNA Pellet, und verwenden Nuklease freiem Wasser, um das Pellet zu lösen. Um die Wirksamkeit von Gen Down-Regulation zu gewährleisten, sollte die Konzentration dsRNA rund 9 -10 ug / ul sein.
2. dsRNA Bauch-Injection
Für Doppel-Gen Knockdown, gibt es zwei Strategien: 1) einzelne Injektion: mix dsRNA von zwei Genen und inject die Mischung, 2) zweitägigen Injektion: Injektion der ersten dsRNA Targeting ein Gen am ersten Tag, und injizieren das zweite dsRNA in die gleichen Bienen am zweiten Tag.
- Gefühlt neu geschlüpfte Bienen in einem 4 ° C Kühlschrank für 1-2 min. Wenn die Bienen immobilisiert sind, montieren Sie 3-4 Bienen parallel auf Petrischalen voller festes Wachs mit Insektennadeln zwischen ihren Bäuchen und thoraces gekreuzt.
- Kühlen Sie die Bienen wieder in einem 4 ° C Kühlschrank. Sicherstellen, dass die Bienen sind völlig unbeweglich. Es dauert ca. 1-2 min. Die Bienen aussehen sollte locker. Wenn die Bienen gewellt oder verdreht werden, bedeutet dies, sie zu lang, die vermieden werden sollte gekühlt. Erholung zu viel verursacht hohe Sterblichkeit, vollständige Immobilisierung ist jedoch wichtig, da jede Bewegung erhöht die Größe der Wunde und Mortalität.
- Setzen Sie ein Einweg-30 G-Nadel (BD) auf einer micro Hamilton Spritze. Take 3 ul dsRNA und stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase in der Spritze. Die Nadel wird auf eine Seite des Bauches eingefügt dama vermeidenGing inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam, damit die dsRNA absorbiert werden. Seit dsRNA sehr zähflüssig ist, dauert es 2-3 Sekunden vollständig aus der Spritze ausgeschlossen werden. Nach dem vollständigen Herunterdrücken des Kolbens, lassen Sie die Nadel in die Wunde für 4-5 sek. Beachten Bienen für 3-5 sec nach den Injektionen. Wenn ein Tropfen Hämolymphe Lecks aus der Wunde, entsorgen Sie die Biene.
- Verwenden Sie unterschiedliche Farben, um ihre thoraces entsprechend den verschiedenen Behandlungen zu markieren. Zu diesem Zeitpunkt, wenn der einzelne Injektion Strategie wurde verwendet, können die Bienen zurück in eine Kolonie plaziert werden nach 1 Stunde Beobachtung. Wenn jedoch die zwei Tage Injektion Strategie wurde verwendet, nachdem sie mit dem ersten dsRNA injiziert wird, sollte die Bienen in einem Zylinder Maschenkäfig mit Honig auf der Seite zugeführt gebracht und in einem Inkubator bei 34 ° C gehalten werden und 80% Luftfeuchte .
- Am zweiten Tag, befolgen Sie die Schritte 2.2 und 2.3, die den Bienen in den Käfigen Mesh Chillen und montieren sie auf Wachsplatten. Führen Injektionen mit dem zweiten dsRNA, wie es ist beschrieBett in Schritt 2.4.
- Lassen Sie die Bienen bei Raumtemperatur für 1 Stunde erholen und führen sie in eine Kolonie.
Hinweis: Knockdown Effekte können durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR) und Western Blot nachgewiesen werden. Im Allgemeinen variiert Knockdown Wirksamkeit und hängt von vielen Faktoren ab. In unserer Studie kann die doppelte Gen Knockdown von 7 Tagen nach einzelnen Injektionen und zweitägigen Injektionen nachgewiesen werden.
Teil 2: Rüssel extension response (PER) Assay
1. Sammeln Bienen aus dem Bienenstock
Am 6. Tag nach der Injektion, sammeln behandelten Bienen aus der Kolonie ohne Verwendung eines Rauchers. Sammeln Bienen in Metallgitter Zylinder Käfigen. Halten Sie 3 Bienen in jedem Käfig.
2. Montage Bees für PER
Kühlen Sie die Bienen bei 4 ° C bis sie vollständig immobilisiert. Hängen Sie jede Biene vertikal in einem Kunststoffrohr speziell für PRO entwickelt. Halten Sie den Bauch in der Röhre durch using zwei kleine Stücke des Bandes, und halten Sie den Kopf ragte aus dem Rohr. Setzen Sie die Rohre auf einem Gestell mit zwei Reihen von kleinen Kunststoff-Säulen, und weisen jedes Rohr (bee) mit einer ID-Nummer. Dann legen Sie behandelten Bienen auf den Regalen in einen Inkubator (34 ° C und 80% Luftfeuchte) und halten sie in den Inkubator für 2 Stunden.
3. Vorbereiten einer Reihe von Saccharose Water Solutions
Bereiten 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen und laden Sie die Lösungen in die Spritzen mit 15-20 G Nadeln.
4. PER Assay
Berühren Sie die Biene die Antenne mit einer Tröpfchengröße von 0% ige Lösung (Wasser) von 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose Wasser-Lösungen verfolgt. Testen Sie alle Bienen zuerst mit Wasser und lassen Sie mindestens zwei Minuten, wie das Intervall zwischen jeder Lösung verwendet wird. Deshalb haben wir in der Regel mindestens 20 Bienen für jeden Versuch. Wenn eine Biene voll streckt ihre Rüssel wird eine positive Reaktion gewertet.
5.Data Management
Fassen Sie die insgesamt positive Antworten für jeden einzelnen für geschmackliche Antwort Punktzahl (GRS). Führen Sie eine geeignete statistische Analyse der Daten.
Teil 3. Gene Knockdown Validierung
Fat Körper sind aus einem anderen Satz von 7 Tage alten Bienen behandelt seziert. Ein Standard TRIZOL Verfahren zur RNA-Extraktion, die von DNase I-Behandlung 24 gefolgt wird. Vg und USP Genexpression durch eine Zwei-Schritt-PCR qRT. Actin analysiert wird als ein Referenz-Gen verwendet werden, da sie stabil Ausdrücke in verschiedenen Geweben hat von Honigbienen. Veröffentlicht Echtzeit-PCR-Primer für vg und USP-Gens sind in diesem Experiment 24 verwendet. Die Daten werden durch Delta-Delta CT-Verfahren 25 analysiert.
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Representative Results
Sowohl die Single-Einspritzung und zwei Tage Injektion Strategien deutlich vg (One-way ANOVA, p <0,001) (Abbildung 2A) und USP (One-way ANOVA, p <0,001) (Abbildung 2B) reduziert Transkripte in Honigbienen Sechs Tage nach der dsRNA injiziert. Die Unterdrückung der usp Transkript mit dem einzigen Injektion mit dsRNA Mischung und die zweitägige Injektion mit vg ersten und zweiten usp (vg / usp) war signifikant niedriger als der zweitägigen Injektion mit usp ersten und zweiten vg (usp / vg) (Post-hoc-Analyse, S. Mischung vs usp / vg = 0,013, p vg / vs usp usp / vg = 0,019).
Die GRS in den Doppel-Knockdown Bienen war signifikant höher als die GFP-Kontroll-Bienen (Student T-Test, p = 0,0496) (Abbildung 3).
Abbildung 1. Flussdiagramm der RNA-Interferenz (RNAi) / Rüssel extension response (PER) Assay. Vier Gruppen von 50 frisch geschlüpfte Bienen wurden mit doppelsträngigen RNA (dsRNA) Vitellogeninkonzentrationen (vg) und Ultraspiracle (usp) durch den Einsatz verschiedener Strategien Kombination injiziert oder dsRNA mit der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-Gen, das nicht in der Honigbiene Genom existiert. Die Bienen wurden wieder zu einem Bienenstock nach den Injektionen gegeben und wurden nach 6 Tagen gesammelt. Sechzehn Bienen pro Gruppe wurden für die Gen-Knockdown Validierung mittels real-time PCR gesammelt und dreißig pro Gruppe waren für Rüssel extension response (PER) Assay. Die "GFP dsRNA 'zeigt die Bienen mit GFP dsRNA injiziert, die' vg + usp Mischung 'zeigt die Bienen inprojiziert mit vg und usp dsRNA Mischung, die 'vg / usp' zeigt die Bienen mit vg dsRNA am ersten Tag injiziert, dann mit usp dsRNA am zweiten Tag injiziert, die 'usp / vg' zeigt die Bienen mit usp dsRNA injiziert auf der erste Tag, und mit vg dsRNA am zweiten Tag injiziert.
Abbildung 2. Doppel Gen Knockdown Validierung durch Real-time PCR. Anmelden verwandelt mRNA relativen Wert (Mittelwert ± SEM) in Bauchfett Körper der behandelten Bienen. Die mRNA relativen Wert wurde unter Verwendung von Delta-Delta CT-Methode berechnet. (A) Vg Ausdruck 6 Tage nach der dsRNA Injektionen. Die vg Transkripte wurden wesentlich durch drei Doppel-k herabreguliert nockdown Ansätze (One-way ANOVA, p <0,001). (B) Usp Ausdruck 6 Tage nach der dsRNA Injektionen. Der USP-Transkripte wurden wesentlich durch drei Doppel-Knockdown Ansätze (One-way ANOVA, p <0,001) reduziert. Allerdings war das usp-Expression in den Bienen mit dem dsRNA Gemischs und vg / usp injiziert viel niedriger als die in den Bienen mit usp / vg (Post-hoc-Analyse, S. Mischung vs usp / vg = 0,013, p vg / usp injiziert vs usp / vg = 0,019), was darauf hinweist, dass vg kann eine primäre Regler in der vg und JH regulatorischen Schleife. Die "RQ" zeigt die relative Quantifizierung Ebene des Zielgens Transkripte. Die einzelnen Buchstaben über Bars bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen.
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Abbildung 3. Gustatorisch Antwort Punktzahl (GRS) mit Rüssel extension response (PER) Assay. Die Bienen, die mit vg und usp dsRNA Mischung injiziert wurden, hatten höhere GRS als die GFP Kontrollen, was sie waren empfindlicher auf Saccharose. Die einzelnen Buchstaben über Bars bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (Student T-Test, p = 0,0496).
Abbildung 4. Mögliche regulatorische Gen-Netzwerke aufgedeckt, indem vg und usp Doppel Knockdown Ansatz. Juvenilhormon (JH) in der Honigbiene Gehirn produziert und sezerniert der Hämolymphe. Vitellogenin (VG) ist ein Eigelb Proteinvorläufer durch Fett Körperzellen produziert. Vg und JH sind in einer Rückkopplungsschleife Regulierung Stoffwechsel Physiologienologie-, Geschmacks-Wahrnehmung und das Alter bei Beginn der Futtersuche und Nahrungssuche bevorzugt von Honigbienen. Studien zeigen, dass Ultraspiracle (USP) eines mutmaßlichen Rezeptor für JH ist, und kann als Transkriptionsfaktor dienen. Unsere Doppel-Knockdown von vg und usp hat ergeben, vg spielt eine zentrale Rolle in der Beziehung zwischen vg, usp und JH. 1. Wir haben Doppel Knockdown von vg und usp verursacht einen stärkeren Anstieg in JH als ein vg einzigen Knockdown und eine usp einzigen Knockdown nicht induzieren eine Veränderung in JH. Er schlägt vor, dass Vg hemmt nicht nur JH Produktion, sondern hemmt ein Feedback Reaktion von JH zu usp Knockdown (A). In Doppel-Niederschlägen führte die dramatische Zunahme von JH Produktion resultiert aus einer reduzierten Hemmung von Vg von vg Knockdown und eine kompensatorische Reaktion auf eine reduzierte JH Transduktion durch usp Knockdown (B). 2 verursacht. Wir fanden uspTranskript Überfluss wurde mehr durch usp dsRNA reduziert, wenn vg war vor oder gleichzeitig herunterreguliert, was darauf hindeutet vg unterdrückt die Empfindlichkeit der usp mRNAto seiner dsRNA. Wie kann vg in RNA-Interferenz (RNAi) einbezogen werden? Vg regelt Honigbiene Immunabwehr und RNAi ist ein Teil von antiviralen angeborenen Immunsystems. Unsere früheren Studie zeigt argonaute 3 (GB19389, piwi), ein wichtiger Bestandteil der RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), ist einer der Kandidaten-Gene beeinflussen Honigbiene Sozialverhalten (geschmacklichen Wahrnehmung, Alter bei Beginn und Nahrungssuche Nahrungssuche bevorzugt), das gesteuert durch Vg / JH Modul. Daher ist es eine Möglichkeit, dass Vg kann argonaute Proteine, die die Aktivität von RISC (A) zu unterdrücken. Wenn vg herunterreguliert ist, usp dsRNA Lage, effizienter abbauen usp mRNA (B). 3. Unsere Doppel-Knockdown Studie zeigt auch, dass usp tutnicht vermitteln hemmende Wirkung von JH auf Vg Produktion in der fetten Körper, da weder einzelne usp Knockdown beeinflusst vg Transkript Fülle, noch doppelt vg und usp Knockdown bewirkt eine weitere Reduzierung der vg Transkripte. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Unsere Studie ist der erste Versuch, gleichzeitig niederzuschlagen zwei Gene in erwachsenen Insekten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beiden Strategien der dsRNA Injektionen (einzelne Injektion und zweitägigen Injektion) für die doppelte effektive Genunterdrückung und gleichzeitig Gen-Silencing von vg und usp sind, können 6 Tage nach der dsRNA Injektionen in Bienen 8,9 getestet werden. Allerdings variiert Gen Knockdown Wirksamkeit in verschiedenen Insektenarten abhängig Transkript Niveau der Ziel-Gen-, Protein-und Fluktuationsraten dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen oder Organen. Darüber hinaus ist die Wirkung von RNAi dosisabhängig. Wir haben eine neu entstandene Biene könnte annehmen 4 ul dsRNA, aber die Sterblichkeit schnell erhöht werden, wenn mehr als 4 ul dsRNA injiziert wurde. Daher kann das Zwei-Tages Einspritzstrategie besser geeignet als die einzige Injektion für einen Versuch, die höher Einspritzmenge Volumen erfordert.
Hier die doppelte Gen Knockdown 9
Zum Beispiel Vg und JH sind in einer Rückkopplungsschleife Regulierung Bienenphysiologie 9 und Verhaltensstörungen Reifung 26,27. Frühere Studien haben gezeigt, dass die vg Gen Knockdown kann JH Ebene in Honigbienen 28 erhöhen, während die topische Anwendung von JH vg Ausdruck 29 reduzieren können. Darüber hinaus haben Studien vorgeschlagen USP ist eine putative Rezeptor für JH und kann Antworten auf JH vermitteln als Transkriptionsfaktor 14,30. Doch wie vg moduliert JH-Titer und ob usp ist an der Regulation von vg von JH beteiligt sind noch weitgehend unverstanden. Mit dem Doppel-Knockdown Ansatz haben wir detaillierte Zusammenhänge zwischen vg, usp und JH entdeckt (
PER ist ein Standard-Test zur Messung geschmackliche Wahrnehmung in Honig Bienen, die als Prädiktor für die Entwicklung der Honigbiene Sozialverhalten 35 verwendet wurde. Bienen mit hoher Empfindlichkeit, um Zucker in der Regel beginnen Futtersuche früh im Leben und es vorziehen, Pollen zu sammeln. Gustatorisch Wahrnehmung kann auch für die Vorhersage der Wirkung der Behandlung auf soziale Verhaltensweisen, bevor andere groß angelegte Verhaltensstudien durchgeführt werden, getestet werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass geschmackliche Wahrnehmung mit internen metabolischen Zustand 9 Daher korreliert ist, PER kann genutzt werden, um Sättigung und Hunger Ebenen zu identifizieren. Darüber hinaus wird mit PER Geruch gepaart Bedingungen für die Erforschung von Lernen beschäftigtund Speicher in Honigbienen. Gemeinsam PER-Assay ist eine sehr nützliche Technik zur Untersuchung Honigbiene Verhalten und Stoffwechsel-Physiologie. Allerdings ist PER empfindlich auf Umgang mit Methoden 36. Zum Beispiel waren Bienen, betäubt durch Kühlen oder CO 2 waren stärker auf die Saccharose als 36 Kontrollen. PER variiert auch während des Tages und ist empfindlich auf Umwelteinflüsse und Stress. Daher ist es sehr wichtig, die Umgebung und Verfahren im Einklang während des Experiments zu halten. In der Regel haben wir PER in der Früh zu beenden und nach dem gleichen Zeitplan in folgenden Tagen. Wir beginnen in der Regel sammeln Bienen in den frühen Morgenstunden um 8:00 Uhr, und es dauert 3 Stunden, um sich für PRO bereit. Wenn PER Bedürfnisse über mehrere Tage durchgeführt werden soll, ist es wichtig, sie in einem kurzen Zeitraum in diesem Fall die Umgebung ändert beenden. PER sollten in Gruppen getroffen werden und jede Gruppe sollte mehr als 20 Bienen sind da mindestens 2-Minuten-Intervall muss zwischen verschiedenen concentrati gehalten werdenons von Saccharose-Lösungen. Wir haben 75-100 Bienen pro Gruppe getan.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung Erin Fennern Experiment danken. Diese Arbeit wurde von der Research Council of Norway (180504, 185306 und 191699), Pew Charitable Trust und dem National Institute on Aging (NIA P01 AG22500) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
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