Summary
Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.
Abstract
Bu video çift zincirli RNA (dsRNA) enjeksiyonları kullanarak bal arıları aynı anda iki gen downregülasyon RNA girişim (RNAi) 'nin yeni teknikler gösterilmiştir. Ayrıca tat algı ölçümü için hortum uzantısı yanıt (PER) testinin bir protokol sunar.
RNAi-aracılı gen demonte hedef gen ifadesi Aşağı doğru düzenleme etkili bir tekniktir. Bu teknik genellikle tek gen manipülasyonu için kullanılan, ancak etkileşimler ve genler arasında ortak etkileri tespit etmek için sınırlamalar vardır. Bu videonun ilk bölümünde, biz aynı anda iki gen (çift gen demonte olarak adlandırılır) yıkmak için iki strateji sunuyoruz. Biz her iki stratejinin etkili bir düzenleyici geri besleme döngüsü olan iki gen, vitellogeninin (vg) ve Ultraspiracle (USP), bastırmak edebiliyoruz göstermektedir. Bu çift gen demonte bir yaklaşım genler arasındaki ilişkileri incelemek için kullanılabilir ve kolayca uygulanabilirfarklı böcek türü.
Bu videonun ikinci kısmı çift gen demonte tedavisi sonrasında bal arıları içinde burnumun uzantısı yanıt (PER) testi bir örneğidir. BAŞINA testi bal arılarının, bir bal arısı davranışsal olgunlaşma ne kadar hızlı için önemli bir belirleyici olduğu da tat algısı ölçmek için standart bir testtir. Yuva arıların daha fazla tat algısı genellikle polen uzmanlık yiyecek arama ve yiyecek arama başlama erken yaşta ile ilişkili artan davranışsal gelişim gösterir. Buna ek olarak, BAŞINA test bal arıları içinde doyma veya açlık metabolik durumları tanımlamak için uygulanabilir. Son olarak, test PER arılar da yaygın olarak bal arıları öğrenme ve bellek çalışmaları için kullanılan klima için farklı koku uyaranlara eşleştirme ile birlikte.
Introduction
RNA interferans (RNAi) ökaryotik organizmaların bir yelpazede oluşur RNA temelli transkripsiyon sonrası gen susturma vardır. RNAi işlemi endojen veya eksojen çift sarmallı RNA (dsRNA) öncüleri tarafından tetiklenir. DsRNA bağlar ve küçük parçaları (20-25 bp) için dsRNA parçalayarak ribonükleaz protein Dicer harekete geçirir. Daha sonra dsRNA kılavuzun küçük parçalara argonaute proteinler tarafından tamamlayıcı mRNA bir tanıma ve bölme, RNA'ya bağlı susturma kompleksi (RISC), 1 katalitik bir bileşeni. Memelilerde, 30 nt daha uzun dsRNA'ları, RNA transkript 2 spesifik olmayan bozulmasına yol açan bir antiviral (interferon yanıtı, IFN) aktif hale. Ancak, uzun dsRNAs bu IFN 3 eksikliği olduğu için böcekler etkili ve spesifik olduğu kanıtlanmıştır.
Uzun dsRNA'ları farklı böcek türü, hedef genin baskılanması için kullanılmıştır. Bal arıları pion biridirEER böcek organizmalar hangi gelişim ve davranış birçok önemli genlerin fonksiyonları dsRNA 4,5 ile ortaya konmuştur. Çeşitli dsRNA teslimat yöntemleri bal arıları içinde gerçekleştirilmiştir: dsRNA enjeksiyon bal arısı embriyo 4 ve yetişkin arıların 7,8 gen demonte için etkili bir yaklaşım ise dsRNA besleme verimli, bal arısı larva 6 hedef gen downregüle.
Böceklere dsRNA uygulayarak sergilenen gen demonte etkiler geçicidir ve lokalize bulunmaktadır. Çalışmalar karın dsRNA enjeksiyonları ve göğüs dsRNA enjeksiyonları hem etkili böcek 9,10 karın yağ vücut hücrelerinde hedef gen ifadesi bastırmak göstermiştir. DsRNA hücreleri 10 yıkandığı hemolimf gelen dsRNA almak edebiliyoruz karın ve göğüs boşlukları ve vücut yağ hücrelerine enjekte edilir. Bununla birlikte, böyle bir yumurtalık ve beyin gibi diğer organlarda, gen ya tarafından hedeflenemezkarın veya göğüs enjeksiyonları. Bal arısı beyinde genlerin hedef için, dsRNA beyin enjeksiyonu aynı zamanda etkin bir yerel beyin alanları 11, hedef genin ifade etkileri, gerçekleştirilmiştir. Burada, yalnızca yetişkin bal arıları daha sık kullanılan karın dsRNA enjeksiyon belgelemek.
RNAi öncelikle tek bir gen hedef için kullanılmıştır ve gen fonksiyonu ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olmuştur. Ancak, herhangi bir gen diğerlerinden izole değil, karmaşık düzenleyici ağlarda olduğunu. Biyolojik bir süreci anlamak için bir anahtar genlerin çoklu genlerin aynı anda manipülasyonlar yerine tek bir gen demonte gerektiren, birbirleriyle etkileşim nasıl incelemek için. Memeli hücre hatlarında, bilim adamları dağıtım sistemleri 12 ya da çok-microRNA (miRNA) saç tokası tasarımları 13 ile aynı anda inhibe iki veya üç gen başardı. Ama böceklerde, birden fazla gen hakemin hala test edilmemiştir. Burada, presenbir çift gen demonte elde edebilirsiniz t farklı enjeksiyon stratejileri. Bir yumurta sarısı proteini habercisi kodlar, ve çocuk hormon (JH) için varsayılan reseptör kodlar ve Ultraspiracle (USP) bal arılarının içinde JH 14 tepkiler aracılık bir transkripsiyon faktörü olarak hizmet edebilir vitellogeninin (VG): Biz iki genin hedef. Vg ve JH bir geri besleme döngüsü 15 birbirlerine düzenleyen ve bal arısı davranışsal düzenleme 9 katılmaktadırlar. Çift gen demonte kullanarak, kafasını karıştırmak Vg hem JH yolları, ve ortaklaşa bal arısı davranışı ve fizyolojisi ve nasıl vg, USP ve JH 9 etkileşim nasıl etkilediğini keşfedin.
Tat algısı bal arısı sosyal davranış 16 için bir davranış belirleyicisidir. Yüksek tat algısı ile davranış gelişimi, yuva arı davranışsal olgun hızlı ve genellikle yaşamın erken dönemlerinde yem açısından ve polen 16,17 toplamak için tercih. Rağmen düzenleyici mtat algısı altında yatan echanisms çalışmalar tat algısı iç enerji metabolizmaları 9, hormonal salgı 18,19 ve biyogenetik amin 20 yollarının bağlantılı olduğunu göstermiştir, hala belirsiz. Vg ve JH hem oransal tat algısı 7,21 önemli hormonal düzenleyicileri vardır. Laboratuvarda, bal arıları içinde tat algı bir varyasyon farklı sakaroz çözümler için burnumun uzantısı yanıt (PER) test ederek değerlendirilebilir. Her bir arı 0.1 bir seri artan konsantrasyonu, 0.3, 1, 3, 10,% 30 sakaroz ve ardından bir damla su ile onu antenler iki dokunularak test edilmiştir. Su veya sakaroz bir damlacık her antene dokunulduğunda bir arı tamamen onun hortum uzatırsa bir olumlu yanıt olduğunu kaydetti. Çözümler olumlu yanıtların sayısına göre, her bireyin tat algı seviyesi 16 belirlenebilir. Bununla birlikte, uygulama başına g ölçüm ile sınırlı değildirustatory algı. BAŞINA ayrıca doyma vs açlık gibi arıların metabolik durumunu test etmek için etkili bir yöntemdir. Sakaroz daha fazla yanıtları ile arılar genel olarak daha aç (Wang ve Amdam, yayınlanmamış veri) bulunmaktadır. Ayrıca, PER paradigma bal arıları ilişkisel öğrenme ve hafıza da kullanılabilir. Bu durumda arılar bir koku ile sakaroz su varlığı ilişkilendirmek için eğitilecektir. Arılar dernek öğrenmek, koku sadece varlığı sakaroz 22,23 ile ödüllendirmek olmadan olumlu bir hortum tepki uyandırmak olabilir. Bu videoda, bir önceki çalışmada 9 vg ve USP çift demonte ile bağlantılı olan tat algısı değerlendirmek için PER gerçekleştirmek için nasıl gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bölüm 1: RNAi-aracılı çift gen demonte
1. dsRNA Sentez
- Vg, USP ve bal arısı genomunda değil bir kontrol kodlayan gen yeşil floresan proteininin (GFP) hedef dsRNAs tasarımı astar: astar çevrimiçi özgür yazılım Primer3 (kullanılarak tasarlanmıştır http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
- vg, USP ve GFP için dsRNA sentezi: in vitro transkripsiyon için Promega'dan kullanım RiboMax T7 RNA üretim sistemi.
- dsRNA arıtma:
- Denatürasyonu ve renatürasyon: ısı 85 dsRNA ° C 5 dakika ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakın için.
- DNaz I tedavi: Her dsRNA reaksiyon içine 1 ul DNaz Ben ekleyebilir ve tüpler hafifçe vurarak karıştırın. 37 ° C'de 15 dakika inkübe ° C.
- Her reaksiyon içine LS, ve yavaşça inv ile karıştırın - 150 ul nükleaz içermeyen su ve 750 ul Trizol ekletüp erting. 30 5 dakika için örnekler inkübe ° C.
- Her numune içine 200 ul kloroform ekleyin. 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın. 4 12,000 xg'de 15 dakika boyunca örnekleri santrifüj ° C
- Her yeni bir tüpe süpernatant faz transfer ve her tüpe 500 ul, izopropil alkol ekleyin. Ters tüp ile karıştırın. -20 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe karışımı 4 12,000 xg'de 10 dakika boyunca bu Santrifüj ° C
- Süpernatantı ve pelet yıkamak için 1.000 ul% 75 etanol kullanın. 4 de 7,500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj işleminden geçirilmesinden sonra tüp ° C kuru hava dsRNA pelet ve topak, çözünmesi için nükleaz içermeyen su kullanın. Gen aşağı düzenlemenin etkinliğini sağlamak için, dsRNA konsantrasyonu -10 yaklaşık 9 mg / ml olmalıdır.
2. dsRNA Karın Enjeksiyon
Çift gen demonte için, iki strateji vardır: 1) tek bir enjeksiyon: iki genin karışımı dsRNA ve inject karışım, 2) iki günlük enjeksiyon: İlk gün bir gen hedef ilk dsRNA enjekte ve ikinci gün aynı arıların içine ikinci dsRNA enjekte.
- Chill yeni 1-2 dakika süreyle 4 ° C buzdolabında arılar ortaya çıktı. Arılar hareketsiz zaman, karınları ve thoraces arasında geçti böcek işaretçilerine katı mum dolu Petri kapları üzerinde paralel olarak 3-4 arılar monte.
- 4 ° C buzdolabında tekrar arılar soğuk. Arılar tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. Yaklaşık 1-2 dakika sürer. Arılar gevşek bakmak gerekir. Arılar kıvrılmış veya çarpılmış hale gelirse, onlar çok uzun kaçınılmalıdır soğutulmuş anlamına gelir. Soğutma çok fazla yüksek mortalite neden olur, ancak herhangi bir hareket yara ve ölüm büyüklüğü arttıkça tam immobilizasyon önemlidir.
- Bir Hamilton mikro şırınga bir tek 30 G iğne (BD) koyun. 3 ul dsRNA alın ve şırınga hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. İğne dama önlemek için, karında bir tarafına yerleştiriliriç organları ging. DsRNA emilmesi için izin vermek için yavaş yavaş şırınga pistonu basın. DsRNA çok yapışkan olduğu için, tamamen şırınga ihraç edilecek 2-3 saniye sürer. Tamamen piston aşağı iterek sonra, 4-5 saniye yara iğne bırakın. Enjeksiyon sonra 3-5 saniye arılar dikkat edin. Yaradan bir hemolimf damlacık sızıntı yaparsa, arı atın.
- Farklı tedaviler tekabül eden thoraces işaretlemek için farklı renkler kullanın. Tek enjeksiyon stratejisi kullanılmıştır, bu noktada, arılar 1 saat gözlem sonra bir koloni geri yerleştirilebilir. İki günlük enjeksiyonu strateji kullanılmıştır, ancak ilk dsRNA enjekte edildikten hemen sonra, arılar yan üzerinde temin bal ile bir silindir örgü kafes konulmalıdır ve 34 'de bir inkübatör içinde tutulur ° C ve% 80 nem .
- İkinci gün, örgü kafeslerde arılar soğuk ve balmumu plakaları bunları monte etmek için adımları 2.2 ve 2.3 izleyin. Bu tarif olduğu gibi ikinci dsRNA ile enjeksiyon yapınAdım 2.4 yatak.
- Arılar 1 saat boyunca oda sıcaklığında kurtarmak ve bir koloni içine tanıtalım.
Not: Nakavt etki kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) ve western blotting ile tespit edilebilir. Genel olarak, yok etme yararı değişmektedir ve pek çok faktöre bağlıdır. Çalışmamızda, çift gen demonte 7 gün tek enjeksiyonları ve iki günlük enjeksiyonlar sonra tespit edilebilir.
Bölüm 2: Hortum uzantısı yanıt (PER) testi
1. Hive gelen arı Toplama
Enjeksiyon gün sonra 6, bir sigara içen kullanmadan kolonisinden tedavi arılar toplamak. Metal örgü silindir kafeslerde arılar toplayın. Her kafeste 3 arılar tutun.
2. PER için montaj Arılar
Tamamen hareketsiz kalıyor ° C kadar 4 de arılar soğutun. Özel PER için tasarlanmış plastik bir tüp içine dikey olarak arı monte edin. Istimal tarafından tüp içinde karın tutung iki küçük bant parçaları, ve tüpün dışarı çıkmış kafa tutun. Küçük plastik sütun iki sıra ile bir raf üzerinde tüpler koyun ve bir kimlik numarası ile her bir tüp (arı) atayın. Daha sonra bir kuluçka (34 ° C ve% 80 nem) içine raflar üzerinde tedavi arı koymak ve 2 saat için inkübatör saklayın.
3. Sukroz Water Solutions Bir Seri hazırlanması
% 0,% 0.1,% 0.3,% 1,% 3,% 10 ve% 30 sakaroz su solüsyonları hazırlayın ve 15-20 G iğne ile enjektörlere çözümler yükleyin.
4. Analiz başına
% 0.1,% 0.3,% 1,% 3,% 10 ve% 30 sakaroz su çözümleri olan 0% çözelti (su) bir damlacık ile arı antene dokunmayın. İlk su ile arı ve her bir test çözeltisi arasındaki aralık olarak en az iki dakika kullanılır izin verir. Bu nedenle, genellikle her deneme için en az 20 arı var. Bir arı tamamen onun hortum uzanıyorsa, olumlu bir yanıt sayılır.
5.Veri Yönetimi
Tat yanıt skoru (GRS) için her birey için toplam olumlu tepkiler Özetle. Verilere uygun istatistiksel analiz.
Bölüm 3. Gen demonte doğrulama
Yağ organları 7-günlük tedavi arıların başka bir kümesinden disseke edilir. Standart bir Trizol prosedür DNase I Tedavi 24 tarafından takip edilir RNA çıkarılması için kullanılır. Vg ve USP gen ifadesi iki adımlı bir QRT-PCR. Aktin ile analiz edilir, farklı dokularda ifade stabil olduğundan, bir referans gen olarak kullanılır bal arıların. VG ve USP gen için yayınlanan gerçek zamanlı PCR primerleri, bu deney 24 kullanılır. Veri Delta-Delta CT yöntemi 25 kullanılarak analiz edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek enjeksiyon ve iki günlük enjeksiyon stratejileri hem önemli ölçüde bal arıları içinde transkript düzeyleri VG (Tek yönlü ANOVA, p <0.001) (Şekil 2A) ve USP (Tek yönlü ANOVA, p <0.001) (Şekil 2B) azaltılmış dsRNA sonra altı gün enjekte edildi. DsRNA karışımı ile tek enjeksiyon ve VG birinci ve USP ikinci (vg / USP) ile iki günlük enjeksiyon kullanarak USP transkript bastırılması usp ilk ve VG ikinci (USP / vg) ile iki günlük enjeksiyon daha düşüktü (Post-hoc analiz, s karışım vs USP / vg = 0.013, p vg / USP vs USP / vg = 0.019).
Çift demonte arılarda GRS GFP kontrolü arılar (Student T testi, p = 0,0496) (Şekil 3) göre anlamlı derecede yüksek bulundu.
Şekil 1. RNA girişim (RNAi) / hortum uzantısı yanıt (PER) testi. 50 yeni ortaya çıkan arıların Dört gruplarının Akış Şeması veya farklı kombinasyon stratejileri kullanarak çift zincirli vitellogeninin RNA (dsRNA) (VG) ve Ultraspiracle (USP) enjekte edildi bal arısı genomunda yok yeşil floresan proteininin (GFP) geninin dsRNA ile. Arılar sonrasındaki bir kovan geri yerleştirildi ve 6 gün sonra toplandı. Grup başına on altı arı gerçek zamanlı PCR kullanarak gen demonte doğrulama için toplanan, ve grup başına otuz burnumun uzantısı yanıt (PER) tahlil için idi. 'GFP dsRNA' GFP dsRNA enjekte arılar gösterir; 'vg + USP karışımı' olarak arılar gösterirvg ve USP dsRNA karışımı ile ya maruz, 'vg / USP' sonra ikinci gün USP dsRNA enjekte ilk gününde vg dsRNA enjekte arılar, gösterir; 'USP / vg' üzerinde USP dsRNA enjekte arılar gösterir İlk gün ve ikinci gün vg dsRNA enjekte.
Şekil 2. Gerçek zamanlı PCR kullanarak çift gen demonte doğrulama. Tedavi arıların karın yağ vücutta dönüşüm mRNA göreceli değeri (± SEM ortalama) açın. MRNA göreceli değeri Delta-Delta CT yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. (A) Vg ifade 6 gün dsRNA enjeksiyonları sonra. Vg transkript önemli üç çift k tarafından aşağı düzenlenmiştir nockdown yaklaşımlar (Tek yönlü ANOVA, p <0.001). 6 gün dsRNA enjeksiyonları sonra (B) USP ifade. USP transkript önemli üç çift demonte yaklaşım (tek yönlü ANOVA, p <0.001) azalmıştır. Ancak, dsRNA karışım ve vg / USP enjekte arılar içinde USP ifade USP / vg (Post-hoc analiz, s karışım vs USP / vg = 0.013, p vg / USP enjekte arılar bu çok daha düşük oldu vs USP / vg = 0.019), vg vg ve JH düzenleyici döngü birincil düzenleyici olabileceğini gösteren. 'RQ' hedef gen transkript göreceli miktar seviyesini gösterir. Bar üzerinde farklı harfleri tedavi grupları arasında önemli farklılıklar göstermektedir.
ig3.jpg "/>
Şekil 3,. Burnumun uzantısı yanıt (PER) yöntemi kullanılarak tat yanıt skoru (GRS). VG ve USP dsRNA karışımı enjekte edildi arılar sakaroz daha duyarlı olduğunu gösteren, GFP kontrol grubuna göre daha yüksek GRS vardı. Bar üzerinde farklı harfleri tedavi grupları (Student T testi, p = 0,0496) arasında önemli farklılıklar göstermektedir.
Şekil 4. Olası düzenleyici gen ağları vg ve USP çift demonte yaklaşımla ortaya. Çocuk hormon (JH) bal arısı beyinde üretilen ve hemolimf için salgılanır. Vitellogeninin (Vg) vücut yağ hücreleri tarafından üretilen bir yumurta sarısı proteini öncüsüdür. Vg ve JH metabolik Physiol düzenleyen bir geri besleme döngüsü vardırogy, tat algı ve bal arıların tercih yiyecek arama ve yiyecek arama başlama yaşı. Çalışmalar Ultraspiracle (USP) JH için varsayılan bir reseptör ve bir transkripsiyon faktörü olarak görev olabileceğini düşündürmektedir. Vg ve USP Bizim iki demonte bir vg tek demonte daha JH daha büyük bir artışa neden Biz VG ve USP çift demonte bulundu. VG VG, USP ve JH arasındaki ilişkileri. 1 merkezi rol oynar ortaya ve bir USP tek devirme etti JH herhangi bir değişiklik neden yoktu. Bu Vg JH üretimini engeller sadece önerir, ama usp demonte (A) JH bir geri tepki engeller. Çift knockdowns olarak, Vg daha düşük bir inhibisyonu JH üretim sonuç dramatik artışın VG demonte ve USP demonte (B). 2 kaynaklanır azaltılmış bir JH transdüksiyonu ile telafi edici bir tepki neden. Biz USP bulunduvg vg USP mRNAto kendi dsRNA duyarlılığı bastırır düşündüren, öncelikle veya aynı anda downregüle iken transkript bolluk daha USP dsRNA azalmıştır. Nasıl vg RNA girişim (RNAi) dahil edilebilir? Vg bal arısı bağışıklık savunma ve RNAi antiviral doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir parçasıdır düzenler. Daha önceki çalışma argonaute 3 (GB19389, piwi), RNA bağlı susturma kompleksi (RISC) önemli bir bileşeni, bal arısı sosyal davranış (tat algısı, başlangıç yaşı tercih yiyecek arama ve yiyecek arama) etkileyen aday genler biridir, gösterir Vg / JH modülü tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bir olasılık Vg RISC (A) 'nın aktivitesini etkileyen proteinleri argonaute bastırmak olmasıdır. Vg downregüle olduğunda, USP dsRNA daha verimli USP mRNA (B). 3 aşağılamak yapabiliyor. Bizim iki demonte çalışma aynı zamanda USP yapar ortaya koymaktadırne tek usp demonte vg transkript bolluk etkiler, ne de çift vg ve USP demonte vg transkript daha da azalmasına neden olur, çünkü yağ vücutta Vg üretim JH inhibitör etkisi aracılık değil. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmamız aynı anda yetişkin böcekler iki gen yıkmak için ilk çabadır. Sonuçlarımız dsRNA enjeksiyon (tek enjeksiyon ve iki günlük enjeksiyon) iki strateji çift gen baskılanması ve vg ve USP aynı anda gen susturulması için geçerli olan 6 gün arıların 8,9 içine dsRNA enjeksiyon sonra test edilebilir olduğunu göstermektedir. Ancak, gen demonte etkinlik hücreleri veya organları tarafından hedef gen, protein devir oranları ve dsRNA alımı verimlilik transkript düzeyine bağlı olarak farklı böcek türü değişir. Buna ek olarak, RNAi etki doza bağlıdır. Biz yeni ortaya çıkan arı iyi 4 ul dsRNA kabul edebileceği bulundu, ancak fazla 4 ul dsRNA enjekte ise ölüm hızla artmıştır. Bu nedenle, iki günlük enjeksiyon stratejisi, enjeksiyon hacminin yüksek miktarda gerektiren bir deney için tek bir enjeksiyon daha uygun olabilir.
Burada, çift gen demonte 9
Örneğin Vg ve JH bal arısı fizyolojisi 9 ve davranışsal olgunlaşma 26,27 düzenleyen bir geri besleme döngüsü vardır. Önceki çalışmalar JH topikal uygulama vg ifade 29 azaltabilir ise vg gen demonte, bal arıları 28 JH düzeyini artırmak olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, çalışmalar USP JH için bir varsayılan reseptör olduğu ileri sürmüşlerdir, ve bir transkripsiyon faktörü 14,30 olarak JH yanıtları aracılık edebilir. Ancak, ne vg JH titre modüle ve USP JH tarafından vg düzenlenmesinde yer olup olmadığını hala tam olarak anlaşılamamıştır. Çift demonte yaklaşımı kullanarak, vg, USP ve JH (arasında ayrıntılı ilişkileri keşfettiler
BAŞINA bal arısı sosyal davranış 35 gelişimi için bir belirleyici olarak kullanılmıştır bal arılarının, içinde tat algı ölçmek için standart bir testtir. Şeker yüksek hassasiyet ile arıların genellikle yaşamın erken dönemlerinde yiyecek arama başlatmak ve polen toplamak için tercih. Tat algısı da diğer büyük ölçekli davranış çalışmalar yapılmaktadır önce sosyal davranışları üzerinde tedavi etkisi tahmin etmek için test edilebilir. Ayrıca, doyma ve açlık seviyelerini belirlemek için kullanılabilir PER tat algısı, iç metabolik devlet nedenle 9 ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Ayrıca, PER koku koşulları ile eşleştirilmiş öğrenme eğitim için kullanılırbal arıları ve bellek. Topluca, tahlil BAŞINA bal arısı davranışı ve metabolik fizyoloji eğitim için çok yararlı bir tekniktir. Bununla birlikte, yöntem BAŞINA 36 taşıma duyarlıdır. Örneğin, soğutma ile anestezi veya CO 2 vardı arılar kontrol 36 daha sakaroz daha duyarlı. Aynı zamanda, başına gün boyunca değişir ve çevre koşullarına ve stres duyarlıdır. Bu nedenle, çevre ve deney sırasında tutarlı işlemleri tutmak için çok önemlidir. Genel olarak, biz sabah PER bitirmek ve önümüzdeki günlerde aynı programı takip. Biz genellikle 8:00 erken sabah arılar toplamaya başlamak ve PER için hazır almak için 3 saat sürer. BAŞINA ihtiyaçlarını birkaç gün boyunca yapılacak, bu durumda çevre değişiklikleri kısa sürede bitirmek için önemlidir. En az 2 dakikalık aralıklarla farklı concentrati arasında tutulmalıdır çünkü PER gruplar halinde alınması gereken ve her grup 20'den fazla arı içermelidirsukroz solüsyonunun ons. Biz grup başına 75-100 arı yapmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar deney yardım için Erin Fennern teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Norveç araştırma Konseyi (180504, 185.306 ve 191.699), PEW Charitable Trust ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA P01 AG22500) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
