Summary
Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina de cólera que no significativa y adversamente afectan la supervivencia celular mediante la solubilización de los ácidos grasos y la toxina y su uso en ensayos de supervivencia celular.
Abstract
El papel positivo de los ácidos grasos en la prevención y alivio de enfermedades no humanos y humanos han sido y siguen siendo ampliamente documentada. Estos papeles incluyen influencias sobre las enfermedades infecciosas y no infecciosas, incluyendo la prevención de la inflamación, así como inmunidad de la mucosa a las enfermedades infecciosas. El cólera es una enfermedad intestinal aguda causada por la bacteria Vibrio cholerae. Se produce en los países en desarrollo y si no se trata, puede causar la muerte. Si bien existen vacunas para el cólera, que no siempre son eficaces y son necesarios otros métodos preventivos. Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina del cólera a través del ratón BALB / C macrófagos y células epiteliales intestinales humanas, respectivamente. Se solubilizan los ácidos grasos anteriores y ensayos de proliferación de células utilizadas para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de los ácidos grasos que no sont perjudiciales para la viabilidad de las células del epitelio intestinal humano. Se solubiliza la toxina del cólera y lo usamos en un ensayo para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de la toxina del cólera que no disminuya la viabilidad celular estadísticamente en BALB / C macrófagos.
Encontramos las concentraciones de ácidos grasos óptimas para ser entre 1-5 ng / l, y que la toxina del cólera que ser <30 ng por tratamiento. Estos datos pueden ayudar a futuros estudios que tienen como objetivo encontrar un papel mucosa protectora para los ácidos grasos en la prevención o alivio de las infecciones por cólera.
Introduction
Los beneficios para la salud de los ácidos grasos, como el ácido oleico, linoleico y linolénico han sido y continúan siendo documentado. Por ejemplo, el ácido oleico ayuda a facilitar la penetración de los fármacos lipófilos en el 1,2 cuerpo, reduce la enfermedad cardiaca coronaria en un 24% cuando se sustituyen para los ácidos grasos saturados 3, y se utiliza para tratar enfermedades metabólicas tales como la adrenoleucodistrofia 4 que es una X-vinculados desorden genético del metabolismo de los ácidos grasos. . Mientras que un precursor necesario para el ácido araquidónico en los mamíferos, el ácido linoleico (a diferencia del ácido oleico) no es sintetizada por el cuerpo y debe ser obtenido a través de fuentes externas, tales como por el consumo de semilla de lino 5 Los estudios muestran varios efectos beneficiosos para la salud de ácido linoleico, tales como: propiedades anti-envejecimiento para la piel; 6 propiedades anti-inflamatorias, 7 reducción de la proliferación de células de carcinoma de colon y de próstata; 8 y la capacidad de luchar contra la obesidad y la promoción o. f salud cardiovascular 9 ácido linolénico juega un papel en la reducción de la inflamación periodontal, tromboxano 10 y la modulación y la biosíntesis de prostaciclina. 11
Arpita 12 estudió la influencia de los ácidos grasos biliares y el colesterol en V. expresión cholerae 's de factores de virulencia y la motilidad. Yamasaki 13 indica que el extracto de metanol de chiles rojos, y otros compuestos extraídos naturalmente, lo que potencialmente puede reducir la producción de la toxina del cólera. Es concebible que considerar el uso de los productos alimenticios que son ricos en los ácidos grasos anteriores (tales como semillas de lino) en la prevención y el alivio de una enfermedad infecciosa, como el cólera a través de proporcionar inmunidad de la mucosa. Hemos llevado a cabo investigaciones para solubilizar los ácidos grasos y para determinar, mediante ensayos de proliferación celular, la concentración máxima de ácidos grasos que las células epiteliales intestinales humanos pueden tolerar sin efectos perjudiciales sobre la ceviabilidad ll. La hipótesis de que los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan un efecto beneficioso sobre la viabilidad celular a concentraciones más bajas, pero que a concentraciones más altas que a ser tóxico para las células. También se solubiliza la toxina del cólera y se determinó la concentración máxima de la toxina del cólera que BALB / C macrófagos de ratón pueden tolerar sin una disminución significativa en la viabilidad celular. Planteamos la hipótesis de un efecto tóxico de la toxina del cólera en la viabilidad celular, incluso a muy bajo nivel. El método de solubilización de una toxina del cólera y su uso para determinar la cantidad máxima de la toxina que las células pueden tolerar sin una disminución significativa en la supervivencia proporciona una ventaja para futuros estudios. Por ejemplo, una combinación de las metodologías anteriores se puede utilizar para determinar si los ácidos grasos proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra las infecciones de cólera. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta metodología racional y no ha sido explorado.
Nos discuss cómo nuestros datos preliminares pueden ser utilizados en investigaciones posteriores para determinar si los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra la infección por el cólera.
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Protocol
1. Cultivo de Tejidos
- Usa los macrófagos Mus musculus (ratones BALB / c) para las determinaciones de la toxina del cólera. Inicialmente, la cultura toda M. células musculus siguiendo las instrucciones del proveedor.
- Propagar BALB / c las células de ratones en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con L-glutamina completado con 10% de suero fetal bovino, y 1% 1.640 medios de comunicación de base de antibiótico / antimicótico o el medio RPMI completado con 10% de suero bovino fetal, 5% de L-glutamina, y 1 % de reactivo de antibiótico / antimicótico.
- Se cultivan las células en 75 cm 2 frascos con tapas de ventilación corning a 37 ° C, 95% de aire y 5% de CO 2.
- Llevar hasta las células epiteliales intestinales humanas dentro de las 24 horas de la entrega según las instrucciones del fabricante para la determinación de las determinaciones de ácidos grasos.
- Propagar las células epiteliales intestinales humanas en 75 cm 2 frascos de corning con tapas de ventilación en HybriCare medios completado con 10% de SFB y 30 ng / ml EGF humano a 37 º C. No use antibióticosReactivos / antimicóticos como por las instrucciones del fabricante.
- Dividir todas las células (01:03) en aproximadamente 70% de confluencia.
- Congelar y abrir todas las células de todo el estudio el uso de protocolos estándar de congelación.
- Nota: Para la determinación de la concentración de mayor escala de los ácidos grasos, utilice el crecimiento más rápido, más fácil de mantener, los macrófagos de ratón inicialmente. Para la determinación de la concentración de ácidos grasos escala fina, utilice las células epiteliales humanas. Utilice los macrófagos de ratón para todos los tratamientos de toxina del cólera (véase el debate).
2. Ácidos grasos y Tratamientos toxina del cólera
- Transferir los ácidos oleico, linoleico y linolénico desde proporcionado por la compañía ampollas de vidrio a viales de vidrio esterilizados.
- Transferir cada ácido graso a un tubo Eppendorf esterilizado por separado y se disuelven primero en etanol al 100% a una dilución de 1:06, y luego en medio RPMI 1640 incompleto para una concentración final de 10 g / l.
- Vortex cada solución y transfer a viales de vidrio para el almacenamiento en el congelador (-20 ° C).
- Células de la placa en células 2500 / pocillo en 96 placas de cultivo de tejidos.
- Agregue los medios completos necesarias para que el volumen total de 200 l para el tratamiento de las células con ácidos grasos en la preparación de ensayos de MTT.
- Después de un período de proliferación de 24 horas, eliminar los medios de comunicación y reemplazarlo con medio fresco.
- Añadir las concentraciones adecuadas de cada ácido graso a ensayar a los pozos (ver resultados). Añadir medio completo para llevar el volumen total y de 200 l.
- Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT.
- Disolver la toxina del cólera en PBS a una concentración de 1 mg / ml de alícuota de la solución y en crioviales y almacenar los crioviales a 2-8 ° C.
- Para los tratamientos de células, diluir la toxina 1:100 en PBS esterilizado (pH 7,4) o incompleta DMEM para una concentración de trabajo final de 1 ng / l.
- Para el tratamiento de las células con la toxina del cólera enpreparación para ensayos de MTT, las células de la placa como se describe anteriormente.
- Después de un período de proliferación de las 24 horas, agregue las concentraciones adecuadas de la toxina del cólera (por nuestras concentraciones, ver resultados) a ensayar a los pozos siguiendo los procedimientos que se utilizan en aplicaciones de ácidos grasos (arriba).
- Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT.
- Como (c positivo en todo el documento) positivo y el control negativo (negativo c), tanto para el ácido graso y tratamientos de la toxina del cólera, las células se incuban con medio completo y etanol al 70%, respectivamente.
- Para todas las muestras y los tratamientos utilizan un mínimo de tres repeticiones (n = 3), con más repeticiones para los controles positivos (n = 6 en este estudio).
3. Ensayo de MTT
- Hacer una solución madre de MTT a una concentración de 2,5 mg / ml.
- Retirar la solución en cada pocillo de la placa de 96 pocillos a ser probado y reemplazarla con 200 l de solución de los medios de comunicación completo fresco.
- Anunciod 10 l de la solución de MTT a cada pocillo.
- Incubar la placa a 37 ° C durante 3-4 horas.
- Descartar la solución de los medios de comunicación y añadir 100 ml de HCl 0,04 M en isopropanol a cada pocillo.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.
- Transferir la solución de cada pocillo a un nuevo tubo de centrífuga.
- Centrifugar a 20.000 xg, a temperatura ambiente, durante 1 min, o hasta que se formó un precipitado.
- La transferencia entre 20-40 l de cada muestra a un lector de microplacas.
- Leer la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrofotómetro.
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Representative Results
Determinación de la concentración óptima de ácidos grasos
La concentración óptima para los ácidos grasos se define como la concentración máxima a la que el crecimiento celular es comparable o superior a la de las células de control, con relativamente baja variabilidad en los resultados. Para determinar la concentración óptima de oleico, células de ácidos linoleico y linolénico se trataron inicialmente con concentraciones variables de cada ácido graso en incrementos grandes y más tarde con incrementos más pequeños. Figura 1 muestra la supervivencia de las células representa como una función del control positivo para los tratamientos utilizando aumento de las concentraciones de los ácidos grasos. Es evidente que las células no toleran concentraciones de por encima de 100 ng / l para cualquiera de los ácidos grasos. Un ANOVA de una vía mostró que para cada uno de los tratamientos, uno o más de los medios son diferentes de los otros (p <0,001). Una prueba post-hoc (Tukey) mostró que el ácido oleico todos los tratamientos, exceptoel 1 ng / l eran diferentes de los del control positivo. Curiosamente, debido a la alta variabilidad, este tratamiento no era marginalmente significativamente diferente del control negativo tampoco. Para tanto los ácidos linoleico y linolénico, ANOVA de una vía mostró que al menos una media es diferente que las otras (p <0,001). Prueba post-hoc de Tukey reveló que la media del tratamiento de 10 ng / l para el ácido graso no es significativamente diferente del control positivo, pero son del control negativo (p <0,05).
Este experimento se repitió para las concentraciones que eran inferiores a 100 ng / l, en incrementos de 10 ng / l (hasta 70 ng / l, el uso de células epiteliales humanas). La supervivencia celular se proporciona para cada concentración en la Figura 2. Para el ácido oleico (Figura 2a), ANOVA de una vía mostró que uno o más de los medios eran diferentes (p <0,001). Sin embargo, es sólo los tratamientos en concentraciones más altas (40 y 50ng / l) que rindió significa estadísticamente diferente de la del control positivo. Curiosamente, las diferencias observadas se debieron a un aumento de la viabilidad celular (con más variabilidad, Figura 2a). Una forma ANOVA arrojó resultados similares a los ácidos linoleico y linolénico. Específicamente, ninguno de los medios de tratamiento eran diferentes de la media del control positivo. Una vez más, la variabilidad parece aumentar para algunas de las concentraciones más altas (Figuras 2b y 2c).
Determinación de la concentración óptima de la toxina del cólera
La concentración óptima para la toxina del cólera se define como la concentración a la que la viabilidad celular no se ve afectada o sólo comienza a disminuir en comparación con las células no tratadas. Para evaluar la concentración mínima de la toxina del cólera que disminuye mínimamente la viabilidad celular, las células se trataron inicialmente con concentraciones variables de la toxina del cólera en grandes incrementalts y más tarde con incrementos más pequeños Figura 3a muestra una tendencia a la disminución de la viabilidad de la supervivencia celular como resultado de tratamientos de toxina de cólera para los niveles de toxina en incrementos relativamente grandes (entre 100-1.000 ng, R 2; = 0,5436).. Como era de esperar, la viabilidad celular fue muy variable para cada tratamiento (Figura 3a). La gran variabilidad observada en la viabilidad resultó en ninguna diferencia significativa entre la media de nuestro control positivo con cualquiera de los tratamientos (ANOVA de una vía). Con base en estos resultados, se determinó que los niveles de toxina <100 ng debe ser probado aún más. Figura 3b muestra la viabilidad celular de los tratamientos de nivel de toxina más pequeñas. La viabilidad celular es altamente variable para casi todas las concentraciones de la toxina, aunque se observó un ligero aumento en la viabilidad como resultado de los tratamientos. Estos aumentos (Figura 3b) no son estadísticamente significativas para ninguno de los tratamientos en comparación con la media del control positivo (ANOVA, Tukey).
Figura 1. Determinación de la concentración de ácidos grasos utilizables:. Efecto de diferentes concentraciones de los ácidos grasos en mayores incrementos (100-1.000 ng / l) para el ácido oleico, ácido linoleico y linolénico Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Fine escala determinación de la concentración de ácidos grasos:. Efectos de concentraciones variables de los ácidos grasos en incrementos más pequeños (10 ng / l) sobre la supervivencia de células del epitelio intestinal humano células epiteliales intestinales fueron tratados con varyiconcentraciones de ng oleico (a), ácido linoleico (b) y ácido linolénico (c). El control positivo es las células tratadas sólo con medio completo, y el control negativo con etanol al 70%. Para cada ensayo, n = 3 para todos los tratamientos, excepto el control positivo (n = 6). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Determinación de las concentraciones de la toxina del cólera utilizables basado en la evaluación de la aplicación de diferentes concentraciones de la toxina del cólera en la supervivencia de los macrófagos del ratón:. Macrófagos de ratón fueron tratados con concentraciones variables de la toxina del cólera en incrementos mayores (a) a continuación, otras más pequeñas (b) El control positivo es células tratados sólo con medio completo, y el aire negativoontrol con etanol al 70%. Para cada ensayo, n = 3 para todos los tratamientos, excepto el control positivo (n = 6). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
La Figura 4. Experimental diseño determinación de ácido graso apropiado y concentraciones de toxina para su uso en estudios futuros: Los lisados celulares se puede utilizar para tratar los macrófagos y la dinámica de citoquinas se puede analizar cualitativa y cuantitativamente por inmunotransferencia y ELISA utilizando anticuerpos contra citoquinas específicas como marcadores para la infección.
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Discussion
Sugerencia de la concentración de los ácidos grasos y la toxina del cólera
Aunque el mecanismo exacto de cómo los ácidos grasos mejoran la inmunidad de la mucosa es desconocida, varios estudios han tratado de investigar sus efectos beneficiosos. Nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar metodología para determinar la concentración máxima de ácidos grasos que las células pueden tolerar, así como la máxima concentración de la toxina del cólera que las células pueden tolerar sin una influencia significativa en la supervivencia celular.
Para determinar la concentración de los tres ácidos grasos (oleico, linoleico y linolénico), así como la de la toxina del cólera para el tratamiento de las células sin efecto adverso muy significativo sobre la viabilidad celular se solubiliza los ácidos grasos y la toxina del cólera y las células de cultivo de tejidos tratados a diferentes concentraciones seguidos por un ensayo de MTT para evaluar la viabilidad. Basándonos en nuestra metodología y los resultados que proporcionamos rangos de ácidos grasos y la toxina del cólera útilpara futuras investigaciones que tienen como objetivo utilizar estos ácidos grasos o la toxina del cólera (ver más abajo). Recomendamos concentraciones de 1, 5-10, y 5-10 (ng / l) para el ácido oleico, ácido linoleico, y linolénico, respectivamente, para el uso de células epiteliales intestinales humanas. También se recomienda el uso de <30 ng (por 200 l, véase métodos) de la toxina del cólera mediante BALB / C macrófagos de ratón. Reconocemos que, al menos para la toxina del cólera, no se observó ninguna diferencia significativa entre la viabilidad celular para el control positivo en comparación con los tratamientos. Sin embargo, nuestra recomendación se basa en la relativamente alta variabilidad en la viabilidad celular que se observó como resultado de la exposición a niveles más altos de toxina.
Estudios del Futuro
Los datos proporcionados en este estudio para los ácidos grasos y los niveles de la toxina del cólera se pueden utilizar en estudios futuros. Se presenta un ejemplo de una de esas investigaciones aquí.
El cólera es una enfermedad asociada con devpaíses que no cuentan con alcantarillado adecuado y las plantas de tratamiento de agua y agua potable fugarse. En 2009, se reportó un saldo de más de 3.000 por un período de cinco meses, debido a los síntomas relacionados con el cólera sólo en Zimbabwe. 14 A partir de 2011, el cólera sigue siendo una epidemia en diferentes regiones del mundo, incluyendo un brote en Haití (CDC, 2010) . Un estudio de la genética molecular en 2010 mostró evidencia de que la bacteria en este brote fue de origen nepalí. 15 La enfermedad es causada por la ingestión de alimentos o agua contaminada con materia fecal y la colonización del intestino por V. cholerae, seguido por la liberación de una enterotoxina. Mientras que las vacunas contra el cólera sí existen, que no siempre son eficaces en la prevención de la infección durante los brotes. Se necesitan intervenciones efectivas y de bajo costo para las poblaciones donde se producen brotes de cólera. Un método consiste en estudiar si las fuentes de alimentos que son ricos en derivados, tales como los ácidos oleico, linoleico y linolénicoproporcionar o aumentar la inmunidad de la mucosa contra la infección por el cólera. Funciones de inmunidad de la mucosa a través de la utilización de receptores proteicos que se encuentran en la superficie de las células, tales como receptores de tipo Toll (TLRs 16) y los dominios de unión a nucleótidos (LNR). A través de los cambios en la composición de la membrana y la liberación de ligandos que interactúan con los TLR y NLRs, la adición de ácidos grasos en el epitelio intestinal puede mejorar la función del receptor en el reconocimiento de microbios peligrosos y reclutamiento de las respuestas inmunes apropiadas. Para determinar los efectos grasos ácidos sobre la infección por el cólera, la dinámica de citoquinas, tales como la liberación de la célula de TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12, deben estudiarse más en las células epiteliales intestinales humanas que en los macrófagos de ratón (figura 4). Este conocimiento de los futuros estudios nos ayudará a comprender mejor el mecanismo por el cual los ácidos grasos podrían funcionar para prevenir la infección, con el fin de proporcionar en última instancia, las intervenciones eficaces para inhibir el cóleraunos brotes. Es posible que el tratamiento de las células con los ácidos grasos antes de la infección por la toxina del cólera va a ayudar a inducir y / o mejorar la respuesta inmune de la mucosa en el epitelio intestinal, en última instancia, el aumento de la viabilidad celular durante la infección microbiana cólera.
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Disclosures
Los autores de este estudio tienen ningún interés financiero de los resultados de este estudio. Los fondos para este estudio fue proporcionado a FT por la Universidad de Kean, sin embargo, FT es actualmente un empleado de Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Agradecemos a Paula Cobos y el Dr. Evros Vassiliou de asistencia de laboratorio y la prestación de los macrófagos de ratón, respectivamente. También agradecemos a nuestro director de laboratorio Richard Criasia de orientación y ayuda con los materiales. Por último, los autores agradecen Ramanpreet Kaur en busca de ayuda a la producción de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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