Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Summary

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Abstract

Las propiedades mecánicas de las células y la matriz extracelular (ECM) desempeñan papeles importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de células madre, la formación del tumor, y la cicatrización de heridas. Los cambios en la rigidez de las células y ECM son a menudo signos de cambios en la fisiología celular o enfermedades en los tejidos. Por lo tanto, la rigidez de células es un índice para evaluar el estado de los cultivos celulares. Entre la multitud de métodos aplicados para medir la rigidez de las células y tejidos, micro-indentación usando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) proporciona una manera de medir de forma fiable la rigidez de las células vivas. Este método ha sido aplicado ampliamente para caracterizar la rigidez de micro-escala para una variedad de materiales que van desde superficies metálicas a los tejidos biológicos blandos y células. El principio básico de este método es para sangrar una célula con una punta de AFM de la geometría seleccionada y medir la fuerza aplicada a partir de la flexión del cantilever de AFM. Montaje de la curva fuerza-sangría para el modo de Hertzl para la geometría de la punta correspondiente puede dar mediciones cuantitativas de la rigidez del material. En este trabajo se demuestra el procedimiento para caracterizar la rigidez de las células vivas utilizando AFM. Se demuestran los pasos clave, incluyendo el proceso de calibración de AFM, la adquisición de la fuerza de la curva, y el análisis de datos mediante una rutina de MATLAB. También se discuten las limitaciones de este método.

Introduction

Las propiedades mecánicas, especialmente la rigidez, de células individuales y sus matrices extracelulares que rodean (ECM) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la motilidad, la división, diferenciación, y la homeostasis del tejido. ¹ Se ha demostrado que la rigidez mecánica de células está determinada principalmente por el citoesqueleto, especialmente las redes de actina y filamentos intermedios y otras proteínas asociadas con ellos. ² Los resultados de ensayos mecánicos sobre en redes in vitro de actina y filamentos intermedios sugieren que la mecánica de células es dependiente en gran medida de la estructura del citoesqueleto y la pre-tensión en el citoesqueleto. ^3-5 Rigidez de células vivas se considera entonces como un índice para evaluar la estructura del citoesqueleto ^6, la actividad de la miosina ⁷ y muchos otros procesos celulares. Más importante aún, los cambios en las propiedades mecánicas de células también se encuentran a menudo para ser estrechamente asociadosocasionada por la diversas condiciones de enfermedad, tales como la formación de tumores y la metástasis ^8-10 Control de la rigidez mecánica de las células vivas por lo tanto, puede proporcionar una nueva manera de controlar la fisiología celular;. para detectar y diagnosticar enfermedades ^8;., y para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos ^{11 , 12}

Múltiples métodos incluyendo microrheology partícula de seguimiento, ^13-16 magnética citometría de torsión, ¹⁷ micropipeta aspiración ^18,19 y microindentación ^20-22 se han desarrollado para medir la elasticidad de las células. Partículas microrheology seguimiento rastrea las vibraciones térmicas de cualquiera de las partículas fluorescentes submicrométricos inyectados en células o marcadores de referencia dentro del citoesqueleto celular. ²³ propiedades elásticas y viscosas de células se calculan a partir de los desplazamientos de partículas medidos utilizando el teorema de fluctuación-disipación. ^14,23 Este método permite mediciones simultáneas de localespropiedades mecánicas con alta resolución espacial en distintos lugares de una célula. Sin embargo, la inyección de partículas fluorescentes en las células puede conducir a cambios en la función celular, la estructura del citoesqueleto, y por lo tanto la mecánica celular. El método de aspiración con micropipeta se aplica presión negativa en una micropipeta de diámetro varía de 1 a 5 micras para aspirar una pequeña pieza de membrana celular en la pipeta. Rigidez celular se calcula a partir de la presión negativa aplicada y la deformación de la membrana celular. ¹⁸ Este método, sin embargo, no puede detectar la distribución heterogénea de la rigidez a través de la célula. Citometría de torsión magnética (MTC) se aplica el campo magnético para generar par de torsión sobre perlas de súper paramagnéticas unidas a la membrana celular. ¹⁷ rigidez célula se deriva en este método a partir de la relación entre el par aplicado y la deformación de torsión de la membrana celular. Es difícil controlar la ubicación de perlas magnéticas en el método de MTC, y también es challenging para caracterizar la deformación de torsión con alta resolución. Microindentación se aplica un penetrador con una geometría bien definida para perforar en la célula. La fuerza de penetración y la indentación resultante en las células a menudo siguen la predicción del modelo de Hertz. Módulos de Young de las células se puede calcular a partir de las curvas de fuerza-indentación ajustándolas al modelo de Hertz. Este método ha sido ampliamente aplicado para probar las propiedades mecánicas de los tejidos y las células a pesar de sus limitaciones, tales como la incertidumbre en la determinación del punto de contacto, la aplicabilidad del modelo de Hertz, y el potencial para dañar físicamente las células. Entre los muchos dispositivos para microindentaion ^20, el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) está disponible comercialmente y se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células y tejidos vivos ^21,24-27.

En este trabajo se demuestra el procedimiento de utilizar un asilo MFP3D-Bio AFM para caracterizar la mecánica celular. AFM no enLY proporciona topografía de alta resolución de las células, pero también se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células del tejido. El principio de AFM indentación se ilustra en la Figura 1. El cantilever de AFM se aproxima a la célula desde unos pocos micrómetros más arriba; hace contacto con la célula; guiones la célula de modo que la deflexión voladizo alcanza un punto de consigna preseleccionado, y se aleja de la célula. Durante este proceso, la deflexión en voladizo se registra como una función de su ubicación, como se muestra en la Figura 1. Antes de hacer contacto con la célula, el voladizo se mueve en el medio sin ninguna desviación aparente. Cuando sangría en la célula, las curvas en voladizo y se incrementa la señal de deflexión. Los voladizos se modelan como vigas elásticas para que su desviación es proporcional a la fuerza aplicada a la célula. Al establecer la deflexión máxima en voladizo, la máxima magnitud de la fuerza aplicada a la muestra es limitada para evitar dNingún daño a las células. La porción de la curva de fuerza desde el punto B al punto C en la Figura 1, donde los guiones punta en la célula, se adaptan al modelo de hercios para extraer la rigidez celular.

Figura 1. Ilustración de la AFM microindentación e interpretación de la curva de fuerza. El panel superior muestra el movimiento de la AFM voladizo accionada por el escáner piezoeléctrico. La ubicación vertical del voladizo z y la deflexión en voladizo señal d se registra durante el proceso. El voladizo se inicia desde el punto a, unos pocos micrómetros por encima de la celda. Al acercarse a la célula, la muestra δ indentación permanece en cero hasta que se alcanza el punto B, donde la punta entra en contacto con la célula. Las coordenadas del punto b en el diagrama son valores críticospara el análisis de datos, que se denota por (z _0, d _0>). De B ​​a C, los guiones en voladizo en la célula hasta que la deflexión voladizo llega a un punto de ajuste, que se ajusta para que sea la relación entre la fuerza de penetración máxima al final del voladizo y la constante del resorte. Una vez que la señal de deflexión alcanza el valor máximo prefijado, el voladizo se retira entonces de la célula al punto d, donde a menudo ser tirado hacia abajo debido a la adhesión de la punta-de la muestra, se separa de la célula y vuelve a su ubicación inicial en el correo. El panel de la derecha ilustra la relación entre la indentación y la z grabada y la señal d. En en el panel inferior izquierdo es un gráfico de una curva representativa fuerza, la indentación máximo de un voladizo, de que la constante del resorte se mide a ser 0.07N / m, se ajusta para que sea 17 nm de manera que la fuerza máxima aplicada a la sangría muestra es 1,2 nN. Los puntos clave durante el sangrado se marcan.

Protocol

1. Calibrar la constante del resorte del voladizo

1. Cargar el voladizo en el AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es necesario limpiar el soporte voladizo con etanol antes de cualquier experimento. Esto ayudará a limitar la contaminación bacteriana de la cultura durante las mediciones de AFM.
2. Calibrar InvOLS (Inverse Sensibilidad palanca óptica). Este parámetro describe la cantidad de respuesta de fotodiodo (voltios) por nanómetro de deflexión voladizo.
3. Cargar un portaobjetos de vidrio limpio en la etapa de la muestra, a continuación, instalar la cabeza AFM y ajustar el haz de láser y la alineación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enganche la punta del AFM en el portaobjetos de vidrio.
4. Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una medición espectroscopia de fuerza con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V.
5. Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una force medición espectroscopía con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Los valores de tensión aquí son específicos para el Asilo de AFM. Este valor debe establecerse de acuerdo con las especificaciones establecidas por el fabricante.
   Después de la adquisición de datos es completa, hacer zoom en la región firme contacto de la curva de fuerza. Realizar un ajuste lineal a esta región para encontrar la pendiente, que estará en V / nm. El recíproco de este valor describe la sensibilidad óptica del conjunto voladizo-fotodiodo.
6. Cambiar la alineación del espejo a una desviación gratuita de 0 V.
7. Calibrar la constante de resorte en voladizo. Un método térmico-sintonía se utiliza para determinar la constante del resorte en voladizo ^28.
8. Después de calibrar los InvOLS, elevar el escáner fuera de la etapa de la muestra de tal manera que no hay interacciones entre la punta y la muestra.
9. Comienza la captura de los datos térmicos. Durante este proceso, la vibración térmica de la viga en voladizo es Recorded. El software AFM analiza un espectro de potencia de una vibración y se representa en una ventana de datos térmicos tales.
10. Después de unos pocos segundos de adquisición de datos, realizar un ajuste para el segmento de datos centrada en la más baja-frecuencia (resonancia fundamental) pico para determinar la constante del resorte.

2. Carga de la muestra

1. Instale el accesorio calentador del plato en el escenario AFM, si no está ya equipado.
2. Ajustar la temperatura a 37 ° C, y esperar 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable.
3. Coloque la placa de cultivo en la etapa de AFM y fijarlo con la abrazadera suministrada con el calentador de plato. Es importante reducir al mínimo el tiempo entre la retirada de la placa de la incubadora y colocándolo en el escenario, para evitar el trauma a las células. Para las mediciones de más de 30 min, se debe utilizar CO ₂ medio independiente para reemplazar el medio de cultivo normal.
4. Aplicar una pequeña gota de 37 ° C el medio de cultivo a la punta de tque AFM voladizo, y bajar la cabeza hasta la punta de AFM se acaba sumergido en líquido.
5. Uso de la cámara CCD vista superior, vuelva a alinear el haz de láser en el voladizo (la alineación en el líquido será diferente que en el aire, debido al cambio en el índice de refracción del medio).
6. Enganche la punta del AFM en una zona limpia de la placa de cultivo.
7. Realice la calibración de los InvOLS como se describe anteriormente, para la sensibilidad voladizo en el medio líquido.

Nota: a) Si las células se cultivan en hidrogeles, la calibración de InvOLS se debe realizar de antemano contra la superficie inferior de una placa de cultivo lleno de medios de cultivo celular. Al cambiar a muestras de células, la atención especial se ha de pagar para no cambiar la alineación del haz láser con el voladizo. b) InvOLS tiene que ser recalibrado cada vez que hay un cambio en la alineación láser. c) También se recomienda tomar InvOLS como el promedio del valor de varias curvas de calibración, sesde cada calibración genera un diferente InvOLS. La variación en InvOLS es, sin embargo, pequeña en comparación con el valor medio. Por ejemplo, calibrar un DNP-10 cantilever Bruker con constante 0,06 N / m de líquido en 100 veces la primavera producir un valor InvOLS media de 66,3 nm / V, con una desviación estándar de sólo 0,5 nm / V.

3. Recopilación de curvas de fuerza de sangría célula

1. Seleccione una celda para el sangrado. Con la ayuda del microscopio óptico, mover la etapa de posicionar el voladizo por encima de la celda de modo que la punta se encuentra en la región peri-núcleos. Ajuste preciso de la posición de voladizo se puede lograr mediante la aplicación de las compensaciones a las direcciones X e Y escáneres.
   Nota: El cantilever de AFM tiene que ser retirado de la superficie de la muestra mientras se mueve la etapa de la muestra para seleccionar una célula diana. Esto protege el voladizo de golpear en la muestra, ya que la superficie de la muestra puede no ser plana.
2. Cambiar a forzar el modo de Espectroscopía. Establezca la sangríacomprendida dentro de la gama de 1-10 m / seg, lo suficientemente bajas para evitar efectos hidrodinámicos.
3. Ajuste del punto de disparo de desviación, lo que limita la fuerza máxima de sangría para evitar daño a las células. Seleccionar la opción de activación relativa, que para corregir cualquier desviación en la señal de deflexión. La fuerza máxima de 2 nN es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras. Este valor, sin embargo, debe ser ajustado de acuerdo a la rigidez de la muestra. Para las muestras suaves un valor más bajo se debe utilizar para evitar la sangría excesiva a la muestra. Para las muestras de rigidez un valor alto se debe utilizar para generar indentación medible.
4. Ajustar la distancia de la fuerza lo suficientemente grande como para asegurar que la punta estará totalmente separada de la célula entre las medidas de fuerza. Por lo general, la distancia de la fuerza se establece en 5 micras.
5. Dirige el AFM para tomar una sola curva de fuerza.
6. Recoge al menos tres curvas de fuerza en diferentes lugares en la región peri-núcleos de cada célula. Aunque es beneficioso tomar múltiplescurvas en cada celda de datos estadísticos fiables, teniendo demasiadas curvas de fuerza puede conducir a cambios en la rigidez celular debido a la tensión de la sonda de AFM.
7. Cuando la recolección de datos se completa, retire la punta, y repita los pasos 3.1 a 3.6 por tantas células como sea necesario para los buenos datos estadísticos sobre la rigidez celular bajo una cierta condición de muestra. Por lo general, las células 30 se miden para cada condición.

Para caracterizar la distribución de la rigidez dentro de una sola célula, se aplica el modo de fuerza-mapa. En el modo de trabajo de ruta, establezca un tamaño de escaneado para incluir la región de interés, establecer una resolución adecuada, establecer los parámetros de sangría que las seleccionadas para las curvas de fuerza individuales, el AFM Luego de trama a través de la zona de muestreo definido y tomar curvas de fuerza individuales en cada pixel en la región de la muestra.

4. Análisis de Datos

Las curvas de fuerza registrados se analizaron mediante un procedimiento de encargo MATLAB para calcular la rigidez de células. La siguiente es una breve descripción del procedimiento de MATLAB:

1. El programa MATLAB identifica el punto de contacto coordina z0 y d0 (véase la Figura 1) utilizando un algoritmo adoptado de un método publicado por Lin et al ^29.:
2. Para cada punto de datos de la curva de fuerza, lleve a cabo un ajuste lineal de los datos a la izquierda del punto de interés, y un modelo de Hertz encaja a la derecha (con el punto seleccionado como el punto inicial de contacto), hasta el conjunto máxima muesca (200-300 nm recomendado).
3. Para cada punto, se calcula el error RMS relativa de los dos ataques y la suma de estos valores.
4. El punto que alcanza el error de ajuste total mínima es seleccionado como el punto inicial de contacto.
   Nota: El tiempo de cálculo puede reducirse mediante la aplicación de una búsqueda de sección áurea-en lugar de escaneado linealmente toda la curva de la fuerza.
5. Muestra δ deformación y la sangría de la fuerza F se calcula como:
   
6. Un ajuste de mínimos cuadrados se aplica para adaptarse a la F vs datos δ en la región de post-contacto, z ≥ z _0, para el modelo de Hertz para extraer el módulo de Young, E de la célula:
   
   , Donde v es la relación de Poisson.
   Nota: Cuando δ es más de 10% del espesor de la muestra (altura de la celda), la rigidez de células medido se ve afectada por la rigidez del sustrato. El espesor de la región perinuclear es generalmente del orden de unos pocos micrómetros. Por lo tanto, sólo los primeros 200-300 nm de F-δ curva se ajustan al modelo de Hertz.

Representative Results

La Figura 2a muestra tres curvas de fuerza representativas tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas en la superficie de plástico, gel de poliacrilamida de los módulos de Young 3000 Pa y 17.000 Pa, respectivamente. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, la fuerza de penetración en función de la deformación celular se representa en la Figura 2b. Bajo una fuerza de magnitud menor que 0,3 nN, una forma de pirámide guiones punta 3 micrómetros en una célula cultivada en un gel de poliacrilamida al 3 kPa. Por el contrario, una fuerza de más de 1,6 nN se requiere para sangrar 500 nanómetros en la célula cultivada en placa de cultivo puro usando la misma punta. Está claro a partir de este gráfico que la célula cultivada en gel de poliacrilamida suave es más suave que la célula cultivada en el plato rígido cultivo. Montaje del primer segmento (δ <30 nm) de las curvas de fuerza-δ en el modelo de Hertz da módulos de Young de estos tres células como 10 kPa, 1,2 kPa y 1,10 kPa, respectivamente. Las células de la culturplato de correo son 100 veces más rígido que las células cultivadas en geles de poliacrilamida. Solon et al. Han informado resultados similares ^25. Ellos encontraron que los fibroblastos se endurecen activamente sus citoesqueletos para que coincida con la rigidez de los sustratos que se adhieren a. Muchos otros tipos de células también se han reportado para convertirse en más rígida cuando se cultivan en sustratos rígidos ^30.

Es importante tener en cuenta que la indentación puede causar deformación plástica en las células, lo que resulta torceduras como se ilustra en la curva de púrpura. Normalmente, tales curvas se deben excluir del análisis de datos. Sin embargo, la curva todavía se puede utilizar para calcular la rigidez de células si el pliegue está más allá de la gama de ajuste de datos. Por ejemplo, el estrechamiento en la curva de púrpura se produce a aproximadamente 400 nm. Esta curva todavía se puede analizar mediante el ajuste de los datos sólo hasta δ = 30 nm para el modelo de Hertz para producir un valor de rigidez de 1,2 kPa. También es importante ajustar el "punto de disparo", de acuerdo a the rigidez de la muestra. Por ejemplo, la curva azul se toma de una célula suave cultivaron en un gel de poliacrilamida al 3 kPa. Ajuste del punto de disparo flecha relativa a los 5 nm, las sangrías AFM punta 3 micrómetros en la célula. Tal una gran indentación debe impedirse durante las mediciones de rigidez de células, ya que podría romperse la membrana celular y matar a la célula. Muchos otros factores, incluyendo la velocidad y la velocidad de adquisición de datos de la punta durante la adquisición curva de fuerza pueden afectar a la calidad de las curvas de fuerza adquiridos y por lo tanto la rigidez resultante de las células ^31. Para realizar mediciones fiables es necesario para ajustar las todos estos parámetros para adquirir curvas de fuerza "limpias" como la curva roja muestra en la Figura 2a, que tiene una parte plana de pre-contacto seguido por un aumento de parte de post-contacto no lineal.

La Figura 3a muestra una imagen de fluorescencia de un fibroblasto 3T3 en un plato de cultivo celular. La célula se transfectaron con GFP vimentina,un tipo de filamentos intermedios. AFM Fuerza-cartografía se ha realizado en este 80 micras por 80 micras área, con una resolución de 32 x 32 píxeles. El mapa rigidez resultante se muestra en la Figura 3b. La rigidez varía a través de la célula. Y, la región lamellipodium es más rígido y más heterogénea que la región perinuclear que rodea el núcleo rígido.

Figura 2. Datos de la curva de la Fuerza y la curva de fuerza-muesca analizados. A) Un conjunto de tres datos de la curva de fuerza representativas adquiridos por los fibroblastos 3T3 cultivadas en vaso (rojo), 17 en gel de poliacrilamida kPa (púrpura) y 3 en gel de poliacrilamida kPa (azul). Las curvas se desplazan de manera que el punto de contacto (Z _{0, 0} d) se encuentra en el origen (0,0) de la coordenadasistema. b) Las curvas de fuerza de indentación calculan a partir de a) y ajuste de los datos al modelo de indentación Hertz utilizando sólo los primeros 300 nm de indentación. Inserción en b) muestra la bondad de ajuste del modelo Hertz para los primeros 300 nm de sangría; círculos son datos experimentales, las líneas representan los datos de ajuste. La constante de resorte en voladizo es 0,062 N / m en este caso.

Figura 3. a) Imagen de fluorescencia de un fibroblasto 3T3 transfectadas con GFP vimentina. Sólo una parte de la célula se muestra en la imagen. La barra de escala representa 20 micras. B) Un 32 x 32 píxeles del mapa rigidez de la misma zona. Cada píxel representa 2,5 micras.

Discussion

El método de indentación AFM tiene ventajas para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas. Aunque menos sensible que la citometría de torsión magnético y pinzas ópticas, que puede medir fuerzas en el nivel picoNewton ^32, el AFM puede detectar la fuerza de resistencia de las muestras que van desde decenas de pico-Newton a cientos de nano-Newton, comparable a la gama de la fuerza que se puede aplicar a las células utilizando una micropipeta ^19. Este rango de la fuerza se ajusta a las necesidades para crear deformaciones medibles en todos los tipos de células ^19. La alta resolución espacial hace que sea posible para caracterizar en el nivel submicrónico las heterogeneidades en los tejidos y dentro de las células individuales ^33. También permite que las mediciones de células vivas en tiempo real. Varios modelos AFM diseñados para muestras biológicas pueden operar en un entorno fluido y están equipadas con etapas de muestra calentada, que proporcionan el control preciso de la temperatura, por lo que es posible mantener un medio fisiológicoambiente de las células vivas durante las mediciones. AFM indentación se ha aplicado con éxito para la medición de las propiedades mecánicas de una gama de tipos de células, ^25,34-36 y se ha utilizado ampliamente para la evaluación de los cambios en las propiedades mecánicas de las células asociadas con la diferenciación celular y en varios contextos enfermas. ^30,37

Un paso importante para calcular la rigidez de la fuerza-curva es identificar el punto en el que la punta primero hace contacto con la célula. La incertidumbre en el punto de contacto puede afectar el módulo elástico ^31. Para materiales duros, la señal de deflexión aumenta bruscamente después del contacto de la punta-muestra, y el punto de contacto se identifica fácilmente como punto de inflexión en las curvas. Tal viraje brusco, sin embargo, a menudo no aparece en las curvas de fuerza-a partir de células, debido a la rigidez de la célula baja (ver Figura 2). Un código de MATLAB se desarrolló para encontrar con exactitud los puntos de contacto en curvas de fuerzaa partir de muestras gaseosas que utilizan el algoritmo propuesto por Lin et al. ²⁹ El código puede manejar las curvas de fuerza a partir de muestras gaseosas, lo que nos permite automatizar el proceso de análisis de los datos mediante la búsqueda automática del punto de contacto y ajuste de los datos al modelo de indentación Hertz. El código MATLAB se aplica para determinar los puntos de contacto de 60 curvas de fuerza tomadas en el mismo lugar de un gel de poliacrilamida, de las cuales la rigidez fue medida a ser 7,2 kPa por mediciones de reología a granel. El código detecta puntos de contacto de estas curvas. El rango de variación en la ubicación del punto de contacto es menor que 15 nm. Sobre la base de estos puntos de contacto, la rigidez media calculada es 6,9 kPa, la desviación estándar es de 0,2 kPa, y el rango máximo de variación 0,6 kPa. Los resultados de este experimento proporcionan una medida para evaluar la incertidumbre de la rigidez medida. El 15 nm incertidumbre en los resultados de punto de contacto en una incertidumbre en la rigidez, que es menos de 10% de la media valiosae. Para geles más suaves con muy bajo nivel de señal de deflexión, la incertidumbre en el punto de contacto puede ser tan alta como 30 nm, lo que conduce a una incertidumbre en la rigidez tan alta como 30%. El código está disponible como un suplemento a este artículo.

AFM puede medir de forma fiable la rigidez que van desde menos de 100 Pa a 10 Pa ^6, que cubre la gama de rigidez para la mayoría de los tejidos y las células. Para las mediciones fiables, es importante seleccionar los voladizos AFM con constantes de resorte bien adaptado a la rigidez de la muestra. Cuando el voladizo es demasiado rígida, su deflexión es demasiado pequeño para detectar y que podría dañar la célula, y si el voladizo es demasiado blando, no será guión de la célula lo suficiente como para obtener las propiedades del material fiables y sus vibraciones térmicas puede dominar la curva de fuerza. Voladizos de 0,06 N / m, con una punta de la pirámide son aplicables a la mayoría de tipos de células cultivadas en placas de cultivo de nieve. Estos voladizos, sin embargo, no son aplicables para medir las células cultivadas ensustratos blandos. Como se muestra en la Figura 2, la célula cultivada en un gel de poliacrilamida 3000 Pa es tan suave que se requiere una indentación 3 micras para generar una deflexión de 5 nm en el voladizo. La curva de fuerza es tan plana que hay muy poca diferencia entre la pre-contacto y la región de post-contacto. Esto conduce a una gran incertidumbre en el punto de contacto y por lo tanto los valores de rigidez resultantes. El uso de un voladizo más suave mejora sólo ligeramente el contraste entre el pre-contacto y regiones de post-contacto. Para medición de tales materiales blandos, se recomiendan con grandes voladizos punta esférica. A 0,06 N / m en voladizo con una punta esférica de 10 micrómetros de diámetro se puede aplicar para medir muestras con una rigidez menor que 100 Pa. voladizos con punta esférica están disponibles comercialmente de muchos proveedores. También pueden ser por encargo por encolado microesferas de voladizos sin punta. Las puntas esféricas proporcionan mayor señal de desviación y evitar daños en la membrana celular. Hin embargo, no son aplicables para la cartografía de alta resolución de la rigidez debido a su gran área de contacto con las células. Tabla 1 proporciona una lista de las sondas de AFM recomendados para las mediciones de rigidez celulares.

Modelo	Constante del resorte (N / m)	Tipo de punta	Radio de la punta (nm)
Bruker DNP10-D	0.06	Pirámide	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pirámide	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Esfera de cristal	2000/5000/10000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Esfera de poliestireno	1000/4500/10000

Tabla 1. A sílección de sondas de AFM con constante de resorte aplicable y geometría de la punta de indentación celular.

Las limitaciones del método presentado deben también marcaron. El modelo de Hertz que se ha aplicado para ajustar los datos de indentación es un modelo simplista. Se predice la relación fuerza-sangría de muescas infinitesimales de materiales puramente elásticos de penetradores simetría axial. Algunos de los supuestos del modelo de Hertz no se aplican a la sangría celular.

El modelo asume Hertz material homogéneo y linealmente elástico, mientras que una célula es heterogénea (ver Figura 3) y no lineal elástico. En la región lamellipodium, es más bien no homogénea, debido a la estructura heterogénea del citoesqueleto de actina. La rigidez mecánica de una célula se reporta como la rigidez promedio extraído de tres o más curvas de fuerza adquiridos a partir de la región perinuclear relativamente homogénea. ^25,36 reconstituida Networks de actina y filamentos intermedios son materiales cepa de refuerzo, es decir, son más rígidas en deformaciones más grandes. ^38,39 Dicha elasticidad no lineal se ha observado para las células vivas, pero no cuenta en el modelo de Hertz. Para limitar el efecto de la elasticidad no lineal de la rigidez celular informado, sólo los primeros 300 nm de la indentación de datos se ajustan al modelo de Hertz.

También se supone en el modelo de Hertz que los materiales son puramente elástica. Sin embargo, las células y su citoesqueleto son materiales viscoelásticos con la rigidez depende de la escala de tiempo de las mediciones. En la escala de tiempo más corta, la deflexión voladizo proviene principalmente de la respuesta elástica de las células. En la escala de tiempo largo, sin embargo, la muestra se arrastra y da una respuesta más suave. La escala de tiempo de la AFM sangrado está controlado por la velocidad punta. Por lo tanto, la diferencia observada en la rigidez de la célula sólo es significativo cuando las curvas de fuerza se adquieren con la misma velo indentaciónciudad. Para extraer cuantitativamente la viscoelasticidad dependiente de la frecuencia de las células, el método AFM "fuerza de modulación" se ha desarrollado mediante la aplicación de pequeñas oscilaciones de alta frecuencia de amplitud en una indentación más grande ^21,27.

La asunción de espesor de la muestra infinita en el modelo de Hertz no se aplica para las células. Las células son típicamente de unos pocos micrómetros de espesor en la región perinuclear, y unos pocos cientos de nanómetros de espesor en la región de lamela. Se han realizado correcciones para tener en cuenta el espesor de la muestra finita. ^31,40 Los datos adquiridos de la fuerza de mapas contiene tanto los datos de sangrado y los datos de altura de la celda. Espesor de la muestra local puede calcularse a partir de los datos de altura. Futura labor se requiere para implementar las correcciones espesor de la muestra para el análisis de datos de la fuerza de mapeo.

En resumen, este trabajo presenta un procedimiento para caracterizar la rigidez mecánica de las células vivas utilizando un asilo MFP3D-Bio micr fuerza atómicaoscope. Los principios de operación de AFM y el procedimiento de análisis de datos MATLAB son aplicables a todos los demás modelos de AFM. En los últimos años, las técnicas de microscopía óptica de campo claro, incluyendo, microscopía confocal, y el total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) se han combinado con el AFM para la formación de imágenes en tiempo real de las células a los estímulos mecánicos. ^41,42 Estas configuraciones también permiten mediciones simultáneas de la mecánica celular y las imágenes de los componentes del citoesqueleto. La correlación de los datos de rigidez de la zona para la distribución de los componentes del citoesqueleto locales proporcionará información detallada sobre cómo los componentes del citoesqueleto contribuyen a la mecánica de células.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO