Summary
Visualização de dados experimental tornou-se um elemento-chave na apresentação de resultados para a comunidade científica. Geração de gravação de lapso de tempo ao vivo de embriões de crescimento contribui para uma melhor apresentação e compreensão dos processos de desenvolvimento complexos. Este protocolo é um guia para marcação celular passo-a-passo através de fotoconversão de proteína Kaede no peixe-zebra.
Abstract
Vertebrate palatogenesis é um processo de desenvolvimento altamente coreografada e complexo, que envolve a migração de crista neural craniana (CNC) células, convergência e extensão de proeminências faciais e maturação do esqueleto craniofacial. Para estudar a contribuição da crista neural craniana para regiões específicas do paladar zebrafish um SOX10: Kaede linha zebrafish transgênicos foi gerada. SOX10 fornece restrição linhagem da proteína kaede repórter para a crista neural, tornando assim o processo de marcação de uma célula mais precisa do que a tradicional corante ou injecção de ARNm repórter. Kaede é uma proteína de foto-conversível que muda de verde para vermelho após a ativação da foto e faz com que seja possível seguir as células com precisão. Os SOX10: linha transgênica Kaede foi utilizada para realizar a análise de linhagem para delinear as populações de células CNC que dão origem ao maxilar contra elementos mandibulares e ilustram homologia de proeminências faciais para amniotas. Este protocolo descreve o passos para gerar um vídeo time-lapse ao vivo de um SOX10: embrião de peixe-zebra Kaede. Desenvolvimento da placa etmoidal servirá como um exemplo prático. Este protocolo pode ser aplicado para fazer uma gravação confocal de lapso de tempo de qualquer kaede ou semelhante da proteína repórter em peixes-zebra transgénicos photoconvertible. Além disso, ele pode ser usado para capturar não só o normal, mas também o desenvolvimento anormal de estruturas craniofaciais nos mutantes de peixe-zebra.
Introduction
Fendas orofaciais representam a deformidade craniofacial mais prevalente, com 1/700-1, 000 entregas afetadas 1. Rompimento de desenvolvimento craniofacial embrionário precoce pode levar à formação de fissura de lábio e palato (FL / P). Enquanto causas para fenda sindrômica foram amplamente demonstrado, as bases genéticas e epigenéticas de formas não sindrômicas de fissuras orofaciais ainda precisa ser descoberto 2-4. A fim de compreender a etiologia e patogénese destas malformações, é necessário para elucidar o desenvolvimento de estruturas craniofaciais numa base celular.
Em todas as espécies de vertebrados células da crista neural cranianos (CNCC) migram do tubo neural dorsal para preencher os arcos da faringe, o que contribuirá para a formação das estruturas orofaciais. Rompimento de desenvolvimento da crista neural embrionária precoce pode levar à formação de malformações craniofaciais incluindo CL / P 5-7.
Em anúnciodição de semelhanças estruturais entre peixe-zebra e desenvolvimento craniofacial mamíferos (CNCCs residem nas regiões homólogas), a rede reguladora do gene é altamente conservado. Também tem sido mostrado que CNCCs desenvolver da mesma maneira entre as espécies de peixe-zebra e amniote 8, fazendo com que o peixe-zebra de um organismo poderosa para o estudo da base de desenvolvimento e genética de CL / P. Tem muitas vantagens, incluindo o tamanho pequeno, rápido e ex-utero desenvolvimento embrionário, e as taxas de reprodução de altura. Além disso, o embrião é opticamente transparente, tornando-se passível de observação de eventos complexos de desenvolvimento sob o microscópio 9. É um modelo animal ideal para o estudo de migração e diferenciação de células da crista neural cranianos.
Expandindo publicado anteriormente de trabalho de 8, 10, 11, o padrão migratório da CNCC foi descrito em detalhes usando as SOX10: Kaede modelo transgênico 5. Kaede é uma proteína de foto-conversível que turns de verde para vermelho após a ativação de fotos e faz com que seja possível traçar CNCCs precisão. Durante esta transformação da estrutura peptídica é clivada, sugerindo que a conversão é estável, o que significa que as células podem ser rastreados para o seu destino final 12. Linhas transgénicas marcadas com kaede sob o controlo transcricional de SOX10 mostrou que o paladar e a placa amniota etmóide de peixe-zebra são formados por fusão de homologamente saliências maxilares bilaterais (MXP) com a proeminência ITontonasal (FNP) e que a costura de fusão em forma de Y é análoga entre espécies.
Entre outras aplicações, as SOX10: kaede modelo transgénico de peixe-zebra foi usado para gerar o vídeo de embriões de peixes-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento para mostrar a formação de estruturas craniofaciais normais e anormais. Fotoconversão de grupos específicos de células faz com que seja possível acompanhar o seu desenvolvimento. Com este método de abordagem para criar imagens em tempo real de desenvolver craniofacestruturas ial em peixe-zebra é introduzida, tornando mais fácil para demonstrar visualmente esse processo complexo de desenvolvimento.
Este protocolo destina-se a partilhar a experiência de gerar esses vídeos usando o desenvolvimento normal da placa etmoidal em SOX10: zebrafish transgênicos Kaede como exemplo. Este protocolo pode ainda ser aplicada a fazer vídeos de lapso de tempo de qualquer estrutura derivadas de células da crista neural cranial em peixe-zebra.
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Protocol
1. De colheita de embriões para Fotoconversão
- Instituído pelo menos dez pares de SOX10: zebrafish transgênicos Kaede entre 5 e 6:00 da noite.
- Na manhã seguinte, puxe divisores e recolher os ovos em torno de meio-dia. Transfira-os para placas de Petri e colocá-los em 28,5 ° C incubadora.
- Por volta das 24 horas pós fertilização, limpe as placas de Petri, removendo os embriões mortos. Para verificar o estágio de desenvolvimento de embriões 13 usando microscopia de campo claro e qualquer microscópio de fluorescência com maior proteína verde fluorescente (EGFP) filtro. Kaede será visível através deste filtro.
- Quando chegar a 60 embriões transferência hpf cinco embriões fluorescentes brilhantemente em um prato separado Petri e dechorionate-los, se necessário.
2. Montagem do embrião para Fotoconversão
- Montar o embrião usando um microscópio fluorescente normal. Montagem de embriões em microscópio confocal é extremamente desafiador.
- Use estandeágua ard E3 ou E3 preparar fresco utilizando a seguinte receita:
Adicione o seguinte por um litro de água destilada dH 2 O, adicione o seguinte para fazer 1x E3L:
0,292 g de 5,0 mM de NaCl
0,013 g 0.17mm KCl
0,044 g 0,33 mm de CaCl2 (dessecante, 96%, ACS reagente)
0,081 g 0,33 mM de MgSO4 (anihidro)
Opcional: adicionar 200 mL de 0,05% de azul de metileno a 1X E3 como fungicida e mexa.
Meio mantém à temperatura ambiente durante 1 semana. - Use tricaina padrão ou preparar tricaina usando seguinte receita:
Para 5 L de 0,2% tricaina misturar os seguintes ingredientes:
45 ml de Tris-Cl (pH 9,5 1M)
5 LH H2O
10 g tricaina - Prepare 'suco filme' (50 ml E3, solução tricaina 0,015%), pela adição de 3,75 ml de 0,2% para 46,25 ml tricaina E3.
- Prepare agarose através da mistura de 46,25 ml de água E3 com 46,35 mg de baixo ponto de fusão (LMP) de agarose em um frasco de vidro de 50 ml e dissolver partículas sólidas por microondas. Em seguida, adicionar3,73 ml de 0,2% de agarose tricaina e colocar frasco de vidro com agarose em 50 ° C banho-maria até o uso.
3. Preparação e montagem de Embrião
- Anestesiar embriões com solução tricaina E3/0.015% feita no passo 1.1.2 e transferência de embriões para slides câmara.
- Deixe-se envolver todo o excesso de E3 com lenço de papel ea colocou de agarose para embrião.
- Posição embrião perfeitamente dorsal com dicas Microloader. Certifique-se de todo o embrião não flutua em cima da agarose, mas empurrar todo o corpo para baixo. Em seguida, despeje solução tricaina E3/0.015% em relação ao embrião agarose incorporado até câmara está totalmente preenchido com fluido.
4. Como ajustar as configurações de software em Microscópio Confocal
- Use 20X ar objetivo submergível (abertura numérica 0,75; pinhole tamanho 20) para focar o embrião. Em seguida, pressione o botão da luz L100 no microscópio e selecionar canais de software. Controls/A1settings abrir a ícones ver / aquisição e click o botão de configuração confocal. Em seguida clique em "auto" e selecione os canais seguintes antes de fechar a janela novamente:
Ch1: DAPI canal de 403,4 nm (comprimentos de onda entre 350-410 nm pode ser usado)
CH2: 488,0 nm
CH3: 561,9 nm
5. Fotoconversão
- Desligue Ch1 e 3 e ligue Ch2 antes de clicar no botão remover interlock e digitalização.
- Concentre-se em células de interesse para fotoconversão, que é o melhor feito por começando com 1frame/sec e alta tensão (HV) 200 e, em seguida, subir no frames / seg e diminuindo o HV em conformidade até chegar a 1/32 frames / seg e HV em torno 100-120, de acordo com o ruído de fundo.
- Quando o embrião está em foco, olhar para a borda direita da tela, pegue a borda verde e torná-lo menor para que caiba a área de interesse para fotoconversão e clique direito com o mouse. Menor é melhor porque o fotoconversão é irreversível.
- Vire frames / seg a 1 e HV para 200 e baterdigitalizar. Um zoom na imagem da área de fotoconversão é agora visível.
- Photoconvert células ativando Ch1 (403,4 nm). Expor ao laser photoconverting em qualquer lugar 5-60 segundos, dependendo do tamanho da região até Kaede verde como visto através do canal de GFP é quase ausente.
- Quando o sinal de Kaede verde é quase ausente, vire Ch1 fora. Vire Ch2 e 3 no. Em seguida, clique direito sobre a janela no campo área de digitalização A1 e clique em 'retorno ao tamanho original' para verificar se as células pretendidas foram photoconverted.
6. Fazendo uma pilha Z
- Encontre o ícone "captura Z-series 'na barra de menu e definir os limites superior e inferior do Z-stack antes de iniciá-lo. Definir LUTs.
7. Software-Configurações Time-lapse
- Vá para a caixa A1Simple GUI e marque seguintes definições:
1/32 frames / seg
Tamanho 1024
média de 4 ou 8 X, dependendo do número de Z-pilhas que tem de ser feita em um circuito - Vá para:controles view / aquisição / aquisição seqüência ND e definir intervalo de tempo (8-30min), clique em contínua e clique Z-stack. Definir fronteiras como testado antes e começar filme.
- Continue adicionando E3/0.015% tricaina solução câmara de slides durante todo o dia. À noite, encher câmara completamente. Isso vai durar até a manhã seguinte.
- Na manhã seguinte, encher solução tricaina E3/0.015% e verifique se embrião ainda está vivo. A perda de fluorescência indica morte. Continuar recargas e verificações ao longo do dia.
- Quando a estrutura de terminar a formação, ou o embrião tenha morrido, o filme terminar.
8. Processamento de pós-produção
- Clique 'show projeção intensidade máxima' na barra de ferramentas, em seguida, clique direito sobre a imagem e criar um novo documento. O vídeo é agora visível na melhor qualidade possível. Vá em frente para eliminar quadros que não são necessários e ajustar LUTs. Finalmente salvar como. Avi. Este formato será bom para o Windows. Para download de software Mac to converter. mov ou. wmv.
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Representative Results
No SOX10: CNCCs linhagem transgênica Kaede, migratórias e pós migratórias são rotulados fluorescente verde. As células marcadas com CNCC Kaede verde fluorescente recapitular endógeno expressão de mRNA SOX10 5.
Entre outras aplicações, este modelo animal foi usado para visualizar melhor o desenvolvimento de estruturas craniofaciais CNCC dependentes. O desenvolvimento normal das estruturas específicas e também o desenvolvimento patológico de malformações craniofaciais, especialmente lábio leporino e fenda palatina foram capturados. Uma série de vídeos de lapso de tempo ao vivo de peixe-zebra em momentos diferentes de desenvolvimento foi gerado.
Como exemplo, embriões aos 60 hpf, uma fase em que as trabéculas emparelhados se reuniram para formar a chapa etmoidal, foram selecionados. Fotoconversão alvo unilateral, resultando em rotulagem vermelho da porção mais anterior das células na placa etmóide foi realizada. Em primeiro lugar, a extensão normal e a formação de the placa etmoidal foi observada em tipo selvagem Tuebingen zebrafish (ver Figura 1 e Vídeo 1). Com uma compreensão do desenvolvimento normal da placa etmóide, esta referência de tipo selvagem, foi aplicado para comparar a migração de CNCCs em embriões em que a expressão do gene normal, foi perturbado.
Um specc1lb morfolino knockdown embrião do peixe-zebra foi escolhido como um exemplo representativo. SPECC1L é o primeiro gene implicado no desenvolvimento da fenda facial oblíqua rara mas grave. Knockdown baseado em Morfolino de SPECC1L specc1lb homólogo no resultado de peixe-zebra em clefting facial bilateral na placa etmoidal. Embriões em 60 embriões HPF que haviam sido injetados com specc1lb antisense morfolino foram selecionados ea porção mais anterior das células etmoidais placa foi photoconverted unilateralmente. Em contraste com o desenvolvimento normal da placa etmóide, falha de fusão entre as células da placa etmoidais medianose células da placa etmoidais laterais poderia ser observada. Isto assemelha-se patogênese do desenvolvimento ObFC em humanos, onde a falha de fusão entre o processo nasal lateral e proeminência maxilar ocorre (ver vídeo 2).
Figura 1. vista Kaede fotoconversão A. Ventral de 60 SOX10 hpf:: SOX10. zebrafish transgênicos Kaede. A estrutura rotulado verde no diagrama ea imagem real ao vivo correspondente assemelha a placa etmoidal. Após a exposição à luz UV (a 403,4 nm), sob o microscópio confocal, o kaede proteína fluorescente é photoconverted de verde para vermelho. B. O photoconverted células podem ser seguidos, como mostrado no painel B.
Filme 1. Time lapse vídeo 60 wildtype fase hpf Tuebingen embrião de peixe-zebra.A formação normal da placa etmóide. Vista ventral. Registrada a cada 30 min começando 60-72 hpf. Clique aqui para ver filme .
Filme 2. Embrião Tempo vídeo lapso de 60 hpf fase specc1lb morfolino injetado. Fracasso da fusão entre as células etmoidais placa mediana e células etmoidais placas laterais podem ser observados. Vista ventral. Registrada a cada 30 min começando 60-72 hpf. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Aqui, um novo método para a visualização de desenvolvimento craniofacial no modelo do peixe-zebra é mostrado. Os SOX10: kaede linha de peixes-zebra transgénicos tem sido usado com sucesso para descrever o padrão de migração de CNCC em detalhe é usado como um organismo modelo 5.
Estudos anteriores já haviam utilizado marcos brutas, como o olho às células-alvo e têm contado com injeção mRNA Kaede, ensaios fotoconversão ou enjaulado dextrano fluoresceína para fotoconversão 10, 11, 14, 15 O sox:. 10 Kaede linhagem transgênica tem muitas vantagens em relação a estes métodos. Com células da crista neural já rotulados com Kaede e de acordo com uma distribuição muito particular, podem ser utilizados marcos mais precisos para o estabelecimento de regiões para mapeamento destino. Além disso, tendo proteína kaede expressa endogenamente sob o controlo do promotor SOX10 garante que apenas as células da crista neural são photoconverted e que apenas os derivados será marcado numa fase posterior, devincar o fundo potencial 5.
Com esta técnica, a formação de qualquer célula da crista neural derivada estrutura craniofacial no peixe-zebra pode ser demonstrado com sucesso. O desenvolvimento de embriões de peixes-zebra de tipo selvagem normais pode ser seguido e esta referência de tipo selvagem pode ser comparado com embriões em que a expressão do gene normal, foi perturbado.
Modificações potenciais incluem o uso de um recipiente diferente para fixar o embrião durante a visualização. Esta pode ser uma placa de Petri, ou em qualquer outra bandeja translúcida.
Se de imagem não for bem sucedida, esta é provavelmente devido a erros em configurações de software. Leia o manual do utilizador do microscópio cuidadosamente antes de iniciar o lapso de tempo ao vivo.
Enquanto imagem, é fundamental para se concentrar no plano direito do embrião e para definir fronteiras Z-stack com precisão. Além disso, os parâmetros de qualidade de imagem, como frames / seg, média e LUTs tem que ser definido no melhor way possível, a fim de obter resultados de alta qualidade.
Uma limitação potencial desta técnica é que ele é tecnicamente desafiador para as células de etiquetas em uma base única célula, como o tecido circundante também é exposto à luz UV. Além disso, se a proliferação de células é rápida, a rotulagem vermelho é perdida através de diluição após a divisão celular.
Além disso, é kaede tetramérica e tem uma tendência para formar agregados quando fundido com outras proteínas. Isso limita o seu uso na maioria das aplicações de fusão em imagens de células vivas.
Imagens ao vivo de lapso de tempo é uma ferramenta importante para tornar os dados experimentais de desenvolvimento complexos mais acessível à comunidade científica e um público mais amplo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem Robert Kelsh por gentilmente compartilhar o reagente SOX10 promotor peixe-zebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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