Summary
Visualisierung von experimentellen Daten ist zu einem wichtigen Element in Präsentation der Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Generation von Live-Zeitraffer-Aufnahme von wachsenden Embryos trägt zu einer besseren Präsentation und Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zellmarkierung über der Photo kaede Protein im Zebrafisch.
Abstract
Wirbel palatogenesis ist ein hoch choreographierte und komplexen Entwicklungsprozess, der Migration von Schädel Neuralleiste (CNC)-Zellen, Konvergenz und Erweiterung des Gesichts Protuberanzen und Reifung des kraniofazialen Skeletts beinhaltet. Kaede transgenen Zebrafischlinie generiert wurde: Um den Beitrag der Schädel Neuralleiste auf bestimmte Regionen des Zebrafisches Gaumen sox10 studieren. Sox10-Linie bietet Beschränkung der kaede Reporterprotein zu der Neuralleiste, wodurch die Zellmarkierung eine genauere Verfahren als traditionelle Farbstoff oder Reporter-mRNA-Injektion. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das von grün auf rot schaltet sich nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, Zellen genau zu folgen. Die sox10: kaede transgene Linie wurde verwendet, um Abstammung Analyse durchführen, um CNC-Zellpopulationen, die Anlass zu Oberkiefer-Unterkiefer gegenüber Elementen und veranschaulichen Homologie von Gesichts Protuberanzen zu amniotes abzugrenzen. Dieses Protokoll beschreibt den Schritts, eine Live-Zeitraffer-Video eines sox10 generieren: kaede Zebrafischembryo. Entwicklung des Siebbein Platte wird als praktisches Beispiel dienen. Dieses Protokoll kann zur Erstellung einer Zeitraffer-Aufnahme eines konfokalen kaede oder ähnliche photoconvertible Reporterprotein in transgenen Zebrafisch angewendet werden. Weiterhin kann es verwendet werden, um nicht nur normal, sondern auch abnorme Entwicklung der kraniofazialen Strukturen in den Zebrafisch-Mutanten zu erfassen.
Introduction
Gesichtsspalten stellen die häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen, mit 1/700-1, 000 betroffenen Lieferungen ein. Störung der frühen embryonalen kraniofazialen Entwicklung kann zur Bildung von Lippen-Kiefer-Gaumen-(CL / P) führen. Während Ursachen für syndromale Spalt weitgehend gezeigt wurde, müssen die genetischen und epigenetischen Grundlagen der nicht-syndromale Formen der orofazialen Spaltbildung noch aufgedeckt 2-4 werden. Um die Ätiologie und Pathogenese dieser Fehlbildungen zu verstehen, ist es notwendig, die Entwicklung der kraniofazialen Strukturen auf zellulärer Basis aufzuklären.
In allen Wirbeltierarten Schädel Neuralleistenzellen (CNCC) wandern aus dem dorsalen Neuralrohr, die Kiemenbögen, die zur Bildung von orofazialen Strukturen beitragen füllen. Störung der frühen embryonalen Neuralleiste Entwicklung ist auf die Bildung von Gesichtsschädelfehlbildungen einschließlich CL / P 5-7 führen.
In Ad-dition, strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Zebrafisch-und Säugetier kraniofazialen Entwicklung (CNCCs befinden sich in homologen Regionen) wird das Gen regulatorische Netzwerk hoch konserviert. Es wurde auch gezeigt, dass CNCCs entwickeln in der gleichen Weise zwischen amniote Arten und Zebrafisch 8, so dass das Zebrafisch eine leistungsfähige Organismus für das Studium der Entwicklungs-und genetischen Grundlagen von CL / P. Es hat viele Vorteile, wie geringe Größe, schnelle und Ex-utero embryonalen Entwicklung und hohe Zuchtraten. Darüber hinaus ist der Embryo optisch transparent, so dass es für die Beobachtung von komplexen Entwicklungsschritte unter dem Mikroskop 9. Es ist ein ideales Tiermodell für die Untersuchung von Migration und Differenzierung von Hirn Neuralleistenzellen.
Kaede transgenen Modell 5: Aufbauend auf zuvor veröffentlichte Arbeit 8, 10, 11, die Migrationsmuster der CNCC wurde ausführlich über die sox10 beschrieben. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das turns von grün auf rot nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, CNCCs genau verfolgen. Während dieser Umwandlung das Peptidrückgrat gespalten, was darauf hindeutet, dass die Umwandlung ist stabil, was bedeutet, können die Zellen an ihren endgültigen Bestimmungsort 12 verfolgt werden. Transgene Linien mit kaede unter der Transkriptionskontrolle sox10 beschriftet zeigte, dass die amniote Gaumen und das Siebbein Platte des Zebrafisch sind homolog durch Fusion von bilateralen Kiefer Protuberanzen (MXP) mit der Prominenz frontonasalen (FNP) gebildet wird und dass das Y-förmige Naht ist analog Fusion zwischen Arten.
Unter anderen Anwendungen, die sox10: kaede transgenen Zebrafisch-Modell wurde verwendet, um Videos von Zebrafisch-Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erzeugen, um die Bildung von normalen und abnormalen kraniofazialen Strukturen zeigen. Photo bestimmter Gruppen von Zellen ist es möglich, ihre Entwicklung zu verfolgen. Mit dieser Methode ein Ansatz, um die Live-Darstellung der Entwicklung craniofac erstellenial Strukturen im Zebrafisch eingeführt wird, macht es einfach, dieses komplexe Entwicklungsprozess visuell demonstrieren.
Kaede transgenen Zebrafisch als Beispiel: Dieses Protokoll wird auf die gemeinsame Nutzung der Erfahrungen der Erzeugung diese Videos mit der normalen Entwicklung des Siebbein Platte in Sox10 ab. Dieses Protokoll kann weiter zu machen Zeitraffer-Videos von jeder Struktur von Hirn Neuralleistenzellen in Zebrafisch-Regelung angewendet.
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Protocol
1. Embryo-Sammlung für Photokonversion
- Kaede transgenen Zebrafisch zwischen 5 und 18.00 Uhr am Abend: Bis mindestens zehn Paar sox10 ein.
- Am nächsten Morgen, Trennwände ziehen und sammeln Eier gegen Mittag. Übertragen Sie sie auf Petrischalen und sie in 28,5 ° C Inkubator.
- Mit rund 24 Stunden nach der Befruchtung, reinigen Sie die Petrischalen durch die Beseitigung von toten Embryonen. Überprüfen Sie das Entwicklungsstadium der Embryonen 13 mit Lichtfeld-Mikroskopie und jede Fluoreszenzmikroskop mit enhanced green fluorescent protein (EGFP)-Filter. Kaede wird durch diesen Filter sichtbar sein.
- Wenn Embryonen erreichen 60 hpf Transfer fünf hell fluoreszierende Embryonen in einem separaten Petrischale und dechorionate sie gegebenenfalls.
2. Montage der Embryo für Photokonversion
- Montieren Sie den Embryo mit einem normalen Fluoreszenz-Mikroskop. Montage von Embryonen auf konfokalen Mikroskop ist sehr anspruchsvoll.
- Verwenden Standard E3 Wasser oder frisch zubereiten E3 mit dem folgenden Rezept:
Fügen Sie den folgenden pro einem Liter destilliertem Wasser dH 2 O, Folgendes zu 1x E3L machen:
0,292 g 5,0 mM NaCl
0,013 g KCl 0,17 mm
0,044 g CaCl 2 0,33 mm (Trockenmittel, 96%, ACS Reagens)
0,081 g 0,33 mM MgSO 4 (wasserfrei)
Optional: mit 200 ul von 0,05% Methylenblau auf 1X E3 als Fungizid und umrühren.
Medium hält bei Raumtemperatur für 1 Woche. - Verwenden Sie Standard-Tricaine oder bereiten Tricaine mit folgender Rezeptur:
Für 5 L von 0,2% Tricaine die folgenden Zutaten mischen:
45 ml Tris-Cl (pH 9,5 1M)
5 LH 2 O
10 g Tricaine - Vorbereiten "Film-Saft" (50 ml E3, 0,015% Tricaine Lösung), durch Zugabe von 3,75 ml 0,2% auf 46,25 ml Tricaine E3.
- Agarose vorbereiten, indem man 46,25 ml E3 Wasser mit 46,35 mg niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose in einem 50 ml Glaskolben und lösen Feststoffpartikel durch die Mikrowelle. Dann fügen3,73 ml 0,2% Tricaine an Agarose und legte Glaskolben mit Agarose in 50 ° C im Wasserbad bis zur Nutzung.
3. Vorbereitung und Montage der Embryo
- Anesthetize Embryonen mit E3/0.015% Tricaine Lösung in Schritt 1.1.2 und Transfer Embryo Kammer Bogen aus.
- Genießen Sie alle überschüssige E3 mit Papiergewebe und der Put-Agarose auf Embryo.
- Position Embryo perfekt dorsal mit Microloader Tipps. Stellen Sie sicher, die ganze Embryo nicht auf dem Agarose schweben, aber schieben Sie den ganzen Körper nach unten. Dann gießen E3/0.015% Tricaine Lösung über Agarose eingebettet Embryo bis Kammer ist vollständig mit Flüssigkeit gefüllt.
4. Anpassen der Software-Einstellungen auf Konfokalmikroskop
- Verwenden 20X Lufteint Ziel (numerische Apertur 0,75; Pinholegröße 20) zur Fokussierung des Embryos. Drücken Sie dann die L100 Licht-Taste am Mikroskop und wählen Sie Kanäle in der Software. Öffnen Sie die Icons sehen / Erwerb controls/A1settings und click die konfokale Setup-Taste. Nächstes klicken Sie auf "Auto" und wählen Sie folgende Kanäle vor dem Schließen des Fensters wieder:
K1: DAPI-Kanal 403,4 nm (Wellenlängen können zwischen 350 bis 410 nm verwendet werden)
Ch2: 488,0 nm
Ch3: 561,9 nm
5. Photo
- Schalten Sie Kanal 1 und 3, und schalten Sie Ch2, bevor Sie auf den Entfernen-Taste Verriegelung und Scannen.
- Konzentrieren Sie sich auf Zellen von Interesse für Photo, was ist am besten, indem Sie mit 1frame/sec und Hochspannung (HV) 200 und dann hinauf in den Frames / sec und die Senkung der HV entsprechend bis zur 1/32 Frames / s und HV rund getan 100-120, abhängig von dem Hintergrundrauschen.
- Wenn der Embryo im Fokus ist, sehen Sie auf der rechten Bildschirmrand, greifen die grünen Rand und verkleinert so den Bereich von Interesse für Photo und klicken Sie rechts mit der Maus passt. Kleiner ist besser, weil die Photo ist irreversibel.
- Drehen Sie Bilder / s auf 1 und HV 200 und schlugscannen. Ein Bild gezoomt in der Fläche der Photo ist jetzt sichtbar.
- Photoconvert Zellen durch Drehen auf Kanal 1 (403,4 nm). Aussetzen des photoconverting Laser überall 5-60 Sekunden, abhängig von der Größe des Bereichs, bis die grüne kaede wie durch die GFP-Kanal gesehen ist fast nicht vorhanden.
- Wenn das grüne Signal kaede fast abwesend, schalten K1 aus. Schalten Ch2 und 3 auf. Dann klicken Sie rechts auf die Fenster auf A1 Scanbereich Feld ein und klicken "Rückkehr zur Originalgröße", um zu überprüfen, ob gewünschten Zellen wurden photokonvertiertem.
6. Einen Z-Stapel
- Finden Sie das Symbol "Capture Z-Serie" in der Menüleiste und stellen Sie Ober-und Untergrenzen der Z-Stapel, bevor Sie es. Stellen LUTs.
7. Software-Einstellungen Time-lapse
- Zum A1Simple GUI-Box und kreuzen Sie folgende Einstellungen vor:
1/32 Bilder / s
Größe 1024
durchschnittlich 4 oder 8X abhängig von der Anzahl von Z-Stapeln, die in einer Schleife gezogen werden muss - Gehen Sie zu:view / Erwerb Kontrollen / ND Sequenzerfassung und Zeitrahmen festgelegt (8-30min), klicken Sie auf kontinuierliche und klicken Sie auf Z-Stapel. Legen Grenzen getestet, wie vor und Film starten.
- Halten Sie das Hinzufügen E3/0.015% Tricaine Lösungskammer Folie den ganzen Tag. In der Nacht, füllen Sie Kammer vollständig. Das wird bis zum nächsten Morgen dauern.
- Am nächsten Morgen füllen E3/0.015% Tricaine Lösung und prüfen, ob Embryo noch lebt. Verlust der Fluoreszenz zeigt Tod. Weiter Minen und prüft, den ganzen Tag.
- Wenn die Struktur bilden abgeschlossen, oder der Embryo gestorben ist, beenden Sie den Film.
8. Post-Produktion Verarbeitung
- Klicken Sie auf "Show Maximum Intensity Projection" in der Werkzeugleiste, klicken Sie dann rechts auf das Bild und schaffen neues Dokument. Das Video ist jetzt in der bestmöglichen Qualität sichtbar. Gehen Sie auf Bilder, die nicht benötigt werden, zu löschen und stellen LUTs. Schließlich Speichern unter. Avi. Dieses Format wird gut für Windows handelt. Für Mac-Download-Software to konvertieren. mov oder. wmv.
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Representative Results
In der sox10: kaede transgene Linie, Zug-und Postmigrations CNCCs fluoreszierend grün markiert. Die CNCC Zellen mit grün fluoreszierenden kaede beschriftet rekapitulieren sox10 endogene mRNA-Expression 5.
Unter anderen Anwendungen wurde dieses Tiermodell verwendet, um die Entwicklung von CNCC abhängig kraniofazialen Strukturen besser sichtbar zu machen. Normale Entwicklung der spezifischen Strukturen und auch pathologische Entwicklung der kraniofazialen Fehlbildungen, insbesondere Lippen-Kiefer-Gaumen erfasst wurden. Eine Reihe von Live-Zeitraffer-Videos von Zebrafisch in verschiedenen Entwicklungszeitpunkten erzeugt wurde.
Als Beispiel Embryonen bei 60 hpf, ein Stadium, in dem die gepaarten Trabekel erfüllt die ethmoid Platte zu bilden, wurden ausgewählt. Einseitige gezielte Photo was zu roten Markierung der vorderste Teil der Zellen in der ethmoid Platte durchgeführt wurde. Zunächst wird die normale Ausdehnung und Bildung thE ethmoid Platte wurde in Wildtyp-Tübingen Zebrafisch (siehe Abbildung 1 und Video 1) beobachtet. Mit einem Verständnis der normalen Entwicklung des Siebbeins Platte wurde diese Wildtyp-Referenz dann angewendet, um die Migration von CNCCs in Embryonen, in denen normale Genexpression wurde gestört zu vergleichen.
Ein specc1lb Morpholino Knockdown Zebrafischembryo wurde als repräsentatives Beispiel ausgewählt. SPECC1L ist das erste Gen bei der Entwicklung der seltene, aber schwere schrägen Gesichtsspalte verwickelt. Morpholino-basierte Knockdown von SPECC1L Homolog specc1lb im Zebrafisch Ergebnisse in den bilateralen Gesichtsspaltbildung im Siebbein Platte. Embryonen bei 60 hpf Embryonen, die mit Antisense-Morpholino specc1lb injiziert worden war, wurden ausgewählt und der vorderste Teil der Zellen wurde ethmoid Platte einseitig photokonvertiertem. Im Gegensatz zu normalen Entwicklung des Siebbein Platte, Ausfall der Fusion zwischen Median ethmoid Platte Zellenund Querplatte ethmoid Zellen beobachtet werden. Dies ähnelt Pathogenese der ObFC Entwicklung in den Menschen, denen der Ausfall Fusion zwischen der lateralen Nasen Prozess-und Kiefer Vordergrund tritt (siehe Video 2).
Fig. 1 ist. sox10:. kaede Photo A. Ventralansicht von 60 hpf sox10: kaede transgenen Zebrafisch. Die Struktur der Bezeichnung im Diagramm grün und die entsprechenden realen Live-Bild ähnelt dem Siebbein Platte. Nach der Belichtung mit UV-Licht (bei 403,4 nm) unter dem konfokalen Mikroskop wird das fluoreszierende Protein kaede von grün auf rot photokonvertiertem. B. Die photokonvertiertem wie in Abbildung B gezeigt, können die Zellen verfolgt werden.
Film 1. Zeitraffer-Video 60 hpf Bühne Wildtyp Tübingen Zebrafischembryo.Normale Bildung der ethmoid Platte. Ventralansicht. Aufnahme alle 30 min ab 60-72 hpf. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Movie 2. Zeitraffer-Video 60 hpf Bühne specc1lb Morpholino injiziert Embryo. Ausfall der Fusion zwischen Median ethmoid Platte Zellen und Seitenplatte ethmoid Zellen beobachtet werden kann. Ventralansicht. Aufnahme alle 30 min ab 60-72 hpf. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
Hier wird ein neues Verfahren zur Darstellung von kraniofazialen Entwicklung im Zebrafischmodell dargestellt. Die sox10: kaede transgenen Zebrafischlinie wurde erfolgreich verwendet, um die Migrationsmuster der CNCC im Detail zu beschreiben ist als Modellorganismus 5 verwendet.
Frühere Studien haben Brutto Sehenswürdigkeiten wie das Auge verwendet werden, um die Zielzellen und haben sich auf kaede mRNA Injektion, Photo Assays oder Käfig Fluorescein Dextran für Photo 10, 11, 14, 15 verlassen die SOx-:. Kaede 10 transgenen Linie im Vergleich zu diesen hat viele Vorteile Methoden. Mit Neuralleistenzellen bereits mit kaede und entsprechen einem sehr besonderen Verteilung gekennzeichnet, darf genauere Wahrzeichen für die Einrichtung Regionen Schicksal Mapping verwendet werden. Darüber hinaus haben kaede Protein endogen unter der Kontrolle des Promotors exprimiert sox10 sichergestellt, dass nur Neuralleistenzellen photokonvertiertem sind und dass nur Derivate werden zu einem späteren Zeitpunkt zu kennzeichnen, DEFalten das Potenzial Hintergrund 5.
Mit dieser Technik kann die Bildung jeglicher Neuralleistenzellen abgeleitet kraniofazialen Struktur im Zebrafisch erfolgreich gezeigt werden. Die Entwicklung von normalen Wildtyp-Zebrafisch-Embryonen können verfolgt und werden diese Wildtyp-Referenz kann Embryonen, wo normale Genexpression wurde gestört verglichen werden.
Mögliche Modifikationen umfassen einen anderen Container verwendet, um den Embryo während der Visualisierung zu beheben. Dies kann eine Petrischale oder jede andere transluzente Fach sein.
Wenn Bildgebung nicht erfolgreich ist, ist dies wahrscheinlich aufgrund von Fehlern in der Software-Einstellungen. Lesen Sie die Bedienungsanleitung des Mikroskops sorgfältig durch, bevor Live-Zeitraffer.
Während Bildgebung, ist es wichtig, auf die richtige Ebene des Embryos zu konzentrieren und Z-Stapel-Grenzen genau festgelegt. Weiterhin haben Bildqualitätsparameter wie Bilder / Sek, durchschnittliche und LUTs in der besten wa eingestellt werdeny, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu bekommen möglich.
Ein potentieller Nachteil dieser Technik ist, dass es technisch schwierig, Etikett Zellen auf Einzelzellgrundlage, wie das umgebende Gewebe ist auch mit UV-Licht bestrahlt. Ferner, wenn die Zellproliferation ist schnell, die rote Markierung wird durch Verdünnung nach der Zellteilung verloren.
Zusätzlich ist kaede tetramere und hat eine Tendenz, Aggregate zu bilden, wenn mit anderen Proteinen fusioniert. Das schränkt seine Verwendung in den meisten Fusionsanwendungen im Live Cell Imaging.
Live-Zeitraffer-Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug komplexe Entwicklungs experimentellen Daten besser zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft und einem breiteren Publikum zugänglich zu machen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren danken für die freundliche Robert Kelsh teilen die Zebrafisch-Promotor sox10 Reagenz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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