Summary
実験データの可視化は、科学界に結果を提示する重要な要素となっています。成長した胚のライブタイムラプス撮影の生成は複雑な発達過程をより良くプレゼンテーションや理解に貢献しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで楓タンパク質の光変換を経由して細胞標識へのステップバイステップガイドです。
Abstract
脊椎動物palatogenesisは頭蓋神経堤（CNC）細胞、収束と顔のプロミネンスの延長、および頭蓋顔面骨格の成熟の移行を伴う非常に振り付けで複雑な発達過程です。楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインが生成されました：ゼブラフィッシュ口蓋の特定の領域SOX10に頭蓋神経堤の寄与を研究すること。 SOX10は、それによって、伝統的な染料やレポーターmRNAの注入よりもより正確なプロセスを標識し、細胞を作り、神経堤に楓のレポータータンパク質の系統限定を提供しています。楓、光活性化の後に赤色から緑色に変わり、正確に細胞を追跡することができる光転換タンパク質である。 SOX10：楓トランスジェニック系統は、下顎要素対上顎を生じさせると、羊膜に顔面プロミネンスの相同性を示してCNC細胞集団を線引きする系統分析を実行するために使用した。このプロトコルは、手順を説明します楓ゼブラフィッシュ胚：SOX10のライブの時間経過のビデオを生成するために、S。篩骨プレートの開発は、実用的な例となる。このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュのどの楓または類似photoconvertibleレポータータンパク質のタイムラプス共焦点記録を作るに適用することができます。さらに、ゼブラフィッシュ変異体における頭蓋顔面構造のみならず、正常でなく、発達異常を捕捉するために使用することができる。
Introduction
口腔顔面裂が1/700-1で、最も一般的な頭蓋顔面奇形を表し、000配達は1に影響を与えた。初期の発生学的頭蓋顔面の開発の破壊は、口唇口蓋裂（CL / P）の形成につながることができます。症候裂の原因は、主に示してきたが、口腔顔面分裂文形成の非症候性形態の遺伝的およびエピジェネティックな拠点は、まだ2-4を発見する必要があります。これらの奇形の病因および発症機序を理解するためには、セルラーベースで頭蓋顔面構造の発達を解明する必要がある。
すべての脊椎動物種に頭蓋神経堤細胞（CNCC）口腔顔面構造の形成に寄与する咽頭のアーチを、設定するために、背側神経管から移行。初期の発生学的神経堤の開発の破壊は、CL / P 5-7を含む頭蓋顔面奇形の形成につながることができます。
ADでゼブラフィッシュおよび哺乳動物の頭蓋顔面の開発（CNCCsは相同領域に存在する）との間の構造的類似性ditionは、遺伝子制御ネットワークが高度に保存されている。またCNCCsは、ゼブラフィッシュのCL / Pの発生および遺伝的基礎を研究するための強力な生物を作り、羊膜種およびゼブラフィッシュ8の間に同じ様式で発症することが示されているそれは、小型、高速かつ元子宮胚発生、高い繁殖率を含む多くの利点を持っています。さらに、胚を顕微鏡9の下に複雑な発生事象を観察することが影響を受けやすいこと、光学的に透明である。これは、頭蓋神経堤細胞の遊走および分化の研究のための理想的な動物モデルである。
楓トランスジェニックモデル5：以前に公開され仕事8、10、11に拡大して、CNCCの遊走パターンは、SOX10を用いて詳細に説明した。楓はTUフォト転換タンパク質である光活性化後の緑色から赤色へのRNSかつ正確CNCCsをトレースすることができる。この変換の間、ペプチド骨格は、細胞がそれらの最終目的地12まで追跡することができることを意味し、変換が安定であることを示唆して切断される。 SOX10の転写制御下に楓で標識したトランスジェニック系統は、羊膜の口蓋とゼブラフィッシュの篩骨板は前頭鼻隆起（FNP）であり、Y字型融合縫い目の間に類似であることを、二国間上顎プロミネンス（MXP）の融合によって相同的に形成されることを示した種。
他の用途の中でも、SOX10：楓トランスジェニックゼブラフィッシュモデルは、正常および異常な頭蓋顔面構造の形成を示すために、異なる発達段階でのゼブラフィッシュ胚のビデオを生成するために使用された。細胞の特定の基の光変換は、それらの発達を追跡することが可能となる。 craniofacを開発するライブイメージングを作成するには、この方法でアプローチしてゼブラフィッシュにおけるIAL構造は、それが簡単に視覚的に、この複雑な発達過程を実証すること、導入される。
例として楓トランスジェニックゼブラ：このプロトコルはSOX10内篩骨プレートの正常な発達を使用してこれらのビデオを生成する経験を共有することを目的としている。このプロトコルは、さらに、ゼブラフィッシュにおける頭蓋神経堤細胞に由来する任意の構造の経時ビデオを作るにも適用することができる。
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Protocol
1。光変換のための胚コレクション
- 夕方5と6時間楓トランスジェニックゼブラフィッシュ：SOX10の少なくとも10ペアをセットアップします。
- 翌朝、仕切りを引き、正午頃、卵を収集します。ペトリ皿に転送し、28.5℃のインキュベーターに入れます。
- 約24時間後に受精では、死んだ胚を削除してペトリ皿をきれいに。光照射野顕微鏡および強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）フィルターを持つ蛍光顕微鏡を用いて胚13の発達段階を確認してください。楓はこのフィルタを通して見えるようになります。
- 胚は別々のペトリ皿に60 HPF転送ファイブ鮮やかな蛍光の胚に到達し、必要に応じてdechorionateます。
2。光変換のための胚の取り付け
- 通常の蛍光顕微鏡を用いて胚をマウントします。共焦点顕微鏡で胚をマウントすると、非常に困難である。
- スタンドを使用してくださいARDのE3水または以下のレシピを使用して、新鮮なE3を準備します。
1X E3Lを作るために以下を追加し、蒸留水のdH 2 Oを1リットルあたり、以下を追加します。
0.292グラム5.0のNaCl
0.013グラム0.17mMのKCl
0.044グラム0.33mmでのCaCl 2（乾燥剤、96％、ACS試薬）
0.081グラム0.33のMgSO 4（無水化）
オプション：殺菌剤と攪拌などの1X E3 0.05％メチレンブルー200μlのを追加します。
培地を1週間室温で保持します。 - 標準トリカインを使用するか、以下のレシピを使用してトリカインを準備します。
0.2％の5のLは、以下の成分を混合トリカイン：
45ミリリットルのトリス-Cl（pH9.5で1M）
5 LH 2 O
10グラムのトリカイン - 46.25ミリリットルE3に3.75ミリリットル、0.2％トリカインを追加することで、「映画のジュース」（50ミリリットルE3、0.015％のトリカイン溶液）を準備します。
- 50mlのガラスフラスコ中で46.35 mgの低融点（LMP）アガロースE3 46.25ミリリットルの水を混合することによって調製し、アガロースマイクロ波処理することにより固体粒子を溶解する。 [追加アガロースおよび使用するまで50℃の水浴中にアガロースを有するガラスフラスコを置くために3.73ミリリットルの0.2％トリカイン。
3。胚の作製と取り付け
- チャンバースライドにステップ1.1.2および移植胚で行われたE3/0.015％のトリカイン溶液で胚を麻酔。
- ティッシュペーパーや胚の上にアガロースプットを持つすべての過剰E3を吸収。
- 位置胚は完全にmicroloaderのヒントと背側。全胚アガロースの上に浮くが、全身を押し下げないようにしてください。チャンバーが完全に流体で満たされるまで、その後、アガロース埋め込ま胚かけE3/0.015％のトリカイン水溶液を注ぐ。
4。共焦点顕微鏡上でソフトウェアの設定を行い
- 胚を集束させるため、20X空気浸漬可能な目的（ピンホールサイズ20の開口数0.75）を使用します。その後、顕微鏡でL100ライトボタンを押すとソフトウェアチャンネルを選択します。アイコンの表示/取得controls/A1settingsとCLICを開く共焦点セットアップボタンをk個。次の「自動」をクリックして、再度ウィンドウを閉じる前に、以下のチャンネルを選択します。
CH1：DAPIチャネル403.4ナノメートル（350から410 nmの波長の長さを使用することができます）
CH2：488.0 nmの
CH3：561.9 nmの
5。光変換
- Ch1のと3の電源をオフにし、[削除]インターロックボタン、スキャンをクリックする前に、Ch2の電源をオンにします。
- 光変換のための目的の細胞に焦点を当てているで1frame/sec、高電圧（HV）200から始まり、その後、フレーム/秒に上がっていくし、それに応じて周囲の1/32フレーム/秒と、HVに到達するまで、HVを下げることによって行わ最高の背景ノイズに応じて100〜120、。
- 胚が合うと、画面の右端に見える緑色の縁をつかんで、それを光変換し、マウスで右クリックを関心領域にフィットするので、それを小さくする。光変換は不可逆的であるので、小さい方が良いです。
- 200フレーム/秒の1と、HVの電源を入れて、ヒットスキャンします。光変換の領域の画像に拡大表示されるようになりました。
- CH1（403.4 nm）をオンすることによりPhotoconvert細胞。 GFPチャンネルを通して見た緑の楓がほぼ存在しないまで領域の大きさに応じて、任意の場所に5〜60秒からphotoconvertingレーザにさらされている。
- 緑の楓信号がほぼ存在しない場合、チャネル1をオフにしてください。 CH2および3をオンにします。その後、A1のスキャン領域のフィールド上のウィンドウに右クリックして、目的の細胞をphotoconvertedたかどうかをチェックする「元のサイズに戻る」を押してください。
6。 zスタックを作る
- メニューバーのアイコン 'キャプチャZシリーズ」を見つけて、それを起動する前に、zスタックの上限と下限を設定してください。 LUTを設定します。
7。ソフトウェア設定のタイムラプス
- A1Simple GUIのボックスに移動し、以下の設定をチェック：
1/32フレーム/秒
サイズ1024
一つのループに注意しなければならないZ-スタックの数に応じて、平均4又は8X - にアクセスしてください。ビュー/買収コントロール/ ND系列の取得および設定した時間枠（8 - 30分）、連続クリックして、zスタックをクリックします。前にテストとして境界線を設定し、ムービーを開始します。
- 終日E3/0.015％のトリカイン溶液チャンバースライドを追加し続ける。夜には、完全にチャンバーを埋める。つまり、次の朝まで続く。
- 翌朝、E3/0.015％のトリカイン液を補充し、胚がまだ生きているかどうかを確認します。蛍光の損失は死を示している。終日リフィルとチェックを続ける。
- 構造が形成を終了した、または胚が死亡したときは、映画を仕上げる。
8。ポストプロダクション処理
- ツールバーの「ショー最大値投影」をクリックして、右の画像をクリックして、新しいドキュメントを作成します。ビデオは現在、可能な限り最高の品質で表示されます。必要とされていないフレームを削除して、LUTを調整するために行く。最終的には。AVIとして保存します。この形式は、Windows用の罰金になります。 Mac用のソフトウェア·TをダウンロードO。MOVまたは。WMVに変換します。
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Representative Results
SOX10に：楓トランスジェニック系統、渡り鳥とポスト渡り鳥CNCCsは蛍光緑のラベルが付いています。緑色蛍光で標識された楓CNCC細胞は、内因性のSOX10 mRNA発現を再現5。
他の用途の中でも、この動物モデルは、より良好なCNCC依存性頭蓋顔面構造の発達を可視化した。特定の構造の正常な発達にも頭蓋顔面奇形の病理学的な開発、特に口唇口蓋裂は、捕獲されています。異なる発生時点でのゼブラフィッシュのライブタイムラプスビデオのシリーズが生成されました。
一例として、60 HPF、一対の骨梁が篩骨板を形成するために会ったた段階で胚を、選択された。篩骨プレート内の細胞のほとんど前方部分の赤ラベル、その結果一方的な目標と光変換を行った。まず、通常の拡張や目の形成電子篩骨プレートは、野生型ゼブラフィッシュチュービンゲン（ 図1とビデオ1を参照）で観察された。篩骨プレートの正常な発達を理解し、この野生型参照は、正常な遺伝子発現が摂動された胚においてCNCCsの移動を比較するために適用した。
specc1lbモルホリノックダウンゼブラフィッシュ胚は、代表例として選ば れた。SPECC1Lは稀ではあるが、重度の斜め顔面裂の発生に関係最初の遺伝子である。篩骨プレートの二国間の顔の分裂文形成におけるゼブラフィッシュ結果SPECC1Lホモログspecc1lbのモルホリノベースのノックダウン。 specc1lbアンチモルホリノを注入した60 HPFの胚の胚を選択し、篩骨プレート細胞の最前部には一方的にphotoconvertedた。篩骨プレートの正常な発達とは対照的に、メジアン篩板細胞間の融合の障害篩骨と横板細胞が観察された。これは横方向の鼻プロセスと上顎隆起の融合の失敗は（ ビデオ2を参照）が発生し、ヒトのObFC開発の病因に似ている。
図1。楓トランスジェニックゼブラフィッシュ：SOX10：60 HPFのSOX10の楓の光変換A.腹側を望む。構造は図の緑の標識され、対応する実ライブ画像は篩骨プレートに似ている。共焦点顕微鏡下（403.4 nmで）UV光に曝露し、蛍光タンパク質楓が緑から赤にphotoconvertedれる。B.歌うパネルBに示されるように、細胞が続くことができるphotoconverted。
映画の1。時間経過のビデオ60 HPF段野生チュービンゲンゼブラフィッシュ胚。篩骨プレートの正常な形成。腹側のビュー。 60-72 HPFを開始する30分毎に記録した。 映画を見るにはここをクリックしてください 。
映画の2。時間経過のビデオ60 HPF段階specc1lbモルホリノ注入した胚。中央値篩骨プレート細胞との間の融合の失敗と横篩骨プレート細胞を観察することができる。腹側のビュー。 60-72 HPFを開始する30分毎に記録した。 映画を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
ここゼブラフィッシュモデルにおける頭蓋顔面の開発の可視化のための新たな方法が示されている。 SOX10：楓トランスジェニックゼブラフィッシュ線が正常に詳細にCNCCの移動パターンを記述するために使用されてきたが、モデル生物5として使用される。
以前の研究では、細胞を標的とする眼などのグロスランドマークを使用していると楓mRNAの注入、光変換アッセイまたは光変換10、11、14、15ケージドフルオレセインデキストランに依存していたソックスを：10楓トランスジェニック系統は、これらに比べて多くの利点を有するメソッド。神経堤細胞が既に楓で標識し、非常に特定の分布に準拠して、運命マッピングのための領域を確立するためのより正確なランドマークが使用されてもよい。また、楓タンパク質はSOX10プロモーターの制御下で内因的に発現されたのみ神経堤細胞がphotoconvertedされることを保証する唯一の誘導体が後の段階で標識されることを、デ潜在的なバックグラウンド5をしわ。
この技術では、ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面構造に由来する任意の神経堤細胞の形成が正常に示すことができる。正常な野生型ゼブラフィッシュ胚の発達を追跡することができ、この野生型参照は、正常な遺伝子発現が摂動された胚と比較することができる。
潜在的な変更は、可視化の際に胚を固定するために別のコンテナを使用しています。これは、ペトリ皿、または任意の他の半透明のトレイであることができる。
撮像が成功しない場合、これは、ソフトウェアの設定ミスしそうである。ライブの時間経過を開始する前に、慎重に顕微鏡の利用者マニュアルをお読みください。
イメージングが、胚の右側面に集中することと正確にZスタックの境界を設定することが重要である。さらに、このようなフレーム/秒、平均のLUTなどの画質パラメータの最良のWAに設定する必要が高品質の結果を得るために可能とyの
この技術の潜在的な制限は、周囲の組織はまた、UV光に露光されるように、それが単一の細胞に基づいて細胞を標識することが技術的に困難であること、である。細胞増殖が速い場合には、さらに、赤色標識は、細胞分裂後に希釈によって失われる。
また、楓は、四量体であり、他のタンパク質に融合したときに凝集体を形成する傾向を有している。これは、生細胞イメージングにおいて最も融合用途におけるその使用を制限する。
ライブタイムラプスイメージングは、科学界と幅広い層への複雑な発達実験データをよりアクセシブルにするための重要なツールです。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、親切にゼブラフィッシュSOX10プロモーター試薬を共有するためのロバートKelshに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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