Summary
Deneysel verilerin görselleştirilmesi bilimsel topluluk sonuçların sunulması önemli bir unsur haline gelmiştir. Büyüyen embriyoların canlı time-lapse kayıt Üretimi karmaşık bir gelişimsel süreçlerinin daha iyi tanıtımı ve anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Bu protokol Zebrafish kaede protein Fotoçevrim yoluyla hücre etiketleme için bir adım-adım bir kılavuzdur.
Abstract
Omurgalı palatogenesis kranial nöral (CNC) hücreleri, yakınsama ve yüz çıkıntıların uzantısı ve kraniofasiyal iskeletin olgunlaşması geçişini içeren bir derece koreografi ve karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Kaede transgenik Zebrafish hattı oluşturuldu: Zebrafish damak belirli bölgelerde bir sox10 için kranial nöral katkısını incelemek. Sox10 böylece geleneksel boya veya raportör mRNA enjeksiyon daha hassas süreci etiketleme hücreyi yapma, nöral için kaede raportör protein soy kısıtlama sağlar. Kaede fotoğraf aktivasyonu sonrası yeşilden kırmızıya döner ve mümkün hassas hücrelerin takip yapan bir fotoğraf konvertibl proteindir. Sox10: kaede transgenik çizgi çene elemanlarının karşı maksiller doğuran ve amniotes için yüz çıkıntıların homoloji göstermektedir CNC hücre popülasyonlarının belirginleştiren soy analizini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Bu protokol basamağını açıklayankaede Zebra balığı embriyosu: Bir sox10 canlı zaman atlamalı video üretmek için s. Etmoid plaka Kalkınma pratik bir örnek olarak hizmet verecek. Bu protokol, transjenik zebrabalıkları herhangi kaede veya benzeri photoconvertible raportör proteinin bir zaman atlamalı konfokal kayıt yapmak için uygulanabilir. Ayrıca, zebra balığı mutantlar kraniofasial yapıları, normal, aynı zamanda anormal değildir gelişimi yakalamak için kullanılabilir.
Introduction
Orofasiyal yarıklar 1/700-1 ile, en yaygın kraniofasiyal deformitesi temsil, 000 teslimatlar 1 etkiledi. Erken embriyolojik kraniofasiyal gelişme bozulması yarık dudak ve damak (CL / P) oluşumuna yol açabilir. Sendrom yarık için nedenler büyük ölçüde gösterilmiş olmasına rağmen, orofasial yarıklaşmanın nonsendromik formlarının genetik ve epigenetik bazlar arasında hala 2-4 açık olması gerekir. Bu malformasyonların etyolojisi ve patogenezi anlamak için, bir hücresel bazda kraniofasial yapıların gelişmesini aydınlatmak için gereklidir.
Tüm omurgalı türlerin kranial nöral krest hücreleri (CNCC) orofasiyal yapıların oluşumuna katkıda yutak kemerler, doldurmak için dorsal nöral tüp göç. Erken embriyolojik nöral krest gelişim bozulması CL / P 5-7 gibi kraniofasiyal malformasyonların oluşumuna yol açabilir.
ReklamdaZebra balığı ve memeli kraniofasial geliştirme (CNCCs homolog bölgelerinde ikamet) arasındaki yapısal benzerlikler dition, gen düzenleyici ağ son derece muhafaza edilir. Ayrıca CNCCs Zebra balığı CL / P. gelişimsel ve genetik temelin çalışma için güçlü bir organizma haline amniote türler ve zebrabalıkları 8 ile aynı şekilde geliştirmek olduğu gösterilmiştir Bu küçük boyutlu, hızlı ve ex-utero embriyonik gelişim ve yüksek üreme oranları gibi birçok avantajı vardır. Ayrıca, embriyo mikroskop altında 9 karmaşık bir gelişimsel olayların gözlem it yatkın hale optik olarak transparandır. Bu göç ve kafatası nöral tepe hücreleri farklılaşma çalışma için ideal bir hayvan modelidir.
Kaede transgenik model 5: önce basılmış olan çalışmaları 8, 10, 11,, CNCC of göç desen üzerinde genişletilmesi sox10 kullanılarak detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Kaede fotoğraf konvertibl protein olduğunu tufotoğraf aktivasyon sonra yeşilden kırmızıya rns ve mümkün tam CNCCs iz yapar. Bu dönüşüm sırasında, peptid omurgası dönüşüm hücrelerin nihai hedefe 12 için izlenebilir, yani stabil olduğunu düşündürmektedir bölünmektedir. Sox10 transkripsiyonel kontrolü altında kaede ile etiketlenmiş transjenik çizgiler amniote damak ve zebrafish etmoid levha Y şekilli birleşme dikiş arasında benzer olan frontonasal öne (FNP) ile ve iki taraflı maksiller çıkıntıların (MXP) füzyonu ile homolog meydana gösterdi türleri.
Diğer uygulamalar arasında, sox10: kaede transgenik zebra balığı modeli normal ve anormal kraniofasial yapıların oluşumunu göstermek için farklı bir gelişim aşamalarında zebra balığı embriyoların videoları oluşturmak için kullanıldı. Hücrelerin spesifik grupların Fotoçevrim mümkün onların gelişimini takip etmek için yapar. Craniofac gelişen canlı görüntüleme oluşturmak için bu yöntemle bir yaklaşım ileZebrafish ial yapılar kolay görsel Bu karmaşık bir gelişimsel süreci göstermek için yapım tanıtıldı.
Örnek olarak kaede transgenik zebra balığı: Bu protokol sox10 de etmoid plakanın normal gelişimini kullanarak bu videoları üreten deneyim paylaşımı amaçlanıyor. Bu protokol ayrıca zebrabalıkları kranial nöral krest hücrelerinden türetilen herhangi bir yapının zaman atlamalı videoları hale uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fotoçevrim için Embriyo Koleksiyonu
- Akşam 5 ve 6 arasında kaede transgenik zebra balığı: sox10 en az on çiftleri kurmak.
- Ertesi sabah, bölücüler çekin ve öğle saatlerinde yumurta toplamak. Petri yemekleri aktarmak ve 28.5 ° C inkübatör içine koydu.
- Yaklaşık 24 saat sonra döllenme de, ölü embriyolar kaldırarak Petri kapları temizleyin. Işık alan mikroskopisi ve gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) filtre ile herhangi bir floresan mikroskop kullanılarak embriyo 13 gelişim aşamasını kontrol edin. Kaede Bu filtre aracılığıyla görünür olacaktır.
- Embriyolar ayrı bir Petri kabı içine 60 hpf aktarımı beş parlak floresan embriyoların ulaşmak ve gerekirse bunları dechorionate zaman.
2. Fotoçevrim için Embriyo montajı
- Normal bir floresan mikroskop kullanılarak embriyo monte edin. Konfokal mikroskop embriyo montajı son derece zordur.
- Standı kullanınard E3 su ya da aşağıdaki tarifi kullanarak taze E3 hazırlamak:
1x E3L yapmak için aşağıdaki ekleyin distile su dH 2 O bir litre başına ekleyin:
0.292 g 5,0 mM NaCl
0.013 g 0.17 KCI
0.044 g 0.33 mM CaCl2 (kurutucu 96,% ACS ayıraç)
0.081 g 0,33 mM MgSO 4 (anhydrated)
İsteğe bağlı: Bir mantar ilacı ve heyecan gibi 1X E3% 0.05 metilen mavisi 200 ul ekleyin.
Orta 1 hafta oda sıcaklığında tutar. - Standart tricaine kullanın veya şu tarifi kullanarak tricaine hazırlamak:
0.2,% 5 L için aşağıdaki maddeleri karışımı tricaine:
45 ml tris-Cl (1 M pH 9.5)
5 LH 2 O
10 g tricaine - 46.25 ml E3 3.75 ml% 0.2 tricaine ekleyerek, 'film suyu' (50 ml E3,% 0.015 tricaine çözelti) hazırlayın.
- 50 ml cam bir şişe içinde 46.35 mg, düşük erime noktası (LMP) agaroz ile 46.25 mi E3 su karıştırılarak agaroz hazırlamak ve mikrodalga katı parçacıklar çözülür. Sonra eklemekAgaroz ve kullanıma kadar 50 ° C su banyosu içine agaroz ile cam bir şişeye koymak için 3.73 ml% 0.2 tricaine.
3. Hazırlık ve Embriyo Montaj
- Slaytı adım 1.1.2 ve transfer embriyo yapılan E3/0.015% tricaine çözeltisi ile embriyolar uyutmak.
- Kağıt dokusu ve embriyo üzerine agaroz put ile tüm aşırı E3 içinize çekin.
- Pozisyon embriyo mükemmel Microloader ipuçları ile dorsal. Bütün embriyo agaroz üstünde yüzen, ancak bütün vücudu aşağı itmek değil emin olun. Odası tamamen sıvıyla dolana kadar sonra agaroz gömülü embriyo üzerinde E3/0.015% tricaine çözüm dökün.
4. Eşodaklı Mikroskop Yazılım Ayarlarını
- Embriyo odaklama için; 20X hava dalgıç objektif (iğne deliği boyutu 20 sayısal açıklık 0.75) kullanın. Sonra mikroskop L100 ışık düğmesine basın ve yazılım kanalları seçmek. Simgeleri görünümünü açın / edinimi controls/A1settings ve clickonfokal kurulum düğmesine k. Sonraki 'otomatik' tıklayın ve tekrar penceresini kapatmadan önce şu kanalları seçmek:
Ch1: DAPI kanal 403.4 nm (350-410 nm arasında dalga boyları kullanılabilir)
Ch2: 488.0 nm
Ch3: 561.9 nm
5. Fotoçevrim
- Ch1 ve 3 kapatın ve kaldır kilit düğmesi ve tarama tıklamadan önce Ch2 açın.
- Fotoçevrim için ilgi hücreleri üzerinde durulacak hangi 1frame/sec ve yüksek gerilim (HV) 200 ile başlayan ve daha sonra kare / sn kadar gidiyor ve buna çevresinde 1/32 kare / sn ve HV kadar ulaşan HV düşürerek tarafından yapılan en iyi 100-120, arka plan gürültü bağlı.
- Embriyo odakta olduğunda, ekranın sağ kenarında bakmak yeşil jant kapmak ve Fotoçevrim ve fare ile sağ klik için ilgi alanı sığacak şekilde küçültebilir. Fotoçevrim geri döndürülemez çünkü küçük iyidir.
- 1 ile 200 HV ve kare / sn çevirin ve vurdutarayın. Fotoçevrim alanında bir yakınlaştırılmış görüntü şimdi görünür.
- Ch1'den (403.4 nm) açarak Photoconvert hücreleri. GFP kanalı ile görüldüğü gibi, yeşil kaede neredeyse yok olana kadar bölge boyutuna bağlı olarak, herhangi bir 5-60 saniye photoconverting lazer Açığa.
- Yeşil kaede sinyal neredeyse yok olduğunda, Ch1 kapatın. Ch2 ve 3 açın. Sonra A1 tarama alanı alanında penceresinin üzerine sağ tıklayın ve istenen hücreler photoconverted olsaydı kontrol etmek için 'orijinal boyutuna dönüşünü' çarptı.
6. Z-yığını yapma
- Menü çubuğunda simge 'yakalama Z-serisi' Bul ve başlamadan önce Z-yığını üst ve alt sınırları ayarlamak. LUT'u ayarlayın.
7. Yazılım Ayarları Time-lapse
- A1Simple GUI kutusuna gidin ve aşağıdaki ayarları kene:
1/32 kare / sn
boyutu 1024
ortalama 4 veya 8X bir döngü içinde alınması gereken Z-yığınlarının sayısına bağlı olarak, - : Gitview / kazanım kontrolleri / ND dizisi edinimi ve set zaman çerçevesi (8-30 dk), sürekli tıklayın ve Z-yığını tıklatın. Olarak test öncesi sınırlarını ayarlayın ve film başlar.
- Gün boyunca E3/0.015% tricaine çözüm odasına slayt eklemeye devam. Geceleri, tamamen odasını doldurmak. Yani ertesi sabaha kadar sürecek.
- Ertesi sabah, E3/0.015% tricaine çözüm dolum ve embriyo hala hayatta olup olmadığını kontrol edin. Floresans kaybı ölümünü göstermektedir. Gün boyunca doldurulmasına ve kontrolleri devam ediyor.
- Yapı oluşturan bittikten veya embriyo ölünce, filmi bitirmek.
8. Post-prodüksiyon İşleme
- Araç çubuğunda 'show maksimum yoğunluk projeksiyonu' ı tıklatın, sonra resmin üzerine sağ tıklayın ve yeni bir belge oluşturmak. Video şimdi mümkün olan en iyi kalitede görünür. Gerekli değildir kareleri silmek ve LUT'u ayarlamak için gidin. Nihayet. Avi olarak kaydetmek. Bu biçim, Windows için iyi olacak. Mac indir yazılım to. mov veya. wmv dönüştürmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sox10 in: kaede transgenik hattı, göçmen ve sonrası göç CNCCs floresan yeşil etiketli. Yeşil floresan ile etiketlenmiş kaede CNCC hücreleri, endojen sox10 mRNA ekspresyonunu 5 özetlemek.
Diğer uygulamalar arasında, bu hayvan modeli daha iyi CNCC bağımlı kraniofasial yapıların gelişimini görselleştirmek için kullanılmıştır. Özel yapılar ve aynı zamanda kraniofasiyal malformasyonların patolojik gelişimi, özellikle yarık dudak ve damak normal gelişim yakalandı. Farklı gelişim zaman noktalarında zebrabalıkları canlı time-lapse videolar bir dizi oluşturuldu.
Bir örnek olarak, 60 hpf embriyolar, eşleştirilmiş trabeküller, etmoid bir levha oluşturmak için bir araya hangi bir aşamada seçildi. Etmoid plaka hücrelerin en ön kısmı kırmızı etiketleme ile sonuçlanan tek taraflı hedef Fotoçevrim uygulandı. İlk olarak, normal bir uzatma ve th oluşumuE etmoid plaka vahşi tip Tübingen zebrabalıkları (Şekil 1 ve video 1 bakınız) gözlenmiştir. Etmoid plakanın normal gelişim anlayışı ile, bu vahşi tip başvuru sonra normal gen tedirgin olmuştur embriyolarda CNCCs göçünü karşılaştırmak için uygulanmıştır.
Bir specc1lb morfolino demonte Zebra balığı embriyosu temsili bir örnek olarak seçildi. SPECC1L nadir fakat ciddi eğik yüz yarığı gelişiminde rol ilk gen. Etmoid plaka ikili yüz yarıklaşmanın zebrafish sonuçlarında SPECC1L homolog specc1lb morfolino-tabanlı devirme. Specc1lb antisens morfolino ile enjekte edildiğini 60 hpf embriyolar embriyolar seçilmiş ve etmoid plaka hücrelerin en ön kısmı tek taraflı photoconverted edildi. Etmoid plakanın normal gelişimi, medyan etmoid plaka hücreleri arasındaki kaynaşma başarısızlık aksineve lateral etmoid plaka hücreleri gözlenebilir. Bu lateral nazal süreci ve maksiller öne arasında kaynaşma yetmezliği (video 2 bakınız) oluşur insanlarda ObFC gelişme, patogenezi benzer.
Şekil 1. kaede transgenik zebra balığı: sox10:. 60 hpf sox10 arasında kaede Fotoçevrim A. alttan görünüşü. Yapı şemada yeşil etiketli ve karşılık gelen gerçek canlı görüntü etmoid plakasını andırıyor. Konfokal mikroskop altında (403.4 nm), UV ışığına maruz kaldıktan sonra, floresan protein kaede yeşilden kırmızıya photoconverted edilir. B. Panel B'de gösterildiği gibi hücreler takip edilebilir photoconverted.
Film 1. Zaman atlamalı video 60 hpf sahne Yabanitip Tübingen Zebra balığı embriyosu.Etmoid plakanın normal oluşumu. Alttan görünüşü. 60-72 YGF başlayarak her 30 dk. Recorded filmi görmek için buraya tıklayın .
Movie 2. Zaman atlamalı video 60 hpf sahne specc1lb morfolinodur enjekte embriyo. Medyan Etmoid plaka hücreleri ve lateral etmoid plaka hücreleri arasındaki kaynaşma başarısızlık görülebilir. Alttan görünüşü. 60-72 YGF başlayarak her 30 dk. Recorded filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İşte Zebrafish modelinde kraniofasiyal gelişme görüntülenmesi için yeni bir yöntem gösterilmektedir. Sox10: kaede transgenik zebra balığı hattı başarıyla ayrıntılı CNCC arasında göç desen tanımlamak için kullanılan bir model organizma 5 olarak kullanılır.
Önceki çalışmalar hücrelerini hedef göz gibi brüt işaretlerini kullanmış ve kaede mRNA enjeksiyon, Fotoçevrim tahlillerde veya Fotoçevrim 10, 11, 14, 15 için kafesli floresein dekstran dayanmıştır sox'u:. 10. kaede transgenik hattı bu göre birçok avantajı vardır yöntemleri. Nöral tepe hücreleri, daha önce kaede ve çok özel bir dağıtımına uygun etiketli ile, kader eşleme için bölgeler oluşturulması için daha hassas görülecek kullanılabilmektedir. Buna ek olarak, protein olan kaede sox10 promotörünün kontrolü altında endojen olarak eksprese nöral başlık photoconverted edilmesini sağlar ve sadece bu türevleri daha sonraki bir aşamada etiketlenecektir depotansiyel arka plan 5 katlama.
Bu teknik ile, Zebrafish kraniofasiyal yapı türetilmiş herhangi bir sinir ucu hücrenin oluşumu başarılı bir şekilde gösterilebilir. Normal vahşi tip Zebra balığı embriyolarının gelişimi takip edilebilir ve bu vahşi tip referans normal gen tedirgin olmuştur embriyolara kıyasla olabilir.
Potansiyel değişiklikler gözlem esnasında embriyo düzeltmek için farklı bir konteyner kullanmayı içerir. Bu, bir Petri kabı, ya da başka bir yarı saydam kaset olabilir.
Görüntüleme başarılı değilse, bu nedeniyle yazılım ayarlarında hatalar muhtemeldir. Canlı time lapse başlamadan önce dikkatlice mikroskop kullanıcıları kılavuzunu okuyun.
Görüntüleme iken, embriyonun sağ düzlemine odaklanmak ve hassas Z-yığın sınırları ayarlamak için önemlidir. Dahası, böyle bir kare / sn, ortalama ve versiyonlarını gibi görüntü kalitesi parametreleri iyi wa ayarlamak gerekiryüksek kalitede sonuçlar elde etmek için mümkün y.
Bu tekniğin potansiyel bir sınırlama çevreleyen doku da UV ışınlarına maruz gibi, bir tek hücre bazında etiket hücrelere teknik olarak zor olmasıdır. Hücre çoğalması hızlıdır Bundan başka, eğer, kırmızı etiketleme hücre bölünmesi sonra seyreltme ile kaybolur.
Buna ek olarak, kaede tetramerik ve başka proteinlere kaynaşmış zaman agregatlar oluşturması için bir eğilim vardır. Bu canlı hücre görüntüleme çoğu füzyon uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır.
Canlı time-lapse görüntüleme bilimsel topluluk ve daha geniş bir kitleye, karmaşık gelişimsel deneysel veriler daha erişilebilir hale getirmek için önemli bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar nazik Zebrafish sox10 organizatörü ayıracı paylaşmak için Robert Kelsh teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
