Summary
ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.
Abstract
palatogenesis חוליות הוא תהליך התפתחותי כוריאוגרפיה והמורכב ביותר, הכולל הגירה של רכס עצבי גולגולתי (CNC) תאים, התכנסות והרחבה של בליטות פנים, והתבגרות של שלד craniofacial. כדי ללמוד את התרומה של הרכס העצבי הגולגולת לאזורים ספציפיים של חיך דג הזברה sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד נוצר. Sox10 מספק הגבלת שושלת של חלבון כתב קאאד לרכס העצבי, ובכך הופך את תא תיוג תהליך מדויק יותר מאשר צבע מסורתי או הזרקת mRNA כתב. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שהופך מירוק לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשר לעקוב אחר תאים בדיוק. Sox10: הקו מהונדס קאאד שימש לביצוע ניתוח שושלת להתוות אוכלוסיות תאי CNC כי להצמיח לסת מול לסת תחתון, אלמנטים ולהמחיש הומולוגיה של בליטות פנים לamniotes. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי ליצור וידאו חי זמן לשגות של sox10: עובר דג הזברה קאאד. פיתוח של צלחת כברתי ישמש כדוגמא מעשית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ביצוע הקלטת confocal זמן לשגות של כל קאאד או חלבון כתב photoconvertible דומה בדג זברה מהונדס. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי ללכוד את הפיתוח לא רק נורמלי, אלא גם לא תקין של מבני craniofacial במוטנטים דג הזברה.
Introduction
בתרי orofacial מייצג את עיוות craniofacial הנפוצה ביותר, עם 1/700-1, 000 משלוחים השפיעו 1. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת craniofacial יכול להוביל להיווצרות של שפה שסועה וחך (CL / P). בעוד סיבות לשסועות syndromic הוכחו במידה רבה, את הבסיסים הגנטיים ואפיגנטיים של צורות nonsyndromic של clefting orofacial עדיין צריכים להיחשף 2-4. על מנת להבין את האטיולוגיה ופתוגנזה של מומים אלה, יש צורך להבהיר את התפתחות מבני craniofacial על בסיס סלולארי.
בכל מיני החולייתנים תאי גולגולת עצביים רכס (CNCC) להעביר מהצינור העצבי הגבי כדי לאכלס את קשתות בלוע, אשר יתרמו להיווצרות של מבני orofacial. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת רכס עצבי יכול להוביל להיווצרות של מומים craniofacial כולל CL / P 5-7.
במודעהdition לדמיון מבני בין דג הזברה ופיתוח craniofacial יונקים (CNCCs מתגורר באזורים הומולוגיים), רשת הרגולציה הגן זה שמור ביותר. כמו כן, הוכיח כי CNCCs לפתח באותו אופן בין מיני amniote ודג הזברה 8, מה שהופך את דג הזברה אורגניזם רב עוצמה ללימוד בסיס ההתפתחותי והגנטי של CL / פ יש לו יתרונות רבים, לרבות גודל קטן, מהיר והתפתחות עוברית לשעבר ברחם, ושיעורי גידול גבוהים. יתר על כן, העובר הוא שקוף אופטי, מה שהופך אותו נוח לתצפית של אירועים התפתחותיים מורכבים מתחת למיקרוסקופ 9. זהו מודל חיה אידיאלי לחקר נדידה וההתמיינות של תאי רכס עצביים גולגולתי.
הרחבת בעבר עבודה שפורסמה 8, 10, 11, דפוס הנדידה של CNCC תואר בפירוט באמצעות sox10: המודל המהונדס קאאד 5. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שtuאחיות מוסמכות מירוקים לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשרת לעקוב אחר CNCCs בדיוק. במהלך השינוי הזה את עמוד השדרה פפטיד הוא ביקע, טוען כי ההמרה היא יציבה, כלומר, יכולים להיות במעקב התאים ליעדן הסופי 12. קווים מהונדסים שכותרתו עם קאאד תחת שליטת תעתיק של sox10 הראו כי חיך amniote וצלחת כברתי של דג הזברה נוצרים homologously על ידי שילוב של בליטות הבילטראליים לסת (MXP) עם בולטות frontonasal (FNP) ושתפר היתוך Y בצורת משול בין מינים.
בין יישומים אחרים, sox10: מודל דג הזברה מהונדס קאאד היה לשמש ליצירת קטעי וידאו של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחותיים שונים כדי להראות היווצרות של מבני craniofacial נורמלים ולא נורמליים. Photoconversion של קבוצות ספציפיות של תאים מאפשרת לעקוב אחר התפתחותם. בשיטה זו גישה ליצור הדמיה חיה של פיתוח craniofacמבני ial בדג הזברה הוא הציג, מה שהופך את זה קל מבחינה ויזואלית להדגים תהליך התפתחותי מורכב זה.
פרוטוקול זה מיועד לשיתוף החוויה של יצירת סרטונים אלה באמצעות ההתפתחות התקינה של צלחת כברתי בsox10: דג הזברה מהונדס קאאד לדוגמא ירושלים. פרוטוקול זה עוד יכול להיות מיושם על ביצוע קטעי וידאו הזמן לשגות של כל מבנה שמקורם בתאי רכס עצביים גולגולתי בדג זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אוסף עובר לphotoconversion
- להגדיר לפחות עשרה זוגות של sox10: דג הזברה מהונדס קאאד בין 5 ל 6:00 בערב.
- למחרת בבוקר, למשוך את החוצצים ולאסוף ביצים בסביבות הצהריים. להעביר אותם לצלחות פטרי ולשים אותם לתוך 28.5 חממת מעלות צלזיוס.
- בסביבות 24 הודעה שעה הפריה, לנקות את צלחות פטרי על ידי הסרת עוברים מתים. בדוק את שלב ההתפתחות של עוברים 13 באמצעות מיקרוסקופ שדה אור וכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מסנן (EGFP). קאאד יהיה גלוי דרך מסנן זה.
- כאשר עוברים להגיע 60 העברת hpf חמישה עוברי ניאון בהירים לתוך צלחת פטרי נפרדת וdechorionate במידת צורך.
2. הרכבה של עובר לphotoconversion
- הר את העובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נורמלי. ההרכבה של עוברים על מיקרוסקופ confocal היא מאוד מאתגרת.
- השתמש בדוכןמים ארד E3 או להכין E3 הטרי באמצעות המתכון הבא:
להוסיף את הדברים הבאים לליטר אחד של DH מים מזוקקים 2 O להוסיף את הדברים הבאים כדי להפוך את E3L 1x:
0.292 גרם 5.0 מ"מ NaCl
0.013 גרם 0.17mm KCl
0.044 גרם 0.33mm CaCl 2 (יבוש, 96%, מגיב ACS)
0.081 גרם .33 מ"מ MgSO 4 (anhydrated)
אופציונאלי: להוסיף 200 μl של 0.05% מתילן כחול ל1X E3 כמו פטריות ומערבבים.
בינוני שומר בטמפרטורת חדר למשך השבוע 1. - השתמש tricaine סטנדרטית או להכין tricaine באמצעות המתכון הבא:
ל5 L של .0.2% tricaine לערבב את המרכיבים הבאים:
45 מיליליטר טריס-Cl (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10 tricaine גרם - הכן את 'מיץ סרט' (50 מיליליטר E3, 0.015% פתרון tricaine), על ידי הוספת tricaine 3.75 מיליליטר 0.2% ל46.25 מיליליטר E3.
- הכן את agarose על ידי ערבוב 46.25 מיליליטר מים E3 עם נקודת 46.35 מ"ג נמוך היתוך agarose (LMP) בבקבוק זכוכית 50 מ"ל ולפזר חלקיקים מוצקים על ידי במיקרוגל. לאחר מכן להוסיף3.73 tricaine 0.2% מיליליטר לagarose ולשים את בקבוק זכוכית עם agarose לתוך 50 ° C אמבט מים עד שימוש.
3. הכנה והרכבה של עובר
- הרדימי עובר עם E3/0.015% פתרון tricaine עשה בשלב 1.1.2 ועובר העברה לתא שקופיות.
- לספוג את כל עודפי E3 עם רקמת נייר ולשים agarose על עובר.
- עובר עמדה מגבה בצורה מושלמת עם טיפים microloader. ודא שכל העובר אינו מרחף על גבי agarose, אבל לדחוף את הגוף כולו. ואז לשפוך E3/0.015% פתרון tricaine על עובר מוטבע agarose עד החדר מתמלא באופן מלא בנוזל.
4. התאמת הגדרות תוכנה על Confocal מיקרוסקופ
- השתמש אובייקטיבי 20X אוויר immersible (צמצם מספרי 0.75; גודל חריר 20) למיקוד העובר. ואז ללחוץ על כפתור אור L100 על המיקרוסקופ ובחר ערוצים בתוכנה. controls/A1settings לפתוח את הסמלים להציג / רכישה וclick confocal התקנת הכפתור. הבא לחץ על 'אוטומטי' ובחר ערוצים הבאים לפני סגירת החלון שוב:
CH1: ננומטר DAPI ערוץ 403.4 (ניתן להשתמש באורכי גל שבין 350-410 ננומטר)
CH2: 488.0 ננומטר
CH3: 561.9 ננומטר
5. Photoconversion
- כבה את CH1 ו -3 ולהדליק CH2 לפני לחיצה על לחצן משתלבים הסרה וסריקה.
- להתמקד בתאים של עניין לphotoconversion, שהוא הטוב ביותר שנעשה על ידי הפעלה עם מתח 1frame/sec וגבוה (HV) 200 ולאחר מכן עולה במסגרות / השנייה והוריד HV בהתאם עד שמגיע 1/32 מסגרות / sec וHV סביב 100-120, תלוי ברעש הרקע.
- כאשר העובר הוא בפוקוס, נראה בקצה הימני של מסך, לתפוס את השפה הירוקה ולהפוך אותו קטן יותר, כך שהוא מתאים לאזור של עניין לphotoconversion קליק ימני עם העכבר. קטן יותר הוא טוב יותר, כי photoconversion היא בלתי הפיכה.
- הפעל מסגרות / sec עד 1 וHV 200 ופגעלסרוק. תמונה מוגדלת באזור של photoconversion גלויה עכשיו.
- תאי Photoconvert ידי הפעלת CH1 (403.4 ננומטר). לחשוף לליזר photoconverting כל מקום 5-60 שניות, תלוי בגודל של האזור עד קאאד הירוק כפי שניתן לראות דרך ערוץ ה-GFP הוא כמעט נעדר.
- כאשר אות קאאד הירוקה היא כמעט נעדר, לכבות CH1. הפעל CH2 ו -3 ב. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על חלון בשדה אזור סריקת A1 ופגעתי 'חזרה לגודל מקורי' כדי לבדוק אם תאים רצויים היו photoconverted.
6. מה שהופך את Z-מחסנית
- מצא את הסמל "Z-הסדרה ללכוד" בשורת התפריט והיכולת להציב גבולות העליונים ותחתונים של Z-מחסנית לפני שמתחילים אותו. הגדר LUTs.
7. תוכנת הגדרות זמן לשגות
- עבור לתיבת A1Simple GUI וסמן את ההגדרות הבאות:
1/32 מסגרות / sec
גודל 1024
ממוצע או 8X 4 תלוי במספר של Z-ערימות שיש לקחת בלולאה אחת - עבור אל:פקדי תצוגה / רכישה / רכישת רצף ND ומסגרת זמן שנקבע (8-v30), לחץ מתמשך ולחץ על Z-מחסנית. הגדר גבולות כפי שנבדק בעבר ולהתחיל סרט.
- המשך להוסיף E3/0.015% קאמרי שקופיות פתרון tricaine לאורך כל היום. בלילה, למלא את האולם לחלוטין. שיימשך עד למחרת בבוקר.
- למחרת בבוקר, למלא E3/0.015% פתרון tricaine ולבדוק אם עובר הוא עדיין בחיים. הפסד של הקרינה מצביע על מוות. המשך מילוי ובדיקות לאורך כל היום.
- כאשר המבנה סיים להרכיב, או את העובר מת, לסיים את הסרט.
8. עיבוד פוסט פרודקשן
- לחץ על 'הקרנת מופע מקסימום עוצמת' בסרגל כלים, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה וליצור מסמך חדש. הווידאו הוא נראה באיכות הטובה ביותר האפשרית עכשיו. ללכת על מנת להסיר מסגרות שאינם נחוצות ולהתאים LUTs. לבסוף לשמור כ. avi. פורמט זה יהיה בסדר עבור Windows. עבור לא תוכנה להורדת מקo להמיר. mov או. wmv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בsox10: CNCCs קו מהונדס קאאד, נדידה והודעה נודדת שכותרתו fluorescently ירוקה. תאי CNCC שכותרתו עם קאאד פלואורסצנטי הירוק לסכם ביטוי mRNA sox10 אנדוגני 5.
בין יישומים אחרים, מודל חיה זה שימש כדי להמחיש את הפיתוח של מבני craniofacial תלויים CNCC טוב יותר. התפתחות תקינה של מבנים ספציפיים וגם התפתחות פתולוגית של מומים Craniofacial, שפה שסועה וחך במיוחד כבר נתפסה. סדרה של קטעי וידאו זמן לשגות חי של דג הזברה בנקודות זמן התפתחותיים שונים כבר נוצרה.
כדוגמא, עובר ב60 hpf, שלב שבו trabeculae לזווג נפגש כדי ליצור את צלחת כברתי, נבחרו. photoconversion חד צדדית ממוקדת וכתוצאה מהתיוג האדום של החלק הקדמי ביותר של תאים בצלחת כברתי בוצעה. ראשית, ההארכה והיווצרות של ה הרגילותדואר צלחת כברתי נצפתה בדג זברת טובינגן סוג בר (ראה איור 1 ווידאו 1). עם הבנה של התפתחות הנורמלית של צלחת כברתי, התייחסות מהסוג בר זה הייתה לאחר מכן להחיל להשוות הגירה של CNCCs בעוברים בו ביטוי גנים רגיל כבר מוטרד.
עובר דג הזברה מציאה morpholino specc1lb נבחר כדוגמא מייצגת. SPECC1L הוא את הגן הראשון מעורב בפיתוח של שסע הפנים האלכסוני הנדיר אך חמור. מציאה מבוססת morpholino של specc1lb homolog SPECC1L בתוצאות דג הזברה בclefting פנים דו צדדי בצלחת כברתי. עוברים ב60 עוברי hpf שהוזרקו specc1lb antisense morpholino נבחרו ובחלק הקדמי ביותר של תאי צלחת כברתי היה photoconverted באופן חד צדדי. בניגוד להתפתחות תקינה של צלחת כברתי, כישלון של איחוי בין תאי צלחת כברתי חציוןויכולים להיות שנצפו תאי צלחת כברתי לרוחב. זה דומה פתוגנזה של פיתוח ObFC בבני אדם, שבו כישלון של היתוך בין תהליך האף לרוחב ובולטות לסת מתרחש (ראה וידאו 2).
איור 1. sox10:. photoconversion קאאד תצוגת א הגחון של 60 sox10 hpf: דג הזברה מהונדס קאאד. המבנה שכותרתו ירוק בתרשים ותמונת חיים האמיתי המקבילה דומה לצלחת כברתי. לאחר חשיפה לאור UV (ב403.4 ננומטר) תחת מיקרוסקופ confocal, קאאד החלבון פלואורסצנטי הוא photoconverted מירוק לאדום. ב photoconverted ניתן בעקבות תאים כפי שמוצגים בלוח ב '.
סרט 1. עובר דג הזברה טובינגן זמן לשגות וידאו 60 wildtype שלב hpf.היווצרות רגילה של צלחת כברתי. צפו בגחון. הקלטות כל 30 דקות מתחילות 60-72 hpf. לחצו כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. עובר morpholino specc1lb שלב 60 hpf וידאו זמן לשגות מוזרק. כישלון של איחוי בין תאי חציון כברתי צלחת וצלחת תאי כברתי לרוחב ניתן לצפות. צפו בגחון. הקלטות כל 30 דקות מתחילות 60-72 hpf. לחצו כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה שיטה חדשה להדמיה של פיתוח craniofacial במודל דג הזברה מוצגת. Sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד כבר השתמש בהצלחה כדי לתאר את דפוס הנדידה של CNCC בפירוט משמש כאורגניזם מודל 5.
מחקרים קודמים השתמשו בציוני דרך גולמית כגון העין למקד את התאים ויש לסמוך על הזרקת mRNA קאאד, מבחני photoconversion או dextran והעמסת בכלוב לphotoconversion 10, 11, 14, 15 סוקס:. יש 10 קאאד קו מהונדס יתרונות רבים בהשוואה לאלה שיטות. עם תאי רכס עצביים כבר שכותרתו עם קאאד ועומדות להפצה מאוד מסוימת, ניתן להשתמש בציוני דרך מדויקות יותר לקביעת אזורים למיפוי גורל. בנוסף, חלבון קאאד שהביע באופן אנדוגני תחת השליטה של אמרגן sox10 מבטיח שתאי רכס עצביים רק photoconverted ושנגזר רק להיות מתויג בשלב מאוחר יותר, דהקמטי רקע פוטנציאל 5.
בעזרת טכניקה זו, היווצרות של כל תאי רכס עצביים הנגזרים מבנה craniofacial בדג זברה יכולה להיות מוצגת בהצלחה. ההתפתחות של עוברי דג הזברה סוג הבר נורמלים יכולה להיות אחרי והתייחסות סוג בר זה יכול להיות בהשוואה לעוברים בו ביטוי גנים רגיל כבר מוטרד.
שינויים אפשריים כוללים שימוש במכל שונה כדי לתקן את העובר במהלך הדמיה. זה יכול להיות בצלחת פטרי, או כל מגש שקוף אחר.
אם ההדמיה היא לא מוצלחת, זה כנראה עקב טעויות בהגדרות תוכנה. קראו את המדריך למשתמשים של המיקרוסקופ בעיון לפני תחילת זמן לשגות בשידור חי.
בעוד הדמיה, חשוב להתמקד במטוס תקין של העובר ולקבוע את גבולות Z-מחסנית בדיוק. יתר על כן, יש פרמטרים של איכות תמונה כגון מסגרות / sec, ממוצע וLUTs כדי להיות מוגדרים בwa הטוב ביותרy האפשר על מנת לקבל תוצאות באיכות גבוהה.
הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא, שזה מאתגר מבחינה טכנית לתאי תווית על בסיס תא בודד, כמו רקמה שמסביב היא גם נחשפת לאור UV. יתר על כן, אם התפשטות תאים היא מהירה, הסימון האדום הולך לאיבוד דרך דילול לאחר חלוקת תא.
בנוסף, קאאד הוא tetrameric ויש לו נטייה ליצירת אגרגטים כאשר התמזגו לחלבונים אחרים. זה מגביל את השימוש בו ברוב יישומי פיוז'ן בהדמיה תא חי.
הדמיה לחיות זמן לשגות היא כלי חשוב כדי להפוך את נתוני ניסוי התפתחותית מורכבים לנגישים יותר לקהילה המדעית וקהל רחב יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים רוברט Kelsh לחביבות שיתוף מגיב אמרגן sox10 דג הזברה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
