Summary
Визуализация экспериментальных данных стала ключевым элементом в представлении результатов для научного сообщества. Генерация живой покадровой записи растущих эмбрионов способствует лучшей презентации и понимания сложных процессов развития. Этот протокол является шаг за шагом руководство по маркировке элементов через фотопреобразования Kaede белка у рыбок данио.
Abstract
Позвоночных палатогенезе является весьма Choreographed и сложный процесс развития, который включает в себя миграцию черепной нервного гребня (ЧПУ) клеток, конвергенции и расширения лицевых протуберанцев, и созревание черепно-лицевой скелет. Для изучения вклада черепной нервного гребня в конкретных регионах данио неба SOX10: Kaede трансгенных данио линия была сгенерирована. Sox10 предоставляет клонов ограничение Kaede репортера белка нервного гребня, тем самым делая клетку маркировка более точное процесс, чем традиционные краски или репортера инъекции мРНК. Kaede является фото-кабриолет белок, который меняет цвет с зеленого на красный после активации фото и дает возможность следить клетки точно. В Sox10: Kaede трансгенной линии была использована для выполнения анализа клонов очертить клеточные популяции с ЧПУ, которые приводят к верхнечелюстной против нижней челюсти элементов и иллюстрирующие гомологии лица протуберанцев в амниот. Этот протокол описывает шагс генерировать живой покадровой видео в Sox10: Kaede данио эмбрионов. Развитие решетчатой пластине будет служить в качестве практического примера. Этот протокол может быть применен, чтобы сделать покадровой конфокальной запись любого Kaede или аналогичного photoconvertible репортерного белка в трансгенных данио рерио. Кроме того, он может быть использован для захвата не только нормальным, но также аномалии развития черепно-лицевых структур в данио мутантов.
Introduction
Орофациальные расщелины представляют собой наиболее распространенную черепно-лицевой деформации, с 1/700-1, 000 поставки затронуты 1. Срыв начале эмбрионального черепно-лицевого развития может привести к образованию расщелиной губы и неба (CL / P). В то время как причины синдромному щели были в значительной степени показано, генетические и эпигенетические основы несиндромальных форм орофациального clefting все еще должны быть обнаружены 2-4. Для того, чтобы понять этиологию и патогенез этих пороков, необходимо осветить развитие черепно-лицевых структур на сотовой основе.
Во всех позвоночных животных черепных клетки нервного гребня (CNCC) мигрируют из дорсальной части нервной трубки для заполнения глотки арки, которые будут способствовать формированию орофациальных структур. Срыв начале эмбрионального развития нервного гребня может привести к образованию черепно-лицевых пороков развития, включая CL / P 5-7.
В рекламуусловие для структурного сходства между рыбок данио и млекопитающих черепно-лицевого развития (CNCCs проживают в гомологичных областей), регулирующий генная сеть высоко консервативен. Кроме того, было показано, что CNCCs разработать таким же образом, между амниот видов и данио 8, что делает данио мощный организм для изучения развития и генетической основы CL / P. Она имеет много преимуществ, в том числе малого размера, быстрое и экс-маточно эмбрионального развития, и высокий уровень селекции. Кроме того, эмбрион является оптически прозрачным, что делает его доступным наблюдения сложных событий развития под микроскопом 9. Это идеальная модель для животных для изучения миграции и дифференциации черепных клеток нервного гребня.
Развивая ранее опубликованные работы 8, 10, 11, миграционную картину CNCC было подробно описано с помощью SOX10: Kaede трансгенных модели 5. Kaede является фото-кабриолет белок, который туRNS с зеленого на красный после активации фото и позволяет точно проследить CNCCs. Во время этой трансформации пептидный скелет расщепляется, предполагая, что преобразование является стабильным, а это означает, что клетки могут быть отслежены в конечный пункт назначения 12. Трансгенные линии, помеченные Kaede под транскрипционный контроль Sox10 показали, что амниот небо и решетчатая пластинка рыбок данио формируются гомологично путем слияния двусторонних гайморовых протуберанцев (MXP) с фронтоназальной известность (ФНП) и что Y форме слияния шов аналогично между видов.
Среди других приложений, то Sox10: Kaede трансгенных данио модели был использован для создания видео эмбрионов данио на разных стадиях развития, чтобы показать формирование нормальных и ненормальных черепно-лицевых структур. Фотопреобразования конкретных групп клеток позволяет отслеживать их развитие. С помощью этого метода подход к созданию живого изображения разработки craniofacМВЛ структуры в данио вводится, что позволяет легко визуально продемонстрировать этот сложный процесс развития.
Этот протокол направлен на обмен опытом генерации эти видео, используя нормальное развитие решетчатой пластине в Sox10: Kaede трансгенных данио в качестве примера. Этот протокол может дополнительно применяться к созданию покадровой видео любой структуры, полученной из черепных клеток нервного гребня у рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Эмбрионов для фотопреобразования
- Настройте по крайней мере, десять пар Sox10: Kaede трансгенных данио между 5 и 6 вечера в вечер.
- На следующее утро, потяните разделители и собирать яйца около полудня. Передача их в чашки Петри и положить их в 28,5 ° С инкубатор.
- Около 24 часа в сутки после оплодотворения, очистите чашки Петри, удаляя мертвые эмбрионы. Проверьте стадии развития эмбрионов 13 с использованием светового поля микроскопии и любой флуоресцентного микроскопа с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) фильтра. Kaede будет виден через этот фильтр.
- Когда эмбрионы достигают 60 HPF трансфер пять ярко люминесцентные эмбрионов в отдельную чашку Петри и dechorionate их при необходимости.
2. Монтаж эмбрионов для фотопреобразования
- Установите эмбриона с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Монтаж эмбрионов на конфокальной микроскопии является чрезвычайно сложной задачей.
- Используйте стендARD E3 воды или готовить свежий E3, используя следующий рецепт:
Добавьте следующее в одном литре дистиллированной воды дН 2 O добавить следующее, чтобы сделать 1x E3L:
0,292 г 5,0 ммоль NaCl
0,013 г 0,17 мм KCl
0,044 г 0,33 мм CaCl 2 (осушитель, 96%, ACS реагент)
0,081 г 0,33 ммоль MgSO 4 (anhydrated)
Дополнительно: добавить 200 мкл 0,05% метиленового синего в 1X E3 в качестве фунгицида и перемешать.
Средний держит при комнатной температуре в течение 1 недели. - Используйте стандартный Tricaine или подготовить Tricaine используя следующий рецепт:
Для 5 л 0,2% Tricaine смешивать следующие ингредиенты:
45 мл Трис-Cl (1M pH9.5)
5 LH 2 O
10 г Tricaine - Подготовьте 'кино сок' (50 мл E3, 0,015%-ный раствор Tricaine), путем добавления 3,75 мл 0,2% Tricaine к 46,25 мл E3.
- Подготовка агарозном путем смешивания 46.25 мл E3 воды с 46,35 мг низкой температурой плавления (LMP) агарозном в стеклянную колбу 50 мл и растворить твердые частицы в микроволновую печь. Затем добавить3.73 мл 0,2% Tricaine в агарозном и поставить стеклянную колбу с агарозы в 50 ° С водяной бане, пока использования.
3. Подготовка и монтажа эмбрионов
- Обезболить эмбрионов с E3/0.015% раствора Tricaine сделали в шаге 1.1.2 и переноса эмбриона в камере слайда.
- Окунитесь все излишки E3 с бумажной салфеткой и положить агарозном на эмбрион.
- Статус эмбриона прекрасно спинной с советами microloader. Убедитесь, что весь эмбрион не плавает на верхней части агарозы, но толкать все тело вниз. Затем влить E3/0.015% раствор Tricaine над агарозы встроенной эмбриона до камеры не будет полностью заполнен жидкостью.
4. Регулировка настроек программного обеспечения на конфокальной микроскопии
- Используйте 20X воздуха Погружные цель (числовая апертура 0,75; обскуры размер 20) для фокусировки эмбрион. Затем нажмите кнопку L100 света на микроскоп и выбора каналов в программном обеспечении. Controls/A1settings открыть иконки просмотра / приобретения и сделайте кликК кнопку конфокальной установки. Следующая нажмите "Auto" и выберите следующие каналы, прежде чем снова закрыв окно:
Канал 1: DAPI канала 403,4 нм (длины волн между 350-410 нм может быть использован)
CH2: 488.0 нм
Ch3: 561,9 нм
5. Фотопреобразования
- Выключите CH1 и 3 и включите Ch2 перед нажатием кнопки удалить блокировки и сканирования.
- Сосредоточьтесь на клетках интерес для фотопреобразования, который лучше всего сделать, начиная с 1frame/sec и высокого напряжения (HV) 200, а затем растет в кадров / сек и не понижая HV соответственно до достижения 1/32 кадр / с и HV вокруг 100-120, в зависимости от фонового шума.
- Когда эмбрион находится в фокусе, посмотрите на правом краю экрана, захватить зеленую оправу и сделать его меньше, поэтому он подходит сферу интересов для фотопреобразования и щелкните правой кнопкой мыши с помощью мыши. Чем меньше, тем лучше, потому что фотопреобразования необратим.
- Поверните кадр / с до 1 и HV 200 и ударилсканирование. Увеличено изображение области фотопреобразования теперь видны.
- Photoconvert клетки, поворачивая по каналу 1 (403,4 нм). Expose к photoconverting лазера везде от 5-60 секунд, в зависимости от размера области, пока зеленый Kaede как видно через GFP канала не практически отсутствует.
- Когда зеленый сигнал Kaede практически отсутствует, поверните Ch1 прочь. Включите Ch2 и 3 на. Затем нажмите направо на окне на A1 сканирования поля области и нажмите 'возвращение к исходному размеру', чтобы проверить при желании клетки photoconverted.
6. Создание Z-Stack
- Найти иконку «захвата Z-серии» в строке меню и установить верхние и нижние пределы Z-стека, прежде чем начать его. Установите ТМП.
7. Программные Настройки Покадровый
- К коробке A1Simple GUI и отметьте следующие параметры:
1/32 кадров / сек
Размер 1024
средний 4 или 8-кратным зависимости от количества Z-стеки, который должен приниматься в одной петле - Перейти к:управления вид / приобретение / приобретение последовательность ND и установить временные рамки (8-30мин), нажмите непрерывным и нажмите Z-Stack. Установите границы как испытано перед и начать фильм.
- Продолжайте добавлять E3/0.015% Tricaine решение камеры слайд в течение дня. Ночью, заполнить камеру полностью. Это продлится до следующего утра.
- На следующее утро, пополнить E3/0.015% раствор Tricaine и проверить, если эмбрион еще жив. Потеря флуоресценции указывает смерть. Продолжить добавление и проверок в течение дня.
- Когда структура закончила формирование или эмбрион умер, закончить фильм.
8. Пост-продакшн Обработка
- Нажмите "проявлять максимальную проекцию интенсивности" на панели инструментов, а затем щелкните правой кнопкой мыши на изображении и создать новый документ. Видео теперь видны в лучшем качестве. Перейти на удалить кадры, которые не нужны и отрегулируйте ТМП. Наконец сохранить как. AVI. Этот формат будет хорошо для Windows. Для Mac скачать программное обеспечение то преобразовать в. мов или. WMV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В Sox10: Kaede трансгенной линии, миграционные и после перелетные CNCCs помечены флуоресцентно зеленый. В CNCC клетки, меченные зеленым флуоресцентным Kaede резюмировать эндогенной экспрессии Sox10 мРНК 5.
Среди других приложений, эта модель животное использовали лучше визуализировать развитие CNCC зависимых черепно-лицевых структур. Нормальное развитие специфических структур, а также патологического развития черепно-лицевой пороков развития, особенно расщелиной губы и неба были захвачены в плен. Серия живых покадровой видео данио на разных развития временных точках была сформирована.
В качестве примера эмбрионов на 60 часов после оплодотворения, этап, на котором парные трабекулы встретились с образованием решетчатой пластины были выбраны. Односторонний проводили целевой фотопреобразования в результате чего красной маркировки самой передней части клеток в решетчатой пластине. Во-первых, нормальное расширение и формирование гоэ решетчатая пластинка наблюдался в дикого типа Тюбингена рыбок данио (см. Рисунок 1 и видео 1). С пониманием нормального развития решетчатой пластине, эта ссылка дикого типа затем наносили сравнить миграцию CNCCs в эмбрионах, где нормальная экспрессия гена была возмущенных.
Specc1lb морфолино нокдаун данио эмбрион был выбран в качестве репрезентативного примера. SPECC1L первый ген вовлечен в развитие редкой, но тяжелой наклонной лицевой щели. Морфолино основе нокдаун SPECC1L гомолога specc1lb в данио приводит к двусторонней лица clefting в решетчатой пластине. Эмбрионы в 60 HPF эмбрионов, которые были вводили specc1lb антисмысловое морфолино были отобраны и наиболее передняя часть решетчатой пластины клеток photoconverted в одностороннем порядке. В отличие от нормального развития решетчатой пластине, отказ слияния между срединных решетчатой пластины клетоки боковые решетчатые пластины клетки можно было наблюдать. Это напоминает патогенез развития ОКЗДП в организме человека, где выход из строя слияния между боковой процесса носа и гайморовой известность происходит (см. видео 2).
Рисунок 1. Sox10:. Kaede фотопреобразования А. Брюшной вид 60 HPF Sox10: Kaede трансгенных данио. Структура помечены зеленым на схеме и соответствующий реальный живой образ напоминает решетчатой пластины. После облучения ультрафиолетовым светом (на 403,4 нм) под конфокальной микроскопии, флуоресцентный Kaede белок photoconverted с зеленого на красный. В. photoconverted клетки можно проследить, как показано на панели B.
Фильм 1. Временной интервал видео 60 этап оплодотворения дикого типа Тюбинген данио эмбрионов.Нормальная формирование решетчатой пластине. Брюшной вид. Записанные каждые 30 мин, начиная 60-72 ФВЧ. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Фильм 2. Временной интервал видео 60 оплодотворения этап specc1lb морфолино вводят эмбрион. Отказ слияния между срединных решетчатой пластины клеток и боковых решетчатой пластины клеток можно наблюдать. Брюшной вид. Записанные каждые 30 мин, начиная 60-72 ФВЧ. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь новый метод визуализации черепно-лицевого развития в данио модели показана. В Sox10: Kaede трансгенных данио линия была успешно используемые для описания миграционную картину CNCC подробно используется в качестве модельного организма 5.
Предыдущие исследования использовали грубые достопримечательности, такие как глаза к клеткам-мишеням и полагались на Kaede мРНК инъекций, фотопреобразования анализов или клетке флуоресцеина декстрана для фотопреобразования 10, 11, 14, 15 Носки:. 10 Kaede трансгенной линии имеет много преимуществ по сравнению с их методы. С клетки нервного гребня уже помечены Kaede и в соответствии с очень конкретной распределения, могут быть использованы более точные ориентиры для установления регионы для картирования судьбы. Кроме того, имея Kaede белок, экспрессируемый эндогенно под контролем промотора в SOX10 гарантирует, что только клетки нервного гребня являются photoconverted и что только производные будут помечены на более позднем этапе, деростом потенциального фон 5.
С помощью этого метода, формирование любого нервного гребня клеток, полученной черепно-лицевой структуру, в данио может быть успешно показано на рисунке. Развитие нормальных эмбрионов рыбок данио дикого типа можно проследить и эта ссылка дикого типа можно сравнить с эмбрионами, где нормальная экспрессия гена была возмущенных.
Потенциальные изменения включают в себя использование другой контейнер, чтобы исправить эмбрион во время визуализации. Это может быть чашка Петри, или любой другой прозрачный лоток.
Если изображения не удается, это, вероятно, из-за ошибок в настройках программного обеспечения. Прочитать инструкцию пользователи микроскопа тщательно, прежде чем начать жить промежуток времени.
В то время как изображения, крайне важно, чтобы сосредоточиться на правой плоскости зародыша и точно установить границы Z-Stack. Кроме того, параметры качества изображения, такие как кадров / сек, в среднем и ТМП должны быть установлены в лучшем вау возможное для того, чтобы получить качественный результат.
Потенциальным ограничением этого метода является то, что это технически сложно этикеток клеток на одном основе клеток, как окружающие ткани также воздействию УФ-света. Кроме того, если пролиферация клеток является быстрым, красный маркировка теряется через разбавления после деления клетки.
Кроме того, Kaede является тетрамерная и имеет тенденцию к образованию агрегатов при слиянии с другими белками. Это ограничивает его использование в большинстве приложений синтеза в изображений живых клеток.
Изображений живых покадровой является важным инструментом, чтобы сделать сложные развития экспериментальные данные более доступными для научного сообщества и широкой аудитории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы благодарят Роберт Kelsh за любезно обмена данио Sox10 промоутер реагента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
