Summary
实验数据的可视化已成为展示结果给科学界的一个关键因素。越来越多的胚胎活延时录制的产生有助于复杂的发育过程中更好地介绍和了解。该协议是一步一步的通过枫蛋白在斑马鱼光转化指南细胞标记。
Abstract
脊椎动物palatogenesis是一个非常精心设计和复杂的发展过程，它涉及颅神经嵴（CNC）细胞，收敛性和扩展面部日珥，以及颅面骨骼成熟的迁移。研究颅神经嵴向斑马鱼口感的特定区域一个SOX10的贡献：生成枫转基因斑马鱼线。 SOX10提供枫报告蛋白的谱系限制性的神经嵴，从而使细胞标记更精确的处理比传统的染料或报告mRNA注射。枫是光转换蛋白，由绿色变为红色光激活后，使人们有可能跟随细胞精确。该SOX10：转基因枫线被用来执行谱系分析，划定数控细胞群产生上颌下颌与元素，并说明同源性面部日珥到脊椎动物。本协议描述了一步s到产生SOX10的生存时间推移视频：枫斑马鱼胚胎。筛窦板的发展将成为一个实际的例子。这个协议可以应用于制作转基因斑马鱼任何枫或类似photoconvertible报告蛋白的时间推移共聚焦记录。此外，它可以被用来捕捉颅面结构在斑马鱼突变体不仅正常，而且还发育异常。
Introduction
口面裂代表了最普遍的颅面畸形，与1/700-1，000分娩的影响1。早期胚胎颅面部发育受阻可导致形成唇腭裂（CL / P）的。虽然原因综合征型唇裂已经在很大程度上表明，中颜面部的clefting的非综合征形式的遗传和表观遗传基础仍需要发现2-4。为了了解这些畸形的病因和发病机制，有必要阐明颅面结构的细胞基础上的发展。
在所有的脊椎动物物种颅神经嵴细胞（CNCC）从背神经管迁移到填充咽弓，这将有助于形成颜面部结构。早期胚胎神经嵴发育受阻可导致形成颅面畸形包括CL / P 5-7。
在广告DITION以斑马鱼和哺乳动物颅面部发育（CNCCs位于同源区域）之间的结构相似性，基因调控网络是高度保守的。还已经表明，CNCCs开发在脊椎动物物种和斑马鱼8之间以相同的方式，使斑马鱼的强大有机体为CL / P的发育和遗传基础的研究它有许多优点，包括体积小，快速，前宫内胚胎发育，以及高繁殖率。此外，胚胎是光学透明的，使得它适合于观察的显微镜9根据复杂的发育事件。这是一个理想的动物模型进行迁移和颅神经嵴细胞分化的研究。
枫转基因模型5：扩大先前发表的作品8，10，11，国家会议中心的迁徙模式是使用SOX10中详细描述。枫是一个照片兑换蛋白TU从绿色到红色RNS光活化后，使之能够追踪CNCCs精确。在此变换的肽骨架被裂解，这表明转化是稳定的，这意味着细胞可以被跟踪到其最终目的地12。标记下SOX10的转录调控枫转基因株系表明，脊椎动物味觉和斑马鱼筛片是同源融合双侧上颌骨突起（MXP）的额鼻突出（FNP），而形成的Y字型融合缝之间的相似种。
在其他应用中，SOX10：枫转基因斑马鱼模型被用来生成斑马鱼胚胎的视频在不同的发育阶段，以显示形成的正常和异常颅面结构。细胞的特定群体的光转化使得能够跟踪他们的发展。使用这种方法的方法来创建开发craniofac的实时成像IAL结构在斑马鱼被引入，因此很容易直观地展现这个复杂的发展过程。
该协议旨在共享使用筛窦板的SOX10的正常发展产生这些视频的经验：枫转基因斑马鱼作为一个例子。此协议可进一步应用于制造从颅神经嵴细胞在斑马鱼产生的任何结构的时间推移录像。
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Protocol
1。胚胎收集的光转化
- 设置至少十对SOX10的：晚上5至下午6时枫转基因斑马鱼。
- 第二天早上，拉分频器和收集中午前后鸡蛋。他们转移到培养皿中，并把它们放到28.5℃培养箱。
- 在大约24小时受精后，通过去除死胚清洁的培养皿。检查是否使用了光场显微镜和任何荧光显微镜与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）过滤胚胎13的发展阶段。枫将是可见的，通过这个过滤器。
- 当胚胎达到60 HPF转移5明亮的荧光的胚胎成一个单独的培养皿中，并在必要时dechorionate他们。
2。安装胚胎的光转化的
- 使用普通荧光显微镜安装胚胎。安装在激光共聚焦显微镜的胚胎是非常有挑战性的。
- 使用支架ARD E3水或使用下面的食谱准备新鲜E3：
添加每升蒸馏水DH 2 O以下添加以下做出1X E3L：
0.292克5.0 mM氯化钠
0.013克0.17MM氯化钾
0.044克0.33MM 氯化钙 （干燥剂，96％，ACS试剂）
0.081克0.33毫米硫酸镁4（anhydrated）
可选：添加200微升0.05％亚甲蓝到1X E3作为杀真菌剂，搅拌。
介质保持在室温下放置1周。 - 使用标准的三卡因或使用下面的食谱准备三卡因：
5升0.2％三卡因混合下列成分：
45毫升三 - 氯（1M pH9.5的）
5 LH 2 O
10克三卡因 - 准备“电影果汁”（50毫升E3，0.015％三卡因溶液），加入3.75毫升0.2％三卡因至46.25毫升E3。
- 通过混合46.25毫升E3水在一个50毫升玻璃烧瓶46.35毫克低熔点（LMP）琼脂糖制备琼脂糖和由微波溶解的固体颗粒。然后加3.73毫升0.2％三卡因琼脂糖，把琼脂糖玻璃烧瓶至50℃水浴中，直到使用。
3。准备和胚胎的安装
- 麻醉胚胎与步骤1.1.2和转移胚胎到腔幻灯片制作E3/0.015％三卡因溶液。
- 吸收所有多余的E3与纸巾及认沽琼脂糖到胚胎。
- 位置胚胎完全与背微加载的提示。确保在整个胚胎不浮于琼脂糖的顶部，但整个身体向下推。然后倒入E3/0.015％三卡因溶液在琼脂糖嵌入式胚胎，直到腔被完全充满液体。
4。调整软件设置上的共聚焦显微镜
- 使用20X空气浸入式物镜（数值孔径0.75;针孔大小20）为重点的胚胎。然后按下显微镜L100光按钮并选择软件的渠道。打开图标查看/收购controls/A1settings与集团公司k是共聚焦设置按钮。接下来，单击“自动”，然后再次关闭该窗口之前选择以下途径：
CH1：DAPI通道403.4纳米（可用于350-410纳米之间的波长）
CH2：488.0纳米
CH3：561.9纳米
5。光转化
- 关闭通道1和3，然后点击删除按钮联锁和扫描之前打开通道2。
- 专注于感兴趣的光转化，细胞是最好的开始1frame/sec和高压（HV）200，然后往上走在帧/秒，并降低相应的高压，直至达到1/32帧/秒和HV左右完成100-120，根据背景噪声。
- 当胚胎在焦点上，看在屏幕的右侧边缘，抓住绿色边缘，使其更小，因此对于光转化，然后右击鼠标适合感兴趣的区域。越小越好，因为光转化为不可逆的。
- 打开帧/秒，以1和HV 200和打扫描。光转化的区域的放大图像现在是可见的。
- Photoconvert细胞通过打开通道1（403.4纳米）。暴露在photoconverting激光随时随地从5-60秒，这取决于区域的大小，直到通过GFP的通道看到绿枫几乎是缺席的。
- 当绿枫信号几乎不存在，请关闭通道1。打开通道2和3上。然后单击右侧窗口上A1上的扫描区场和打“回归原始大小”来检查，如果需要的细胞进行光转换。
6。制作一个Z堆栈
- 查找图标菜单栏中“捕捉Z系列'和启动之前设置Z堆栈的上限和下限。设置的LUT。
7。软件设置定时
- 去A1Simple界面框中，勾选以下设置：
1/32帧/秒
大小1024
平均4个或8倍速取决于Z-堆栈具有要采取的一个循环的数目 - 转到：查看/采集控制/ ND序列的获取和设置时间范围（8〜30分钟），连续单击，然后单击Z堆栈。之前，设置边框作为测试，并开始电影。
- 不断增加E3/0.015％三卡因液腔滑全天。到了晚上，完全填补了腔。这将持续到第二天早上。
- 第二天早上，笔芯E3/0.015％三卡因溶液，并检查胚胎是否还活着。荧光的损失表示死亡。继续笔芯，并检查了一整天。
- 当结构已经完成形成，或胚胎已经死亡，完成电影。
8。后期制作加工
- 点击工具栏中“显示最大密度投影”，然后用鼠标右键单击该图像，并创建新的文档。视频现在是在可能的最佳质量可见。去删除不需要的框架和调整的LUT。最后保存为。AVI。这种格式将被罚款的Windows。对于Mac下载软件TØ转换为。或MOV，WMV。
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Representative Results
在SOX10：枫转基因株系，迁徙，后迁徙CNCCs被标记荧光绿色。国家会议中心的细胞标记绿色荧光枫复述内源性SOX10表达5。
在其他应用中，这种动物模型被用来更好地可视化中集依赖颅面结构的发展。具体的结构，也颅面畸形的病理发展，特别是唇腭裂的正常发育已被抓获。已经产生了一系列的斑马鱼的生存时间推移录像在不同的发育时间点。
作为一个例子，胚胎在60个高倍视野，在该成对的小梁已达到形成筛盘，一个阶段被选定。进行单侧靶向光转化导致细胞的最前部分，在筛盘红色标记。首先，正常的延伸和形成的第É筛窦板，观察野生型斑马鱼图宾根（ 见图1和视频1）。与筛骨板的正常发展的理解，这种野生型的参考，然后应用到胚胎，其中正常基因的表达一直波澜不惊比较CNCCs的迁移。
一个specc1lb吗啉击倒斑马鱼胚胎被选为代表性的例子。SPECC1L是牵连的罕见但严重的倾斜面裂的发展的第一个基因。在在筛窦板两侧面的clefting斑马鱼的结果SPECC1L同源specc1lb吗啉基击倒。已被注射specc1lb反义吗啉代胚胎在60个高倍视野胚胎被选择和筛骨板单元的最前部单方面被光转换。与此相反的筛盘的正常发育，筛骨正中板细胞之间的融合的失败和横向筛窦板细胞可以被观察到。这类似于OBFC发展在人，其中侧鼻过程和上颌突出之间的融合的故障发生（见视频2）的发病机制。
图1。枫转基因斑马鱼：SOX10：60 HPF SOX10 枫光转化A.腹面观。结构图中标记为绿色，而相应的活生生的形象酷似筛窦板。在共聚焦显微镜下暴露于UV光（在403.4纳米）后，荧光蛋白枫被光转换从绿色变为红色。B的光转换单元可以遵循如图B组。
电影1。时间推移视频60 HPF阶段野生型图宾根斑马鱼胚胎。形成正常筛窦板。腹面观。记录每30分钟启动60-72 HPF。 点击这里观看电影 。
电影2。时间推移视频60 HPF阶段specc1lb吗啉注射胚胎。筛骨正中板细胞和横向筛窦板细胞之间的融合的失败可以观察到。腹面观。记录每30分钟启动60-72 HPF。 点击这里观看电影 。
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Discussion
这里会显示在斑马鱼模型颅面部发育的可视化的新方法。的SOX10：枫转基因斑马鱼线已经被成功地用于描述中集的详细的迁移模式被用来作为模式生物5。
以前的研究已经用毛地标，如眼靶细胞，并依赖于枫的mRNA注射，光转化试验或笼荧光葡聚糖光转化为10，11，14，15红袜：相比于这10枫转基因株系具有很多优点方法。神经嵴细胞已经贴有枫，符合一个非常特殊的分布，可以用来更精确的地标，建立区域的命运映射。此外，具有枫蛋白质的SOX10启动子的控制下，内源性表达的确保只有神经嵴细胞的光转换，并且只有衍生物将在稍后阶段进行标记，脱压痕的潜在背景5。
利用这种技术，在斑马鱼中衍生的颅面结构中的任何神经嵴细胞的形成可成功地示出。正常野生型斑马鱼胚胎的发育可以遵循，这野生型可参考比较的胚胎，其中正常基因的表达一直波澜不惊。
潜在的改进包括使用不同的容器中的可视化过程中来解决胚胎。这可以是一个培养皿中，或任何其他半透明托盘。
如果成像没有成功，这可能是因为在软件中设定的错误。阅读显微镜的用户手册仔细直播开始时间的推移之前。
而成像，重要的是着眼于胚胎的右平面上，并精确地设定Z堆叠的边界。此外，图像质量的参数，如帧/秒，平均和的LUT具有在最佳娃被设置Ÿ可能为了得到高品质的成果。
这种技术的一个潜在的限制是，它在技术上具有挑战性的标签细胞的单细胞的基础上，为周围的组织也暴露在紫外线下。此外，如果细胞增殖迅速，红色标签是通过稀释细胞分裂后丢失。
此外，枫是四聚体，并有一种倾向，当融合至其它蛋白质，以形成聚集体。这限制了它的使用在活细胞成像最融合的应用。
直播时间推移成像是让复杂的发育实验数据更容易获得科学界和更广泛的受众的重要工具。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者感谢罗伯特Kelsh的好心分享斑马鱼SOX10促进剂。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sox10:kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100x15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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