末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Summary

嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚ニューロンの成長を可能にする神経堤細胞である。この特定のプロパティは、細胞移植のために使用することができる。ここでは喉頭神経損傷モデルでたOECの使用に基づいて細胞移植のモデルを提示。

Abstract

嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚神経細胞の成長や再生を可能にする神経堤細胞である。実際に、一次嗅覚系であっても成体動物における新しいニューロンを生じるその能力によって特徴付けられる。この特定の機能は、部分的に神経発生に有利な微小環境を作成したOECの存在によるものである。たOECのこの特性は、例えば、脊髄損傷モデルにおいて、細胞移植のために使用されている。末梢神経系は、中枢神経系よりも神経損傷後に再生するためのより大きな容量を持っていますが、完全なセクションでは、喉頭神経切断の顔の後に、特に軸索再生の際に悪意のある経路変更を誘導する。具体的には、反回神経（RLN）の完全な切片は、声帯の共同運動、その結果、異常な軸索再生を誘導する。この特定のモデルでは、移植たOECを効率的に軸索の再成長を増加させることを示した。

ve_content ">たOECは、嗅粘膜（OM-たOEC）と嗅球（OB-たOEC）の両方に存在するいくつかの亜集団で構成されている。私たちはここでのたOECのこれらの異なる部分集団の使用に基づいて細胞移植のモデルを提示RLN傷害モデル。このパラダイムを用いて、OB-たOECとOM-たOECの初代培養は、RLNのセクションと吻合後にマトリゲルに移植した。二ヶ月手術後、我々はvideolaryngoscopyに基づいて補完的な分析によって移植動物を評価した、筋電図（EMG） 、および組織学的研究はまず、videolaryngoscopyは、特定の筋肉cocontractions現象で、私たちは喉頭の機能を評価することができました。続いて、筋電図が実証豊かさと筋肉の活動の同期化を分析しています。最後に、トルイジンブルー染色に基づいた組織学的研究は、数とプロファイルの定量化を可能にした有髄線維の。

すべて一緒に、我々は、IDE、文化を分離する方法をここで説明するntifyとRLNセクション·吻合する方法と、軸索の再成長と喉頭の機能でこれらの移植細胞の効率を評価し、分析するの後、OMやOBから移植たOEC。

Introduction

嗅粘膜（OM）は、中枢神経系、末梢神経系および嗅球（OB）において、一次嗅覚系は、2つの異なる部分から構成されている。一次嗅覚系は、哺乳動物種での生活を通して、自己再生への一次嗅覚ニューロン（PON）の容量を特徴としている。この能力に起因OMにおける神経幹細胞の存在により可能となる。 OMからOBへ​​のPONの成長と再生を嗅覚神経鞘細胞と呼ばれる特殊化したグリア細胞（たOEC）によって促進される。たOECは^1を OBにOMからPONの神経発生に有利な微小環境を作成する神経堤細胞である。これにより、たOECは、OMで、細胞^の2,3の異なる亜集団を構成しているOBで見つけることができます。たOECの異なる特性は、いくつかの神経系病変パラダイム⁴における細胞移植のためにそれらを使用するために、鉛の科学者を持っている。実際に、広報たOECは、グリア瘢痕を低減し、増殖因子を産生表参道軸索の再成長、そして自由にアストロサイト^5,6と混ざります。しかし、これらの研究の大部分は、脊髄損傷（SCI）に基づくものである。それらのいくつかは、末梢神経損傷（PNI）の後に^7,8たOECを使用している。

末梢神経系は、神経損傷後に再生するのに最適な容量を持っていますが、完全なセクションでは、異常な軸索再生を誘導する。実際、（RLN）フェイシャルまたは反回神経の完全な離断後に誤ってルーティング軸索は、共同運動と呼ばれる筋肉cocontractionsを引き起こす。したがって、軸索の再成長を定量化するだけでなく、筋肉収縮の効率を評価するために、PNIのモデルを提案することで最も重要である。文献に記載されている最も一般的なモデルは、顔面神経病変^9,10に基づいています。このモデルでは、機能的な評価は、ウィスカの動き¹⁰の回収に基づいています。しかしそれは楽章の効率を実証するために複雑であるementsと筋肉cocontractions現象を判別する。ここではRLN病変に基づいてモデルを提案する。このモデルは、軸索の再成長と声帯の動きだけでなく、携帯移植^11,12の後、これらの動きの効率性と機能性だけでなく、評価することができます。このプロトコルは、RLNセクション/吻合モデルにOMやOBからの文化や移植たOECにステップの手順でステップを提供し、手術後、動物を評価すること。

Protocol

1。嗅粘膜および嗅球の初代培養

1. 解剖の前に
   1. ペニシリン/ストレプトマイシンのウシ胎児血清（FBS）の5ミリリットルと1ミリリットルを補足したカルシウムを含まないダルベッコ改変イーグル/ハムF12培地（DMEM/F12）の44ミリリットルを追加することで、50ミリリットルのために、メディアを作る。
   2. ポリ-L-リシンでコート75cm ^2のフラスコ（50μg/ mlの、1.5μgの/ cm ^2）を 、室温で1時間。
   3. PBS 1Xでフラスコを洗浄します。
   4. 1週間まで冷蔵庫でコーティングしたフラスコに保管してください。
2. 解剖
   1. 安楽死のいずれかの方法は、金融機関の動物管理使用委員会が事前に承認され、有資格者が行ってください。
   2. このようなフィッシャーラットなどの近交系ラットを選択してください。
   3. ラットは、ペントバルビタールナトリウムや、ケタミン/キシラジン麻酔などの他の注射可能な形態で深麻酔を入力していることが確認された後、彼とRの首を切る肌を残したまま削除。
   4. 前部から後部に頭蓋骨を開きます。
   5. 髄膜を避けるように注意しながら、OBを削除します。
   6. 同じラットで、鼻腔sagittalyを開きます。
   7. 呼吸器粘膜を避けるように注意しながら、OMを削除します。 OMの上皮が簡単に黄色がかった色で識別することができることに注意してください。
   8. OMの解剖についての更なる詳細なプロトコルは、前に見つけることができJ. VIS。 EXP 。出版^13。
3. 文化
   1. 37℃で45分間、0.1％のトリプシンを含有するハンクス緩衝塩溶液（HBSS）中OBを配置する
   2. 37℃で45分間0.05％コラゲナーゼAを含有するHBSSの代わりOM
   3. 温かい培地2mlを添加して、酵素消化を停止する。
   4. 培地で細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。
   5. 2の粉砕物のサンプル均質な細胞懸濁液が得られるまでP1000ピペットを用いて培地1ml。
   6. プレート暖かい培地25mlでプレコートフラスコ（5〜10×10 ⁶細胞/フラスコ）内のセル。
   7. 5％のCO _2、37℃で細胞をインキュベートし、培養。
   8. 2日ごとに培地の半分を変更します。
   9. インビトロで 6-8日後、小細胞試料上のp75陽性細胞の割合を確認し、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学により、げっ歯類であると仮定したOEC。これらの分析のために、他のマーカーは、GFAPおよびS100βとして研究することができる。
4. フローサイトメトリー分析
   1. 「細胞移植」（セクションの下に2.2）で説明したように、細胞を収集します。
   2. 4℃で15分間でp75の一次抗体（1:100）でそれらをインキュベートする
   3. PBS-EDTAを2ミリリットルで細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。
   4. 15時のPE結合抗マウス二次抗体で細胞をインキュベートする（1:200）暗所において4℃で分。
   5. PBS-EDTAを2ミリリットルで細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。
   6. PBS-EDTAを500μlの細胞を再懸濁。
   7. フローサイトメーターで10月30日×10 ^3個の細胞を分析します。
5. 免疫細胞化学分析
   1. 「培養」（下記セクション1.1.2）に記載のように48時間プレコート6ウェルプレートに細胞をプレート。
   2. PBSで細胞を洗浄。
   3. 室温で15分間4％PFAで細胞を固定します。
   4. PBSで細胞を洗浄。
   5. RTで15分間、PBS /トリトンX100（0.1％）で細胞をインキュベートする。
   6. PBSで細胞を洗浄。
   7. 4℃で一晩P75、S100βおよびGFAP：一次抗体（1:200）で細胞をインキュベートします
   8. PBSで細胞を洗浄。
   9. 暗闇の中で室温で1時間の間、二次抗体（1:500）で細胞をインキュベートする。
   10. PBSで細胞を洗浄。
   11. Rにおけるヘキスト10分で細胞を培養する暗闇の中のT。
   12. PBSで細胞を洗浄。
   13. 蛍光顕微鏡を用いて細胞を分析します。
6. GFP標識細胞
   1. 五日、移植前に、強化されたGFP（：20感染多重度）を保有するレンチウイルスベクターを用いて、一晩、OBとOMの文化に感染する。
   2. 少量のサンプル「文化」（セクション1.1）で、前述のように、フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の割合に移植チェック前。

2。手術と移植

1. 反回神経吻合
   1. 動物とのすべての実験は、金融機関の動物管理使用委員会が事前に承認され、有資格者が行ってください。
   2. 手術のオートクレーブの前にすべての機器や外科的手技を通して無菌性を維持する。
   3. 塩酸ケタミンの腹腔内注射（12.5ミリグラム/ kg）および塩酸クロルプロマジン（によってラットを麻酔0.625 mg / kg）を。手術前に足指のピンチで麻酔の妥当性を評価する。
   4. 背臥位にラットを配置します。
   5. メスで2センチメートル垂直ミディアム子宮頸皮膚切開を行う。
   6. 中央白線次舌骨下筋の縦切開を行う。
   7. 舌骨下筋の間の自動静的リトラクターを使用して喉頭を公開します。
   8. RLNを公開します。
   9. 微視的な制御の下で、第七の気管リングのレベルでmicroscissorsに完全に神経を切った。
   10. 微視的な制御の下で11.0縫合糸の1ポイントを使用して吻合を行う。 この手術は喉頭の具体的な運動神経除去につながる。
2. 細胞移植
   1. ただ、移植前に、37℃で5分間0.05％トリプシンEDTAを用いて皿から細胞を除去する
   2. 温かい培地2mlを添加して、酵素消化を停止する。
   3. 3分間300×gで遠心分離する。
   6個の細胞の間であった。
   4. 移植する前に、1.5mlチューブ内DMEM/F12-Matrige Lの1時02ミックス（本実験では30および60μL）で携帯の準備を行い、氷の上に置きます。 非特異的効果を回避するために、マトリゲルを低減成長因子を用いる。
   5. ただ移植前にマトリゲル媒体ミックスをウォームアップして数秒間手でチューブを保持します。
   6. ピペットを用いて吻合部位でのミックスを解任し、損傷神経に混合自己集合するまで待ちます。
   7. 4.0縫合糸で筋肉と皮膚を閉じます。
   8. ハウス個別ラットと24時間加熱ランプの下に保つ。

3。評価

1. 喉頭鏡検査法
   1. intraperitでラットを麻酔塩酸ケタミン（12.5 mg / kg）をし、クロルプロマジン塩酸塩（0.625 mg / kg）をのoneal注入。ラットを確定する前のプロトコルを進めるために、TOEのピンチで麻酔する。
   2. 背臥位にラットを配置します。
   3. 喉頭の最高の眺めを提供するように調節30°videolaryngoscopeを挿入します。各記録のための同じビューを再現するために解剖学的ランドマークを決定します。
   4. videolaryngoscope（5-10シーケンス/動物）を使用して、声帯の動きを記録します。各動物について、連続する最大転および最大拉致3つのシーケンスを選択します。
   5. 画像解析ソフトウェアを用いて喉頭機能を分析する。最大拉致や声帯の最大転の動きの違いを測定することにより、絶対的な角運動を決定する。運動の振幅を測定することにより、動的なスコアを決定する。共同運動と逆説的な動きを測定することにより、機能的なスコアを決定する。
2. 電図（EMG）
   1. 「反回神経吻合」（セクション2.1）で、前述のように皮膚や筋肉を開くことによって、喉頭、気管を公開します。
   2. 輪状甲状軟骨を公開します。
   3. microscissorsを使用して後部輪状披裂（PCA）は、筋肉を露出するように輪状甲状軟骨を開きます。
   4. PCA筋における単極電極針（38×0.45 mm）をご紹介します。
   5. 自発換気中収集システムを使用して、PCAの筋肉の電気的な筋活動を記録します。
   6. 呼吸と豊かさと同期の点で筋活動を分析します。 、より豊かな活動をトレース押韻：増加吸気とトレース押韻が、貧しい人々のトレース（Neurogenの）、2：インスピレーション、1時に無韻トレース、増加なし：0：筋電図を分析するには、以下の基準を使用して0から3までの定性的スコアを割り当て3：私を構成する、非常に豊かなトレース押韻最大意図的行動と同様nterferenceパターン。
   7. レイテンシと電位持続時間を測定するために、迷走神経を公開します。 RLNは、その小さなサイズのため、刺激中に破損することができるため、迷走神経を刺激のサイトとして選ばれる。
   8. 電極と迷走神経を刺激する。
   9. PCAの筋肉に電気信号を記録します。レイテンシと電位持続時間を測定します。可能であれば、筋肉活動、そのようなパワーラブシステムなどの待ち時間や電位持続時間を記録するために取得モジュールを使用しています。
3. 組織学
   1. ペントバルビタールの過剰摂取を用いて動物を安楽死させる。
   2. 微視的な管理下にRLNの遠位断端を外します。 RLNの遠位部分は、吻合と喉頭との間の部分として定義される。 11.0縫合糸は非吸収性縫合糸であるので、それは数週間、手術後吻合部位を発見することが可能であることに注意してください。
   3. 0.1 Mリン酸を2％グルタルアルデヒド中RLNの遠位部分を配置する液（pH = 7.3）で4℃で2時間
   4. 慎重に冠状断面を実現するためにサンプルを向ける。
   5. リン酸緩衝液でサンプルを洗浄します。
   6. 1％カコジル中、室温で60分間小さなセグメント（3-4 mm長）とPostfixのにカットのOsO ₄とエタノールで脱水し、バッファリング。
   7. オリエントシリコン金型内のサンプルや、POLYBED 812、DDSAとMNAになる樹脂中に埋め込まれた加速器BDMAの2％を添加した。
   8. Pyramitome超薄Systemを用いた半薄横断切片（1μmの厚さ）を作る。
   9. 70℃で75秒間、1％の四ホウ酸ナトリウムの0.1％トルイジンブルーで染色
   10. 計数分析システムでRLNサンプルを分析する。繊維の数をカウントし、ミエリン鞘の外側及び内側境界を決定することによって有髄神経線維のプロファイルを測定する。
4. 移植
   1. 移植用の細胞を調製し、前述のように細胞を移植「細胞移植」（セクション2.2）であった。
   2. 分析
   3. ペントバルビタールの過剰摂取を用いて動物を安楽死させる。動物の固定は、4％PFAの心臓内注射を用いて行うことができることに留意されたい。
   4. RLNの約2cmに削除します。 RLNの近位および遠位の部分を使用してください。
   5. 液体窒素中でRLNサンプルを修正します。
   6. -80℃でのサンプルの保存
   7. カットサンプルは縦方向にクライオスタット（10〜20ミクロンの厚さの）を使用して。
   8. GFP陽性細胞を検出するために蛍光顕微鏡下で試料を分析する。抗GFP抗体は蛍光発光を増大させるとcostainingsを実行するために用いることができる。

Representative Results

コントロールとreinnervated（セクション/吻合）とイラスト動物が結果として選択されています（OM、OBやOM + OB）が行わ携帯移植によって異なる場合があります。

細胞培養
細胞がプラスチック表面に迅速に付着し、又は細長い先細り、三角形、多極、又は紡錘状である細胞の平行な帯状に分離なった（ 図1Aおよび1B）。サイトメトリー分析体外フローの 8日後には、p75陽性細胞の割合は、一次のOBでの71パーセント、一次のOM培養物（ 図1Cおよび1D）は13％を示しています。

細胞移植手術
細胞は、吻合RLN上マトリゲル媒体ミックスに移植する。 RLNの吻合11.0縫合糸の一点（ 図2）によって行われる。

評価
VideolaryngoscOPY二ヶ月移植後、喉頭の機能はvideolaryngoscopyおよび筋電図により分析した。 videolaryngoscopy解剖学的ランドマークを実現するために外転と内転（ 図3）との差を測定するために選択された。

筋電図検査
これらを完了するためには、EMG研究はPCAの筋肉に移植モノポーラ針電極を用いて行った解析する。ノーマルとreinnervated（セクション/吻合）動物のための代表的なトレースを図4に示す。

組織学的分析
これらの動物の場合は、RLNの組織学的分析はトルイジンブルー染色により行った。正常およびreinnervated（セクション/吻合）動物のための典型的なファイバプロファイルは、 図5Aおよび5Bに示されている。これらの組織学的分析を完了するために、GFP陽性細胞の追跡を行った。 図5Cを tを示す内神経移植後の坐骨神経へのGFP陽性細胞の存在と彼。坐骨神経は、RLNサイズがイントラ神経移植を許可しないようにコントロールとして使用されている。

OBとOMの図1。形態学的特性およびin vitroでのOB（AとC）とOM（BとD）の初代培養中のp75の式（AとB）たOEC初代培養は、細長い三角形、または紡錘状の形態を表明。 （C及びD）及びOB OM初代培養物におけるのp75の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。数字は総人口と示されたゲート付き領域に存在する細胞の割合を示している。どうぞ / 50590fig1highres.jpg ">この図の拡大バージョンを見るにはここをクリックしてください。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2。 RLNの吻合の絵は、手術前に11.0縫合。（A）セクション化されたRLN で実施 。近位およびRLNの遠位断端との間に（B）を吻合。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図3。ラット声門計画の典型的な内視鏡景色が評価中に、ランドマークは、それぞれの記録のために同じ視野を持つために決定されます。提示ビューの最大外転（A）と最大転（B）の両方から測定されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4。PCA筋における呼吸の間に得 ​​られた筋電トレースの例 。 （A）対照群の動物には、吸気中に増加して、豊かな電気的筋肉活動を発表した。 （ こちらをクリックしてこの図の拡大版を表示します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5。組織学、神経の研究。（AとB）、対照群からのRLNの冠状断面の例。この分析は、対照群が有髄線維のより多数を提示したことを示した。 （A）倍率3,960 Xおよび（B）倍率11,900 X. OBラベル（C）GFP- たOECは、砕いたラットの坐骨神経に病変部位に留まった。倍率100倍。

Discussion

ここで紹介するテクニックは、たOEC末梢神経損傷モデルにおいて細胞移植を研究するための有用なモデルにする。細胞培養プロトコルは比較的簡単であり、容易に行うことができる。一方、外科的手技は、RLNの特定のセクション/吻合で、経験を必要とし、有資格者が行ってください。

このプロトコルに記載の手順は、可能な最良の結果を得るために焦点を当てる重要な要素をハイライト。まず、OMの解離の間に、我々は、嗅覚と呼吸しない上皮を得るために、慎重に解剖することをお勧めします。第二に、RLNの吻合のために、我々は11.0縫合糸で一点のみを実行することをお勧めします。第三に、評価の際に、全ての動物の間の麻酔同じ深さを有することが非常に重要である。具体的には、深麻酔はvideolaryngoscopy時の声帯の運動の振幅を低減します。我々はRをお勧めします動物の窒息を避けるために、できるだけ早く喉頭鏡をemoving。筋電図記録中によるPCAの筋肉の大きさに、我々は慎重に、単極電極針を置くことをお勧めします。最後に、組織学的研究のためにそれを慎重に冠状切片を得RLNサンプルを配向することが重要である。なお、ウォーラー変性が起こるRLNの遠位部を除去し、分析することも非常に重要である。

ここで説明するプロトコルは、簡単に、OBやOMからの精製されたOECの文化を生成するために変更することができます。 OBからたOECの精製の ​​ために、我々はナッシュ¹⁴で記載された技術を推奨し、OMからたOECの精製の ​​ために、我々はビアンコ¹⁵で説明した方法をお勧めします。これらの二つの具体的な精製方法は、高度に精製されたOECの培養物（90％）を有することを可能にし、以前ウェルその作者^14,15によって記載されている。別の可能な修正は、移植手順でWHER電子細胞は、坐骨神経⁷に関して前述したように、末梢神経に直接注射することができる。この場合、細胞はマトリゲルなしで注入することができる。それは、RLNの大きさ、それが直接神経に細胞を注入することが可能ではないことに注意することが重要です。最後にもう一つの可能​​な修正は、EMGプロトコルの最適化である。実際に、PCAおよび横隔膜筋の筋活動の記録は、喉頭及び呼吸筋の間の同期の必要性を排除し、一緒に行うことができる。

現在のプロトコルは、他の神経病変パラダイムで適用することができる。我々はすでにそのような坐骨や迷走神経などのPNIのいくつかのモデルでたOECを移植しているが、これらの治療法は、簡単に他のPNIパラダイム^8,11,12,16で使用することができます。さらに興味深いことにたOECの細胞移植は、特にSCIにおける中枢神経系疾患に拡張することができる。喉頭の測定のために、ここで説明した方法RLNセクション/吻合後の機能は、他の細胞の移植プロトコルのために使用することができます。実際、喉頭モデルは軸索の再成長と共同運動現象を評価することは非常に強力です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	E3521T
FBS	Invitrogen	E3387M
Penicilin/streptomycin	Invitrogen	1152-8876
HBSS	Invitrogen	M3467Y
Trypsin-EDTA	Invitrogen	M3513P
Cacodylate	Merck	1.03256.0100
DDSA	Biovalley	00563-450
MNA	Biovalley	00886-450
BDMA	Biovalley	00141-100
Polybed 812	Biovalley	08791-500
PE anti-mouse	BD Bioscience	550589
Matrigel GFR	BD Bioscience	356231
Collagenase A	Roche	10103586001
Mouse anti P75	Chemicon	MAB 365
11.0 Wire	Ethicon	FG 2881
Toluidine Blue	Ral Diagnostics	361590-0025
Centrifuge	Sigma	Sigma 2-16PK
Incubator	Thermo Scientific
Laminar flow hood	Faster	BH-EN 2003 S
Flow cytometer	BD Bioscience	FACSCalibur
Microscope	Zeiss
Videolaryngoscope	Karl Storz Endoskope	Telecam SL NLSC 20212120
Acquisition system	AD Instruments	Powerlab system
Pyramitome Ultramicrotomy System	Leica	Ultracut S
Image analysis system	Explora Nova	Mercator