Summary
嗅鞘细胞（嗅鞘细胞）是神经嵴细胞，使初级嗅觉神经元的生长。此特定属性可用于蜂窝移植。我们在座细胞移植的基础上在喉上神经损伤模型中使用嗅鞘细胞的模型。
Abstract
嗅鞘细胞（嗅鞘细胞）是神经嵴细胞，使增长的主要嗅觉神经元和再生。事实上，主嗅觉系统的特征在于，其以产生新的神经细胞即使在成年动物的能力。这种特殊的能力，部分原因是嗅鞘细胞的存在而对神经营造良好的微环境。嗅鞘细胞的这种特性已被用于细胞移植，如脊髓损伤模型。虽然外周神经系统有较大容量的神经损伤比对中枢神经系统后再生，完整的章节后，面部喉神经切断术的过程中，特别轴突再生长诱导错误路由。具体来说，喉返神经（RLN）的全切片诱导导致声带联带运动异常轴突再生。在这种特定的模型中，我们发现，嗅鞘细胞移植有效地增加轴突再生。
的同时存在于嗅黏膜（OM-嗅鞘细胞）和嗅球（OB-嗅鞘细胞）亚群的几个ve_content“>嗅鞘细胞构成的。我们在座细胞移植的基础上在利用嗅鞘细胞的这些不同亚群的典范喉返神经损伤模型，利用这种模式，OB-嗅鞘细胞和OM-嗅鞘细胞的原代培养的喉返神经第吻合后移植于基底膜。术后2个月，我们评估移植的动物通过互补分析的基础上videolaryngoscopy，肌电图（EMG）和组织学研究。首先，videolaryngoscopy使我们能够评估喉功能，特别是肌肉cocontractions现象，然后，肌电图的分析表明丰富性和肌肉的活动同步。最后，基于甲苯胺蓝染色的组织学研究中所允许的数量和分布的量化有髓纤维。总之，我们在这里描述了如何分离，培养，IDEntify和嗅鞘细胞移植从OM和OB RLN段吻合术，以及如何评估和分析轴突的再生和喉功能这些移植细胞的效率之后。
Introduction
主嗅觉系统包括两个不同的部分;嗅粘膜（OM）在中枢神经系统外周神经系统和嗅球（OB）。主嗅觉系统的特征在于主嗅觉神经元（PON）的自我更新整个生命中哺乳动物物种的能力。这种能力是由可能的，因为神经干细胞在OM的存在。 PON的生长和再生从OM到OB是由专门的神经胶质细胞称为嗅鞘细胞（嗅鞘细胞）促进。嗅鞘细胞是其从OM的PON到OB 1的神经发生创造了有利的微环境神经嵴细胞。因此，嗅鞘细胞可以在OM和OB构成细胞2,3的不同亚群被发现。嗅鞘细胞的不同属性有铅科学家将其用于细胞移植在几个神经系统病变范式4。事实上，嗅鞘细胞产生生长因子，减少胶质瘢痕，公关表参轴突再生，并且可以自由交融与星形胶质细胞5,6。然而，这些研究绝大多数是基于对脊髓损伤（SCI），其中一些已经用于嗅鞘细胞周围神经损伤（PNI）7,8之后。
虽然周围神经系统有很大的容量神经损伤后再生，科室齐全诱发异常的轴突再生。事实上，面部或喉返神经（RLN）完全横断后误传的轴突产生肌肉cocontractions叫联带运动。因此，它是最重要的，提出PNI的一个模型，不仅量化轴突再生长，但也评估肌肉收缩的效率。在文献中描述了最常见的模式是基于面部神经病变9,10。在这个模型中，功能性评估是基于对晶须运动10的恢复。然而，它是复杂的，以证明MOV的效率对此语句和歧视的肌肉cocontractions现象。在这里我们提出基于一个喉返神经损伤模型。这种模式不仅允许轴突再生和声带运动，但也是这些运动细胞移植11,12后的效率和功能的评价。该协议提供了一个喉返神经节/吻合模型一步步的程序，以文化和嗅鞘细胞移植从OM和OB和术后评估动物。
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Protocol
1。嗅粘膜和嗅球的原代培养
- 此前解剖
- 使介质，50毫升，加入44毫升的无钙的Dulbecco改进的Eagle / Ham氏F12培养基（DMEM/F12），补充用5毫升胎牛血清（FBS）和1毫升青霉素/链霉素的。
- 外套75 厘米的烧瓶用聚-L-赖氨酸（50微克/毫升，1.5微克/厘米2），1小时，在室温下进行。
- 冲洗瓶用PBS 1X。
- 储存在冰箱中的涂层烧瓶达1周。
- 解剖
- 安乐死的任何方法都必须通过该机构的动物护理和使用委员会事先批准而由合格的人员进行。
- 选择近交系动物，如大鼠菲舍尔。
- 后大鼠已被证实已经进入深度麻醉用戊巴比妥钠麻醉或其它可注射的形式，如氯胺酮/赛拉嗪，斩首他和r的eMove皮肤。
- 打开颅骨由前至后的部分。
- 取出OB注意避免脑膜。
- 在相同的大鼠，打开鼻腔sagittaly。
- 拆下OM注意避免呼吸道黏膜。注意，OM上皮可通过其泛黄的颜色容易地识别。
- 关于有机质夹层进一步详细的协议可以发现在以前的J。可见。进出口 。出版13。
- 文化
- 放置OB在汉克的含0.1％胰蛋白酶45分钟，在37℃的缓冲盐溶液（HBSS）
- OM放置在HBSS中含0.05％胶原酶一种45分钟，在37°C。
- 加入2毫升温介质停止酶消化。
- 与介质洗涤细胞并离心它们在300×g离心3分钟。
- 2样品磨碎毫升培养基用移液管P1000，直到获得均匀的细胞悬浮液。
- 用25毫升温暖的培养基的盘在预涂烧瓶（5-10×10 6细胞/烧瓶）中的单元格。
- 孵化和培养的细胞，在37℃，5％的CO 2。
- 改变一半的培养基，每2天。
- 后在体外 6-8天，查小细胞样本的p75阳性细胞的比例，假定为嗅鞘细胞在啮齿类动物，通过流式细胞仪或免疫细胞化学。对于这些分析，其他标志物可以研究诸如GFAP和S100β。
- 流式细胞仪分析
- 如在“细胞移植”（第2.2段）说明收集细胞。
- 在15分钟内于4℃下孵育它们与p75的第一抗体（1:100）
- 用2ml PBS-EDTA洗细胞并离心它们在300×g离心3分钟。
- 在15孵育的细胞用PE偶联的抗小鼠二抗分钟，在4°C黑暗（1:200）。
- 用2ml PBS-EDTA洗细胞并离心它们在300×g离心3分钟。
- 重悬在500微升PBS-EDTA的细胞。
- 用流式细胞仪分析10-30×10 3个细胞。
- 免疫组化分析
- 板块中，如“文化”（第1.1.2段）描述预涂48小时6孔板的细胞。
- 用PBS洗涤细胞。
- 固定细胞用PFA 4％，持续15分钟，在室温。
- 用PBS洗涤细胞。
- 孵育的细胞用PBS /的Triton X100（0.1％）为15分钟，在室温。
- 用PBS洗涤细胞。
- 孵育的细胞与第一抗体（1:200）：P75，S100β和GFAP过夜，在4℃下
- 用PBS洗涤细胞。
- 在1小时在室温下在黑暗中孵育的细胞与第二抗体（1:500）。
- 用PBS洗涤细胞。
- 孵育细胞在R赫斯特10分钟T IN黑暗。
- 用PBS洗涤细胞。
- 用荧光显微镜分析细胞。
- 绿色荧光蛋白标记的细胞
- 移植前五天，感染OB和OM培养过夜慢病毒载体携带增强型绿色荧光蛋白（感染复数：20）。
- 支票上的小样本GFP阳性细胞的流式细胞仪在“文化”（1.1节）前面描述的速率移植前。
2。手术和移植
- 喉返神经吻合术
- 所有实验动物必须通过该机构的动物护理和使用委员会事先批准而由合格的人员进行。
- 术前高压灭菌器的所有仪器和保持无菌整个手术过程。
- 通过腹膜内注射氯胺酮盐酸盐（12.5毫克/千克）和盐酸氯丙嗪（麻醉大鼠0.625毫克/千克）。手术前麻醉评估的充分性由脚趾捏。
- 将大鼠在背卧位。
- 用手术刀进行2厘米垂直介质宫颈皮肤切口。
- 下面的内侧白线执行舌骨下肌群的垂直切口。
- 通过使用舌骨下肌群之间自动静态拉钩暴露喉。
- 暴露喉返神经。
- 根据微观控制的，完全切断神经与microscissors在第七气管环的水平。
- 使用显微镜下控制一个点的11.0缝线进行吻合。 这种手术导致喉部的特定马达去神经。
- 细胞移植
- 只是在移植前，在37℃用0.05％胰蛋白酶EDTA 5分钟移除菜肴细胞
- 加入2毫升温介质停止酶消化。
- 离心机在300×g离心3分钟。
- 使细胞的制备与DMEM/F12-Matrige升1:2的混合物（30和60微升在这个实验）在1.5ml管移植之前，将其放在冰上。 为了避免非特异性作用，使用生长因子减少基底膜。
- 只是移植前将灯管保持你的手几秒钟热身基质胶介质混合。
- 废黜混合使用吸管的吻合部位，等到对受损神经的混合自组装。
- 关闭肌肉和皮肤有4.0缝合。
- 单独的房子，并保持在一个加热灯24小时的大鼠。
3。评价
- 喉镜检查
- 通过intraperit大鼠麻醉奥尼尔注射盐酸氯胺酮（12.5毫克/千克）和盐酸氯丙嗪（0.625毫克/千克）。确认大鼠前着手协议麻醉用脚趾捏。
- 将大鼠在背卧位。
- 插入一个30°视频喉镜调整，以提供喉部的最佳视图。确定解剖标志再现了同样的观点为每个记录。
- 使用视频喉镜（5-10序列/动物）录制声带运动。对于每个动物选择连续最大内收和外展最大的三个序列。
- 使用图像分析软件分析喉功能。通过测量最大绑架和声带的最大内收运动之间的差确定的绝对角运动。通过测量运动幅度确定动态得分。通过测量联带运动和paradoxal走势判断功能评分。
- 肌电图（EMG）
- 通过在“喉返神经吻合术”（2.1节）前述开口的皮肤和肌肉暴露喉部和气管。
- 暴露环甲软骨。
- 开环甲软骨用microscissors，露出环杓后（PCA）的肌肉。
- 在PCA肌肉引入单极针电极（38×0.45mm）内。
- 录制过程中自然通风利用采集系统的PCA肌肉的肌肉电活动。
- 分析的丰富性和同步呼吸方面的肌肉活动。灵感，1期间无韵跟踪，无需增加：0：分析肌电信号，采用以下比例分配一个定性的评分从0-3押韵跟踪与吸气增加，但可怜的跟踪（neurogen），2：押韵更丰富的活动跟踪， 3：押韵跟踪，非常丰富，构成一个i消除干扰图案，类似于一个最大故意活性。
- 揭迷走神经来测量延迟和潜在的持续时间。迷走神经被选为刺激的部位，因为喉返神经可刺激过程中，由于其体积小而损坏。
- 刺激迷走神经与电极。
- 记录电信号在PCA肌肉。测量延迟和潜在的持续时间。如果可能的话使用一个采集模块来记录肌肉活动，延迟和潜在的持续时间，如PowerLab系统系统。
- 组织学
- 用戊巴比妥过量安乐死的动物。
- 删除喉返神经的远端残端下的微观控制。 RLN的远侧部分被定义为吻合口和喉之间的部分。注意，有可能找到吻合部位手术后数周，因为11.0缝线是不可吸收的缝线。
- 用0.1M磷酸盐放置RLN的远侧部分中的2％戊二醛（pH值= 7.3），2小时，在4℃下
- 精心定位的样本，以实现冠状切片。
- 在磷酸盐缓冲液洗涤样品。
- 切成更小的段（3-4毫米长）和后缀，在室温下60分钟，在1％的二甲胂酸盐缓冲的OsO 4和脱水乙醇。
- 在硅胶模具东方样品并包埋在树脂组成中POLYBED 812，DDSA和MNA，向其中加入加速器BDMA的2％。
- 使用Pyramitome超薄切片系统做半薄横截面（1微米厚）。
- 用0.1％甲苯胺蓝在70℃下染色的1％四硼酸钠的75秒
- 分析喉返神经样品计数分析系统。数纤维的数量和通过测定髓鞘的外表面和内边界测量髓神经纤维进行访问。
- 移植
- 制备细胞移植及移植如前所述的细胞在“细胞移植”（第2.2节）。
- 分析
- 用戊巴比妥过量安乐死的动物。注意：可以使用腔内注射PFA的4％进行了动物的固定。
- 删除喉返神经周围2厘米。使用近端和RLN的远侧部分。
- 固定RLN样品在液氮中。
- 样品储存在-80°C。
- 切割样品纵向使用低温恒温器（10-20微米厚）。
- 分析荧光显微镜下的样品以检测GFP阳性细胞。注意，抗GFP抗体可用于增加荧光发射和执行costainings。
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Representative Results
插图与控制和神经支配（节/吻合）动物被选为结果可能会因执行（OM，OB或OM + OB）细胞移植而有所不同。
细胞培养
细胞粘附迅速到塑料表面，成为分隔成细胞，长形或锥形，三角形，多极，或纺锤状的平行分割行（ 图1A和1B）。经过8 天的体外流式细胞分析表明p75的阳性细胞的比率，在初级OB 71％，并且在初级培养物的OM 13％（ 图1C和1D）。
细胞移植手术
这些细胞被移植在吻合RLN基质胶介质的混合。的RLN的吻合是由一个点的11.0缝合（ 图2）制成。
评价
Videolaryngosc冠层移植后两个月，喉功能被videolaryngoscopy和肌电图分析。为了实现videolaryngoscopy解剖标志被选为测量（ 图3），外展内收之间的差异。
肌电图
为了完成这些分析肌电图研究是利用植入PCA肌肉单极针电极进行。典型的痕迹正常和神经支配（部分/吻合）动物列于图4。
组织学分析
对于这些动物中，喉返神经的组织学分析，甲苯胺蓝染色法进行。正常和神经支配（部分/吻合），动物纤维的典型剖面示于图5A和5B。要完成这些组织学分析，进行GFP阳性细胞的跟踪。 图5C所示吨他存在GFP阳性细胞进入坐骨神经内神经移植后。坐骨神经已被用作控制作为RLN尺寸不允许内部神经移植术。
图1。形态学特征和OB（A和C）和OM（B和D） 在体外原代培养P75的表达。（A和B）嗅鞘细胞在OB和OM小学文化表达拉长，三角形或梭形形态。 （C和D）P75在OB和OM原代培养的细胞表面表达，流式细胞仪检测。数字表示总人口和细胞中存在的指示选通区域的百分比。请 / 50590fig1highres.jpg“>点击这里查看该图的放大版本。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。图片喉返神经的吻合与11.0进行缝合（A）切片喉返神经在手术前。近端和喉返神经的远端残端之间（B）吻合。 请点击此处查看此图的放大版本。
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图3。大鼠声门计划的典型内镜意见。评估过程中，地标是为了有相同的视野为每个记录来确定。从所提 出的两个观点的最大绑架（A）和最大内收（B）的测量。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4。的呼吸在PCA肌肉中获得的肌电图痕迹的例子 。 （ 一 ）对照组的动物出现了丰富的电器肌肉活动，增加吸气过程。 （
图5。神经组织学研究。（A和B）的喉返神经由对照组冠状切片为例。这一分析表明，与对照组提出了一些有髓神经纤维的高。 （A）放大倍率3,960 X和（B）的放大倍率11,900 X。 （ 三）绿色荧光蛋白标记的OB- 嗅鞘细胞保持在病灶部位粉碎成大鼠坐骨神经。放大倍率100X。
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Discussion
这里介绍的技术使嗅鞘细胞，以研究细胞移植在周围神经损伤模型一个有用的模型。细胞培养协议相对简单，可以很容易地进行。在另一方面，外科手术，在喉返神经的特定部分/吻合，需要经验的，必须由合格的人员。
在这个协议中描述的方法强调重要因素集中，以便获得可能的最佳结果。首先，有机质分解过程中，我们建议仔细解剖，以获得唯一的嗅觉，而不是呼吸道上皮。其次，对于喉返神经的吻合，我们建议用11.0缝线执行只有一个点。第三，在评估过程中这是非常重要的是有麻醉的所有动物之间的深度相同。特别是，深度麻醉降低声带的运动videolaryngoscopy时的振幅。我们建议řemoving喉镜尽快避免动物窒息。在肌电图记录，由于PCA肌肉的大小，我们建议您仔细地把单极针电极。最后，进行组织学的研究中，要仔细定向咽样本以获得冠状部分是很重要的。这也是非常重要的是要除去和分析RLN，其中Wallerian变性发生的远端部分。
这里所描述的协议，可以很容易地修改，以产生嗅鞘细胞从OB和OM纯化培养。为嗅鞘细胞从OB的纯化，我们建议由纳什14中描述的技术，并为嗅鞘细胞的自OM的纯化，我们建议由比安科15所述的方法。这两个特定的纯化方法允许有高度纯化嗅鞘细胞（90％）的培养物，并已被预先以及由它们的作者14,15说明。另一种可能的修改是移植过程中的WHER辰细胞可被直接注射入如前面对坐骨神经7所述的末梢神经。在这种情况下，细胞可以在没有基质胶注入。要注意的是，由于RLN不可能注入的细胞直接进入这个神经的尺寸是很重要的。最后，另一种可能的修改是肌电协议的优化。事实上，PCA和隔膜肌肉的肌肉活动的记录可被一起执行的，省去了喉和呼吸肌之间的同步。
目前的协议可以在其他神经病变的范例应用。我们已经移植嗅鞘细胞在几种模式PNI的如坐骨神经和迷走神经，这些疗法可以容易地在其他PNI使用范式8,11,12,16。嗅鞘细胞的更有趣的是细胞移植可以扩展到在特定的脊髓损伤中枢神经系统疾病。这里描述为喉癌的测量方法喉返神经节/吻合后功能也可用于其它细胞移植的协议。事实上，喉模型可以非常强大，以评估轴突再生和联带运动现象。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢ADIR（爱德住所辅助Insuffisants Respiratoires）和基金会去l'Avenir酒店提供的财政支持，以及博士查波斯巴纳比 - 海德编辑稿件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
