Summary
الخلايا الشمية مغمد (الكاريبي) هي خلايا قمة العصبية التي تسمح نمو الخلايا العصبية الشمية الأولية. هذه الخاصية محددة يمكن استخدامها لزرع الخلايا. نقدم هنا نموذجا لزرع خلوية تعمل على أساس استخدام الكاريبي في العصب نموذج إصابة الحنجرة.
Abstract
الخلايا الشمية مغمد (الكاريبي) هي الخلايا العصبية التي تتيح قمة النمو وإعادة نمو الخلايا العصبية الشمية الأولية. في الواقع، يتميز نظام حاسة الشم الأولية من خلال قدرتها على أن تؤدي إلى خلايا عصبية جديدة حتى في الحيوانات البالغة. ويعزى ذلك جزئيا إلى وجود منظمة دول شرق الكاريبي الذي خلق المكروية مواتية لتكوين الخلايا العصبية هذه القدرة خاصة. وقد استخدم هذا العقار لمنظمة دول شرق الكاريبي لزرع الخلايا كما هو الحال في نماذج إصابات الحبل الشوكي. على الرغم من أن الجهاز العصبي المحيطي لديه قدرة أكبر على التجدد بعد إصابة العصب من الجهاز العصبي المركزي، أقسام كاملة لحث misrouting خلال إعادة نمو محور عصبي ولا سيما بعد الوجه من الحنجرة transection العصب. على وجه التحديد، باجتزاء الكامل للعصب الحنجري الراجع (RLN) يدفع إعادة نمو محور عصبي الشاذة الناتجة في حركة تصاحبية من الحبال الصوتية. ، أظهرنا في هذا النموذج المحدد الذي زرع الكاريبي يزيد كفاءة محور عصبي إعادة النمو.
وتشكل ve_content "> منظمة دول شرق الكاريبي من عدة مجموعات سكانية فرعية موجودة في كل من الغشاء المخاطي الشمي (OM-الكاريبي) وبصيلات الشم (OB-الكاريبي)، ونحن نقدم هنا نموذجا لزرع خلوية تعمل على أساس استخدام هذه المجموعات السكانية الفرعية المختلفة في منظمة دول شرق الكاريبي RLN نموذج الاصابة. باستخدام هذا النموذج، تم زرع الثقافات الأولية من OB-الكاريبي ومنظمة دول شرق الكاريبي في OM-Matrigel بعد القسم ومفاغرة من RLN. وبعد شهرين من الجراحة، قمنا بتقييم الحيوانات زرعها بواسطة التحليلات التكميلية على أساس videolaryngoscopy، الكهربائي (EMG) ، والدراسات النسيجية. أولا، يسمح videolaryngoscopy لنا لتقييم وظائف الحنجرة، ولا سيما cocontractions العضلات الظواهر، ثم يحلل EMG ثراء شرحها وتزامن الأنشطة العضلات. وأخيرا، سمحت الدراسات النسيجية على أساس طولويدين تلطيخ الأزرق الكمي لعدد والملف الشخصي من ألياف العصبي.كل ذلك معا، ونحن هنا تصف كيفية عزل، والثقافة، وبيئة تطوير متكاملةntify وزرع الكاريبي من OM وOB بعد RLN المقطع مفاغرة وكيفية تقييم وتحليل كفاءة هذه الخلايا التي تم زرعها على إعادة نمو وظائف الحنجرة محور عصبي.
Introduction
ويتكون النظام الأساسي للحاسة الشم قسمين منفصلين؛ الغشاء المخاطي الشمي (OM) في الجهاز العصبي المحيطي والبصلة الشمية (OB) في الجهاز العصبي المركزي. ويتميز نظام حاسة الشم الابتدائي بحلول قدرة الخلايا العصبية الشمية الابتدائي (PON) لتجديد الذاتي في جميع مراحل الحياة في أنواع الثدييات. يرصد هذه القدرة ممكن بسبب وجود الخلايا الجذعية العصبية في OM. ومما يسهل نمو وإعادة نمو PON من OM إلى OB من قبل خلايا متخصصة تسمى الخلايا الدبقية مغمد الشمية (الكاريبي). منظمة دول شرق الكاريبي هي الخلايا العصبية التي تخلق قمة المكروية مواتية لتكوين الخلايا العصبية من PON من OM إلى OB 1. وبالتالي، منظمة دول شرق الكاريبي يمكن العثور عليها في وOM في OB تشكل مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا 2،3. خصائص مختلفة من منظمة دول شرق الكاريبي يكون العلماء الرصاص لاستخدامها لزرع الخلوية في عدة نماذج النظام العصبي الآفة 4. في الواقع، وعوامل نمو إنتاج منظمة دول شرق الكاريبي، والحد من اخافة الدبقية، والعلاقات العامةإعادة نمو محور عصبي omote، ويمكن أن تختلط بحرية مع الخلايا النجمية 5،6. ومع ذلك، تقوم الغالبية العظمى من هذه الدراسات على إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، وقد استخدمت قليل منها منظمة دول شرق الكاريبي بعد إصابة الأعصاب الطرفية (PNI) 7،8.
على الرغم من أن الجهاز العصبي المحيطي لديه قدرة كبيرة على التجدد بعد إصابة العصب، أقسام كاملة لحث الشاذة محور عصبي إعادة النمو. في الواقع، بعد transections كاملة من الوجه أو الأعصاب الحنجري الراجع (RLN) محاور misrouted يعد يسبب cocontractions العضلات تسمى حركة تصاحبية. لذا فإنه من الأهمية الأساسية لاقتراح نموذج للPNI لتحديد ليس فقط إعادة نمو محور عصبي ولكن أيضا لتقييم كفاءة تقلصات العضلات. في الأدب ويستند النموذج الأكثر شيوعا الموصوفة على الوجه الآفة العصب 9،10. في هذا النموذج، وتستند تقييمات وظيفية على الانتعاش من الحركات الطولي 10. ومع ذلك معقد للتدليل على كفاءة وسائل التحققبيانات أدلى وتميز cocontractions الظواهر العضلات. نقترح هنا نموذجا يعتمد على آفة RLN. هذا النموذج يسمح للتقييم ليس فقط إعادة نمو محور عصبي وحركات الحبال الصوتية ولكن أيضا من كفاءة وظيفة هذه الحركات بعد زرع الخلايا 11،12. يوفر هذا البروتوكول خطوة الإجراء خطوة لزرع الثقافة ومنظمة دول شرق الكاريبي من OM وOB في نموذج القسم RLN / مفاغرة وتقييم الحيوانات بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الثقافات الأولية من الغشاء المخاطي الشمي والشم لمبات
- قبل التشريح
- جعل المتوسطة، لمدة 50 مل، 44 مل بإضافة خالية من الكالسيوم Dulbecco لتعديل النسر / متوسطة هام في F12 (DMEM/F12)، على أن تستكمل مع 5 مل من مصل بقري جنيني (FBS) و 1 مل من البنسلين / الستربتوميسين.
- معطف 75 سم 2 قوارير مع بولي-L-يسين (50 ميكروغرام / لتر، 1.5 ميكروغرام / سم 2)، 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف القوارير مع برنامج تلفزيوني 1X.
- تخزين قوارير المغلفة في الثلاجة لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- تشريح
- يجب الموافقة على أي وسيلة للقتل الرحيم مقدما من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة والتي نفذت من قبل موظفين مؤهلين.
- اختيار الفئران الفطرية مثل الفئران فيشر.
- بعد تأكيد الفئران قد دخلت تخدير عميق مع بنتوباربيتال الصوديوم أو أشكال أخرى من التخدير عن طريق الحقن مثل الكيتامين / زيلازين، قطع رأس له وصemove الجلد.
- فتح الجمجمة من الأمامي إلى الجزء الخلفي.
- إزالة الرعاية أخذ OB لتجنب السحايا.
- في نفس الفئران، وفتح تجويف الأنف sagittaly.
- إزالة OM مع الحرص على تجنب الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي. لاحظ أن ظهارة OM يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال لونه إلى الصفرة.
- بروتوكولات بمزيد من التفصيل حول تشريح OM يمكن العثور في السابق J. تجاه. إكسب . نشر 13.
- ثقافة
- وضع OB في حل هانك مخزنة المالحة (HBSS) تحتوي على 0.1٪ التربسين لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وضع OM في HBSS تحتوي على 0.05٪ كولاجيناز A لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وقف الهضم الأنزيمي بإضافة 2 مل من المتوسط الدافئة.
- غسل الخلايا مع المتوسط وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لهم لمدة 3 دقائق.
- عينات يسحن من 2مل من المتوسط باستخدام ماصة P1000 حتى يتم الحصول على تعليق خلية متجانسة.
- لوحة الخلايا في قوارير precoated (5-10 × 10 6 خلية / قارورة) مع 25 مل من المتوسط الدافئة.
- احتضان والثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- تغيير نصف المتوسط كل يوم 2.
- بعد 6-8 أيام في المختبر، والتحقق من نسبة الخلايا P75 إيجابي على عينات الخلايا الصغيرة، ويفترض أن تكون منظمة دول شرق الكاريبي في القوارض، من خلال التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية. لهذه التحليلات، وعلامات أخرى يمكن دراستها مثل GFAP وS100β.
- تحليل التدفق الخلوي
- جمع الخلايا كما هو موضح في (القسم 2.2 أدناه) "زرع الخلايا".
- احتضان لهم P75 الأجسام المضادة الأولية (1:100) خلال 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مع 2 مل من EDTA-PBS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لهم لمدة 3 دقائق.
- احتضان الخلايا مع PE مترافق المضادة للماوس الضد الثانوية خلال 15دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام (1:200).
- غسل الخلايا مع 2 مل من EDTA-PBS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لهم لمدة 3 دقائق.
- resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-EDTA.
- تحليل 10-30 × 10 3 خلايا مع تدفق عداد الكريات.
- تحليل كيمياء سيتولوجية مناعية
- لوحة الخلايا في 6 لوحات جيدة precoated لمدة 48 ساعة كما هو موضح في "الثقافة" (القسم 1.1.2 أدناه).
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا مع PFA 4٪ لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع برنامج تلفزيوني / تريتون X100 (0.1٪) لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (1:200): P75، S100β وGFAP بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية (1:500) خلال 1 ساعة على RT في الظلام.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع هويشت 10 دقيقة في RT في الظلام.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- تحليل الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت.
- وضع العلامات الخلايا GFP
- قبل خمسة أيام من زرع، وتصيب OB OM الثقافات بين عشية وضحاها مع ناقلات lentiviral إيواء تعزيز GFP (تعدد العدوى: 20).
- قبل زرع الاختيار على عينات صغيرة من معدل الخلايا GFP إيجابية من قبل التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا في "الثقافة" (القسم 1.1).
2. عملية جراحية وزرع
- مفاغرة العصبية المتكررة
- يجب الموافقة على جميع التجارب مع الحيوانات مقدما من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة والتي نفذت من قبل موظفين مؤهلين.
- قبل الجراحة الأوتوكلاف جميع الصكوك والحفاظ على العقم في جميع أنحاء العمليات الجراحية.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين هيدروكلوريد (12.5 ملغ / كلغ) والكلوربرومازين هيدروكلوريد (0.625 ملغ / كلغ). تقييم كفاية تخدير بواسطة إصبع قرصة قبل الجراحة.
- وضع الفئران في ظهري استلقاء.
- إجراء 2 سم العمودي المتوسطة شق جلدي عنق الرحم مع مشرط.
- إجراء شق عمودي من العضلات تحت اللامي بعد خط أبيض وسطي.
- فضح الحنجرة باستخدام ضام بين العضلات تحت اللامي autostatic.
- فضح RLN.
- تحت السيطرة المجهرية، وقطع العصب كاملا مع microscissors على مستوى الحلقة السابعة القصبة الهوائية.
- أداء مفاغرة باستخدام نقطة واحدة من 11.0 خياطة تحت السيطرة المجهرية. يؤدي هذا إلى إزالة التعصيب جراحة المحركات محددة من الحنجرة.
- زرع الخلوية
- قبل زرع، وإزالة الخلايا من الأطباق باستخدام التربسين EDTA 0.05٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- وقف الهضم الأنزيمي بإضافة 2 مل من المتوسط الدافئة.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
- جعل إعداد الخلوية مع مزيج 01:02 (30 و 60 ميكرولتر في هذه التجربة) من DMEM/F12-Matrige لتر في أنبوب 1.5 مل قبل التطعيم ووضعه على الجليد. لتجنب آثار غير محددة، واستخدام عامل النمو خفضت Matrigel.
- فقط قبل عقد زرع أنبوب في يدك لبضع ثوان في عملية الاحماء مزيج Matrigel المتوسطة.
- خلع المزيج على موقع مفاغرة باستخدام ماصة وانتظر حتى يصبح الخليط ذاتيا على العصب المصاب.
- إغلاق العضلات والجلد مع خياطة 4.0.
- بيت الفئران بشكل فردي والحفاظ تحت مصباح التدفئة لمدة 24 ساعة.
3. تقييم
- تنظير الحنجرة
- تخدير الفئران عن طريق intraperit[أنل] حقن الكيتامين هيدروكلوريد (12.5 ملغ / كلغ) والكلوربرومازين هيدروكلوريد (0.625 ملغ / كلغ). يتم تخدير الفئران مع تأكيد قرصة أخمص القدمين قبل الشروع في البروتوكول.
- وضع الفئران في ظهري استلقاء.
- إدراج 30 ° videolaryngoscope تعديلها لتوفير أفضل عرض للالحنجرة. تحديد المعالم التشريحية لإعادة إنتاج نفس وجهة النظر لكل تسجيل.
- تسجيل حركات الحبال الصوتية باستخدام videolaryngoscope (5-10 متواليات / الحيوان). لكل حيوان حدد ثلاثة متواليات من التقريب القصوى المتعاقبة واختطاف القصوى.
- تحليل وظيفة الحنجرة باستخدام برمجيات تحليل الصور. تحديد حركة الزاوي المطلقة من خلال قياس الفرق بين حركة اختطاف القصوى والتقريب القصوى من الحبال الصوتية. تحديد درجة حيوية من خلال قياس السعة الحركة. تحديد درجة وظيفية من خلال قياس حركة تصاحبية والحركات paradoxal.
- الكهربائي (EMG)
- فضح الحنجرة والقصبة الهوائية عن طريق فتح الجلد والعضلات كما هو موضح سابقا في "مفاغرة العصبية المتكررة" (القسم 2.1).
- فضح الغضروف الحلقي الدرقي.
- فتح الغضروف الحلقي الدرقي لفضح الحلقي الطرجهالي الخلفي (PCA) في العضلات باستخدام microscissors.
- إدخال إبرة القطب الكهربائي (38 × 0.45 ملم) في العضلات PCA.
- تسجيل النشاط العضلي الكهربائي للعضلة PCA باستخدام نظام التهوية خلال اكتساب عفوية.
- تحليل النشاط العضلي من حيث ثراء وتزامن مع التنفس. لتحليل EMGS، تعيين النتيجة 0-3 النوعي باستخدام المقياس التالي: 0: تتبع unrhymed، دون زيادة خلال الإلهام، 1: مقفى تتبع مع الشهيق زيادة، ولكن الفقراء تتبع (نوروجين)، 2: مقفى تتبع مع النشاط أكثر ثراء، 3: مقفى البحث عن المفقودين، غنية جدا، ويشكل طنمط nterference، على غرار النشاط المتعمد القصوى.
- فضح العصب المبهم لقياس مدة الكمون والمحتملين. يتم اختيار العصب المبهم كموقع من التحفيز لRLN يمكن أن تتلف خلال التحفيز نظرا لصغر حجمها.
- تحفيز العصب المبهم مع القطب.
- تسجيل الإشارات الكهربائية في العضلات PCA. قياس الكمون والمدة المحتملة. إذا أمكن استخدام وحدة اقتناء لتسجيل النشاط العضلي، الكمون والمدة المحتملة مثل نظام Powerlab.
- الأنسجة
- الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة زائدة بنتوباربيتال.
- إزالة الجدعة البعيدة من RLN تحت السيطرة المجهرية. ويعرف الجزء الأعلى من RLN كجزء مفاغرة بين والحنجرة. لاحظ أنه من الممكن العثور على موقع مفاغرة بعد عدة أسابيع من الجراحة لأن خياطة 11.0 هو غير ممتص خياطة.
- وضع الجزء الأعلى من RLN في 2٪ غلوتارالدهيد مع 0.1 M الفوسفات(الرقم الهيدروجيني = 7.3) لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
- توجيه بعناية العينات لتحقيق المقاطع الاكليلية.
- غسل العينات في العازلة الفوسفات.
- قطع في قطاعات أصغر (3-4 ملم طول) وPOSTFIX لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 1٪ كاكوديلات مخزنة أوسو 4 والمجففة مع الايثانول.
- العينات في قوالب السيليكون توجيه وجزءا لا يتجزأ من راتنجات تتكون في POLYBED 812، DDSA وMNA، والتي تم إضافة 2٪ من مسرع BDMA.
- جعل المقاطع العرضية شبه رقيقة (1μm سميكة) باستخدام نظام Ultramicrotomy Pyramitome.
- وصمة عار مع 0.1٪ طولويدين الأزرق في 1٪ بورات الصوديوم لمدة 75 ثانية في 70 درجة مئوية.
- تحليل عينات RLN مع نظام تحليل العد. عد عدد من الألياف وقياس العصبي ملامح الألياف العصبية من خلال تحديد الحدود الخارجية والداخلية للغمد المايلين.
- ازدراع
- إعداد الخلايا للزرع وزرع الخلايا كما هو موضح سابقافي "زرع الخلايا" (القسم 2.2).
- تحليل
- الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة زائدة بنتوباربيتال. لاحظ أن التثبيت من الحيوانات يمكن القيام بها باستخدام الحقن داخل القلب من PFA 4٪.
- إزالة حوالي 2 سم من RLN. استخدام الداني والقاصي أجزاء من RLN.
- إصلاح عينة RLN في النيتروجين السائل.
- مخزن العينات في -80 درجة مئوية.
- عينات قطع طولي باستخدام ناظم البرد (10-20 ميكرون سميكة).
- تحليل العينات تحت المجهر الفلورسنت للكشف عن خلايا GFP إيجابية. لاحظ أن معاداة الأضداد GFP يمكن استخدامها لزيادة الانبعاثات مضان وأداء costainings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم اختيار الرسوم التوضيحية مع سيطرة وreinnervated (القسم / anastomosed) الحيوانات كما يمكن أن تختلف النتائج تبعا لزرع الخلوية تنفيذ (OM، OB أو OM + OB).
خلية ثقافة
الخلايا التقيد بسرعة إلى السطح البلاستيك وأصبح فصل في مساحات موازية من الخلايا التي هي ممدود أو مستدق، الثلاثي، متعدد الأقطاب، أو على شكل مغزل (أرقام 1A و 1B). بعد 8 أيام في المختبر التدفق الخلوي التحليل يظهر معدل الخلايا إيجابية P75، 71٪ في OB الابتدائي، و 13٪ في الثقافات الأولية OM (أرقام 1C و1D).
زرع الخلايا والجراحة
يتم زرع الخلايا في مزيج Matrigel المتوسطة على anastomosed RLN. يتم مفاغرة من RLN بفارق نقطة واحدة 11.0 خياطة (الشكل 2).
التقييم
Videolaryngoscسخ وبعد شهرين من زرع، وقد تم تحليل وظائف الحنجرة بواسطة videolaryngoscopy والكهربائي. وقد تم اختيار لتحقيق معالم تشريحية videolaryngoscopy لقياس الفرق بين الاختطاف والتقريب (الشكل 3).
الكهربائي
لإتمام هذه التحليلات أجريت دراسات EMG باستخدام إبرة القطب القطب مزروع في العضلات PCA. وتعرض آثار نموذجية ل(القسم / anastomosed) حيوانات طبيعية وreinnervated في الشكل 4.
التحليلات النسيجية
لهذه الحيوانات، وأجريت التحليلات النسيجية من RLN بواسطة تلطيخ الأزرق طولويدين. يتم عرض ملامح الألياف نموذجية ل(القسم / anastomosed) حيوانات طبيعية وreinnervated في أرقام 5A و 5B. لإكمال هذه التحليلات النسيجية، تم إجراء تتبع الخلايا GFP إيجابية. يوضح الشكل 5C ر انه جود خلايا GFP إيجابية في العصب الوركي بعد زرع داخل العصبي. وقد استخدم العصب الوركي عن السيطرة ويبلغ حجم RLN لا يسمح زرع داخل العصبي.
الشكل 1. الخصائص المورفولوجية والتعبير P75 في الثقافات الأولية من OB (A و C) وOM (B و D) في المختبر. (A و B) ومنظمة دول شرق الكاريبي في OB OM أعرب الثقافات الأولية الأشكال التضاريسية ممدود، الثلاثي، أو على شكل مغزل . (C و D) تم تحديد التعبير سطح خلية من P75 في OB وOM الثقافات الأولية من قبل التدفق الخلوي. أرقام تشير إلى مجموع السكان والنسبة المئوية للخلايا موجودة في المناطق المغلقة المشار إليها. من فضلك / 50590fig1highres.jpg "> انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صورة لمفاغرة من RLN يؤديها مع 11.0 خياطة. (A) مقطوع RLN قبل الجراحة. (B) التحام بين الداني والقاصي الجدعة من RLN. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"سرك =" / files/ftp_upload/50590/50590fig3.jpg "/>
الرقم 3. وجهات النظر بالمنظار نموذجية من الخطة المزمار الفئران. خلال التقييمات، ويتم تحديد المعالم من أجل أن يكون لها نفس مجال الرؤية لكل تسجيل. من وجهة النظر المعروضة يتم قياس كل من خطف القصوى (A) والتقريب القصوى (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. أمثلة من آثار EMG تم الحصول عليها أثناء التنفس في العضلة PCA. (أ) عرض الحيوانات من السيطرة على المجموعة والنشاط العضلي الكهربائي الغنية، مع زيادة خلال الإلهام. (
الرقم 5. دراسات نسيجية العصبي. (A و B) مثال من أقسام الاكليلية من RLN من مجموعة المراقبة. وأظهر هذا التحليل أن السيطرة على المجموعة قدمت عددا أكبر من الألياف العصبي. (A) التكبير 3،960 X و (ب) التكبير 11،900 X. (C) GFP المسمى OBظلت-الكاريبي في موقع الآفة في العصب الوركي الفئران سحق و. التكبير 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التقنيات المقدمة هنا جعل الكاريبي نموذجا مفيدا لدراسة زرع الخلوية في نماذج إصابة الأعصاب الطرفية. بروتوكول خلية ثقافة واضحة نسبيا ويمكن حملها بسهولة. من ناحية أخرى، والعمليات الجراحية، ولا سيما الفرع / مفاغرة من RLN، تحتاج إلى خبرة ويجب أن تنفذ من قبل موظفين مؤهلين.
الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول تسليط الضوء على العوامل الهامة للتركيز عليها في أجل الحصول على أفضل النتائج الممكنة. الأول، أثناء تفكك OM، نوصي تشريح دقيق للحصول فقط الظهارة الشمية وليس في الجهاز التنفسي. الثانية، لمفاغرة من RLN، ونحن نوصي لأداء نقطة واحدة فقط مع 11.0 خياطة. الثالث، خلال عمليات التقييم من المهم جدا أن يكون نفس عمق التخدير بين جميع الحيوانات. على وجه الخصوص، التخدير العميق يقلل من اتساع حركة الحبال الصوتية أثناء videolaryngoscopy. نوصي صemoving والمنظار في أقرب وقت ممكن لتجنب الاختناق من الحيوانات. أثناء تسجيل EMG، وذلك بسبب حجم العضلات PCA نوصي وضع بعناية القطب إبرة أحادي القطب. أخيرا، للدراسات نسيجية من المهم توجيه بعناية العينات RLN للحصول على المقاطع الاكليلية. بل هو أيضا مهم جدا لإزالة وتحليل الجزء الأعلى من RLN التي يحدث ولري انحطاط.
البروتوكولات وصفها هنا يمكن تعديلها بسهولة من أجل توليد الثقافات تنقيته من منظمة دول شرق الكاريبي من OB وOM. لتنقية الكاريبي من OB نوصي تقنية وصفها ناش 14 و لتنقية الكاريبي من OM نوصي الطريقة الموصوفة من قبل بيانكو 15. هذه الأساليب تنقية محددة تسمح اثنين قد تنقيته درجة عالية من ثقافات منظمة دول شرق الكاريبي (90٪)، وقد سبق وصفها بشكل جيد من قبل مؤلفيها 14،15. تعديل آخر محتمل هو الإجراء زرع وهره ويمكن حقن الخلايا مباشرة في الأعصاب الطرفية كما هو موضح سابقا عن العصب الوركي 7. في هذه الحالة يمكن حقن الخلايا دون Matrigel. من المهم أن نلاحظ أنه نظرا لحجم RLN أنه ليس من الممكن لحقن الخلايا مباشرة في هذا العصب. أخيرا تعديل آخر محتمل هو تعظيم الاستفادة من بروتوكول EMG. في الواقع، والتسجيلات النشاط العضلي للعضلات الحجاب الحاجز وPCA لا يمكن أن يؤديها معا، مما يلغي الحاجة للتزامن بين الحنجرة والعضلات التنفسية.
البروتوكولات الحالية يمكن تطبيقها في نماذج أخرى الآفة العصبي. لقد زرع بالفعل الكاريبي في عدة نماذج من PNI مثل الأعصاب الوركي والمبهم، هذه العلاجات يمكن استخدامها بسهولة في غيرها من النماذج PNI 8،11،12،16. أكثر من المثير للاهتمام زرع الخلوية الكاريبي يمكن أن تمتد إلى أمراض الجهاز العصبي المركزي وخاصة اصابات النخاع الشوكي. الطريقة الموصوفة هنا لقياس الحنجرةيمكن أيضا وظيفة بعد القسم RLN / مفاغرة استخدامها لغيرها من البروتوكولات زرع الخلوية. في الواقع، يمكن أن تكون نماذج الحنجرة قوية جدا لتقييم محور عصبي وإعادة نمو حركة تصاحبية الظواهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه ADIR (معاون à الموطن منتدى قلعة Insuffisants Respiratoires) ومؤسسة DE L'أفينير لدعمها المالي وللدكتور Fanie Barnabé-حيدر لتحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
