Summary
Lukte ensheathing celler (OECs) er neural crest cellene som tillater vekst av de primære olfactory nerveceller. Denne spesielle egenskapen kan brukes til celletransplantasjon. Vi presenterer her en modell for celletransplantasjon basert på bruk av OECs i et laryngeal nerveskade modell.
Abstract
Lukte ensheathing celler (OECs) er neural crest cellene som tillater vekst og gjenvekst av de primære olfactory nerveceller. Faktisk er den primære luktsystemet kjennetegnes ved sin evne til å gi opphav til nye nerveceller, selv i voksne dyr. Denne spesielle evne er delvis på grunn av tilstedeværelsen av OECs som skaper et gunstig mikromiljø for neurogenesis. Denne egenskapen av OECs har vært brukt for cellular transplantasjon for eksempel i ryggmargsskade modeller. Selv om det perifere nervesystemet har en større kapasitet til å regenerere etter nerveskade enn det sentrale nervesystemet, komplette seksjoner indusere misrouting ved aksonal gjenvekst i særdeleshet etter ansikts av strupenervetranseksjon. Nærmere bestemt, full seksjonering av tilbakevendende strupehodet nerve (RLN) induserer avvik axonal gjenvekst som resulterer i synkinesis av stemmebåndene. I denne spesifikke modellen, viste vi at OECs transplantasjon effektivt øker aksonal gjenvekst.
ve_content "> OECs utgjøres av flere subpopulasjoner som er tilstede i både den olfaktoriske mucosa (OM-OECs) and olfactory pærer (OB-OECs). Vi presenterer her en modell for celletransplantasjon basert på bruken av disse forskjellige subpopulasjoner av OECs i en RLN skademodell. Ved hjelp av dette paradigmet, ble primærkulturer av OB-OECs og OM-OECs transplantert i Matrigel etter seksjon og anastomose av RLN. To måneder etter operasjonen, vi evaluert transplanterte dyr ved supplerende analyser basert på videolaryngoscopy, elektromyografi (EMG) og histologiske undersøkelser. Først videolaryngoscopy tillot oss å evaluere laryngeale funksjoner, spesielt muskel cocontractions fenomener. Deretter analyser EMG demonstrert fylde og synkronisering av muskel-aktivitet. Endelig histologiske studier basert på toluidin blå farging tillates kvantifisering av antallet og profilen myelinerte fibre.Alle sammen, beskriver vi her hvordan du isolerer, kultur, vederbukntify og transplantasjon OECs fra OM og OB etter RLN seksjon-anastomose og hvordan man skal vurdere og analysere effektiviteten av disse transplanterte cellene på aksonale Etterveksten og strupe funksjoner.
Introduction
Den primære luktsystemet er sammensatt av to distinkte deler; lukte mucosa (OM) i det perifere nervesystemet og luktelappen (OB) i det sentrale nervesystemet. Den primære luktsystemet er preget av kapasiteten på de primære olfactory nevroner (PON) til selv fornye hele livet i pattedyrarter. Denne evnen er gjort mulig på grunn av tilstedeværelsen av nevrale stamceller i OM. PON vekst og gjenvekst fra OM til OB er tilrettelagt av spesialiserte gliaceller kalt lukte ensheathing celler (OECs). OECs er neural crest cellene som skaper et gunstig mikromiljøet for neurogenesis av PON fra OM til OB ett. Derved kan OECs bli funnet i OM og i OB som utgjør forskjellige subpopulasjoner av celler 2,3. De ulike egenskapene til OECs har ført forskere til å bruke dem for mobilnettet transplantasjoner i flere nervesystemet lesjon paradigmer fire. Faktisk OECs produsere vekstfaktorer, redusere glial scaring, prOmote axonal gjenvekst, og kan fritt blande seg med astrocytter 5,6. Imidlertid er det store flertallet av disse studiene basert på ryggmargsskade (SCI), noen av dem har brukt OECs etter perifer nerveskade (PNI) 7,8.
Selv om det perifere nervesystemet har en stor kapasitet til å regenerere etter nerveskade, komplette seksjoner indusere avvik aksonal gjenvekst. Faktisk, etter komplette transections av ansikts-eller tilbakevendende strupehodet nerver (RLN) sendt feil axons forårsake muskel cocontractions kalt synkinesis. Derfor er det av avgjørende betydning å foreslå en modell av PNI å ikke bare tallfeste axonal gjenvekst, men også for å evaluere effektiviteten av muskelsammentrekninger. I litteraturen er det mest vanlige modellen er beskrevet er basert på ansiktsnerven lesjon 9,10. I denne modellen er funksjonelle evalueringer basert på utvinning av whisker bevegelser 10. Men det er vanskelig å demonstrere effektiviteten av movements og å diskriminere de muskuløse cocontractions fenomener. Vi foreslår her en modell basert på en RLN lesjon. Denne modellen gjør det mulig å evaluere ikke bare axonal gjenvekst og bevegelser av stemmebåndene, men også effektiviteten og funksjonaliteten til disse bevegelsene etter cellulære transplantasjoner 11,12. Denne protokollen gir en trinnvis fremgangsmåte til kultur og transplantasjon OECs fra OM og OB i en RLN seksjon / anastomose modell og å evaluere dyr etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Primærkulturer av olfactory Mucosa og olfactory pærer
- Før disseksjon
- Lag medium, i 50 ml, ved å tilsette 44 ml av kalsium-fri Dulbeccos Modified Eagle 's / Ham' s F12 medium (DMEM/F12), supplert med 5 ml kalvefosterserum (FBS), og 1 ml penicillin / streptomycin.
- Coat 75 cm 2 kolber med poly-L-lysin (50 mikrogram / ml, 1,5 pg / cm 2) 1 time ved romtemperatur.
- Skyll kolber med PBS 1x.
- Oppbevar belagt kolber i kjøleskapet i opptil en uke.
- Disseksjon
- Enhver metode for aktiv dødshjelp må godkjennes på forhånd av institusjonens dyr omsorg og bruk komiteen og utføres av kvalifisert personell.
- Velg innavlede rotter som Fischer rotter.
- Etter at rotta har blitt bekreftet å ha inngått dyp anestesi med natrium pentobarbital eller andre injiserbare former for bedøvelse som ketamin / xylazin, halshogge ham og rEDra huden.
- Åpne skallen fra fremre til bakre del.
- Fjern OB ta vare å unngå hjernehinnene.
- I samme rotte, åpner nesehulen sagittaly.
- Ta ut OM ta vare å unngå luftslimhinnen. Merk at OM epitel kan lett identifiseres ved sin gulaktig farge.
- Videre detaljerte protokoller om disseksjon av OM kan finne i en tidligere J. Vis. Exp . publikasjon 13.
- Kultur
- Plasser OB i Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) inneholdende 0,1% trypsin i 45 minutter ved 37 ° C.
- Plasser OM i HBSS inneholdende 0,05% kollagenase A i 45 minutter ved 37 ° C.
- Stopp enzymatisk fordøyelse ved tilsetning av 2 ml varmt medium.
- Vask cellene med medium og sentrifuger dem ved 300 x g i 3 min.
- Triturer prøver av toml medium ved å bruke en P1000 pipette inntil en homogen cellesuspensjon blir oppnådd.
- Plate cellene i precoated kolber (5-10 x 10 6 celler / kolbe) med 25 ml varm medium.
- Inkuber og kultur cellene ved 37 ° C med 5% CO2.
- Endring halvparten av mediet hver 2 dager.
- Etter 6-8 dager i vitro, sjekk andelen av p75 positive celler på små celleprøver, som antas å være OECs i gnagere, ved flowcytometri eller ved immunocytochemistry. For disse analysene, kan andre markører studeres som GFAP og S100β.
- Flowcytometri analyse
- Samle-celler som beskrevet i "celletransplantasjon" (del 2.2 nedenfor).
- Inkuber dem med p75 primære antistoff (1:100) i 15 min ved 4 ° C.
- Vask cellene med 2 ml PBS-EDTA og sentrifuger dem ved 300 x g i 3 min.
- Inkuber cellene med PE-konjugert anti-mus-sekundært antistoff under 15min ved 4 ° C i mørket (1:200).
- Vask cellene med 2 ml PBS-EDTA og sentrifuger dem ved 300 x g i 3 min.
- Resuspender cellene i 500 pl PBS-EDTA.
- Analyser 10-30 x 10 3 celler med flow-cytometer.
- Immunocytochemistry analyse
- Plate cellene i 6-brønns plater belegges på forhånd i 48 timer som beskrevet i "kultur" (seksjon 1.1.2 nedenfor).
- Vask cellene med PBS.
- Løser cellene med PFA 4% i 15 min ved RT.
- Vask cellene med PBS.
- Inkuber cellene med PBS / Triton X100 (0,1%) i 15 min ved RT.
- Vask cellene med PBS.
- Inkuber cellene med primære antistoffer (1:200): p75, S100β og GFAP over natten ved 4 ° C.
- Vask cellene med PBS.
- Inkuber cellene med de sekundære antistoffer (1:500) i løpet av en time ved RT i mørket.
- Vask cellene med PBS.
- Inkuber cellene med Hoechst 10 min ved RT i mørket.
- Vask cellene med PBS.
- Analyser cellene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
- GFP merking celler
- Fem dager før transplantasjonen, infisere OB og OM kulturer over natten med lentiviral vektor husing forbedret GFP (mangfold av infeksjon: 20).
- Før transplantasjon sjekk på små prøver frekvensen av GFP positive celler ved flow-cytometri som tidligere beskrevet i "kultur" (pkt. 1.1).
2. Kirurgi og transplantasjon
- Tilbakevendende nerve anastomose
- Alle forsøk med dyr må på forhånd godkjennes av institusjonens dyr omsorg og bruk komiteen og utføres av kvalifisert personell.
- Før kirurgi autoklaven alle instrumenter og opprettholde sterilitet i hele den kirurgiske prosedyrer.
- Anesthetize rotter ved intraperitoneal injeksjon av ketamin-hydroklorid (12,5 mg / kg) og klorpromazin-hydroklorid (0,625 mg / kg). Vurdere tilstrekkeligheten av anestesi ved tå klype før operasjonen.
- Plasser rotte i rygg liggesår.
- Utfør en 2 cm vertikal medium cervical cutaneous snitt med en skalpell.
- Utfør et vertikalt snitt av de infrahyoid muskler etter den mediale hvite linjen.
- Expose strupehode ved hjelp autostatic beltesnellen mellom infrahyoid muskler.
- Utsett RLN.
- Under mikroskopisk kontroll, kutte nerve fullt med microscissors på nivå med den syvende tracheal ring.
- Utfør anastomose ved hjelp av ett punkt på 11,0 sutur etter mikroskopisk kontroll. Denne operasjon fører til en bestemt motor denervering av strupehodet.
- Cellular transplantasjon
- Like før transplantasjon, fjernes cellene fra de retter med 0,05% trypsin-EDTA i 5 min ved 37 ° C.
- Stopp enzymatisk fordøyelse ved tilsetning av 2 ml varmt medium.
- Sentrifuger ved 300 x g i 3 min.
- Gjør cellular forberedelse med 01:02 blanding (30 og 60 mL i dette eksperimentet) av DMEM/F12-Matrige l i 1,5 ml tube før pode og plassere den på is. For å unngå uspesifikke effekter, bruke vekstfaktor redusert Matrigel.
- Like før transplantasjonen holde røret i hånden i noen få sekunder for å varme opp Matrigel-medium blanding.
- Avsette miksen på anastomosestedet ved hjelp av en pipette og vent til blandingen selv setter sammen på den skadde nerven.
- Lukk musklene og huden med en 4,0 sutur.
- Hus rottene individuelt og holde under en varmelampe for 24 hr.
Tre. Evaluering
- Laryngoskopi
- Anesthetize rotter ved intraperitOneal injeksjon av ketamin-hydroklorid (12,5 mg / kg) og klorpromazin-hydroklorid (0,625 mg / kg). Bekreft rotter blir bedøvet med en tå klype før du fortsetter med protokollen.
- Plasser rotte i rygg liggesår.
- Sett en 30 ° videolaryngoscope justert for å gi den beste utsikten over strupehodet. Bestem anatomiske landemerker for å reprodusere den samme visningen for hvert opptak.
- Spill stemmebånd bevegelser ved hjelp av videolaryngoscope (5-10 sekvenser / dyr). For hvert dyr velge tre sekvenser av suksessive maksimal adduksjon og maksimal bortføring.
- Analyser strupefunksjonen ved hjelp av bildeanalyse programvare. Bestem absolutt kantete bevegelser ved å måle forskjellen mellom bevegelse av maksimal bortføring og maksimal adduksjon av stemmebåndene. Bestem dynamisk poengsum ved å måle bevegelsen amplitude. Bestem funksjonell poengsum ved å måle synkinesis og paradoksal bevegelser.
- Elektromyografi (EMG)
- Expose strupehode og luftrør ved å åpne huden og musklene som tidligere beskrevet i "tilbakevendende nerve anastomose" (pkt. 2.1).
- Utsett cricothyroid brusk.
- Åpne cricothyroid brusk å eksponere bakre cricoarytenoid (PCA) muskel bruker microscissors.
- Innføre en monopolar nålelektrode (38 x 0,45 mm) i PCA-muskelen.
- Måler den elektriske muskelaktivitet i PCA muskelen ved hjelp av en anskaffelsessystem under spontan ventilasjon.
- Analyser muskelaktivitet i form av rikdom og synkronisering med respirasjonen. Å analysere EMGS tildele en kvalitativ poengsum på 0-3 bruker følgende skala: 0: unrhymed tracing, uten økning i løpet av inspirasjon, 1: rhymed tracing med inspirasjons økende, men dårlig sporing (neurogen), 2: rhymed tracing med rikere aktivitet, 3: rhymed sporing, veldig rik, som utgjør en interference mønster, ligner på en maksimal tilsiktet aktivitet.
- Expose vagus nerve til å måle ventetid og potensialer. Den vagus nerve er valgt som stedet for stimulering fordi RLN kan bli skadet under stimulering på grunn av sin lille størrelse.
- Stimuler vagusnerven med en elektrode.
- Ta opp elektriske signaler i PCA muskel. Mål ventetid og potensialer. Hvis det er mulig å bruke et oppkjøp modul for å registrere muskelaktivitet, ventetid og potensiell varighet som Powerlab system.
- Histologi
- Avlive dyret ved hjelp av pentobarbital overdose.
- Fjern den distale stubben av RLN henhold mikroskopisk kontroll. Den distale del av RLN er definert som den delen mellom anastomose og strupehodet. Legg merke til at det er mulig å finne anastomosestedet flere uker etter operasjonen, fordi 11.0 suturen er en ikke-resorberbar sutur.
- Plasser den distale delen av RLN i 2% glutaraldehyd med 0,1 M fosfat(PH = 7,3) i 2 timer ved 4 ° C.
- Nøye orientere prøvene for å realisere koronale seksjoner.
- Vask prøvene i fosfatbuffer.
- Skjær i mindre segmenter (3-4 mm lengde) og postfiks i 60 minutter ved romtemperatur i 1% kakodylat bufret oso 4 og dehydratisert med etanol.
- Orient prøver i silikon muggsopp og innebygd i harpiks som består i POLYBED 812, DDSA og MNA, som ble lagt til 2% av gasspedalen BDMA.
- Gjør semi-tynne tverrgående seksjoner (1/iM-tykk) ved hjelp av en Pyramitome Ultramicrotomy System.
- Flekk med 0,1% toluidinblått i 1% natrium tetraborate for 75 sek ved 70 ° C.
- Analyser RLN prøver med en telleanalysesystem. Tell antall fibre og måle myelinerte nerve profiler ved å bestemme den ytre og den indre grensen av myelinlaget.
- Transplantasjon
- Forbered celler for transplantasjon og transplantere cellene som tidligere beskreveti "celletransplantasjon" (pkt. 2.2).
- Analyse
- Avlive dyret ved hjelp av pentobarbital overdose. Legg merke til at fiksering av dyrene kan utføres ved hjelp intrakardial injeksjon av PFA 4%.
- Fjern rundt 2 cm av RLN. Bruk proksimale og distale deler av RLN.
- Fix RLN prøve i flytende nitrogen.
- Oppbevar prøver ved -80 ° C.
- Cut prøver lengde hjelp kryostat (10-20 mikrometer tykk).
- Analysere prøver under fluorescerende mikroskop for å oppdage GFP positive celler. Legg merke til at anti-GFP-antistoff kan bli brukt til å øke fluorescensemisjonen, og for å utføre costainings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Illustrasjoner med kontroll og reinnervated (seksjon / anastomoseres) dyr har blitt valgt som resultatene kan variere avhengig av mobilnettet transplantasjoner utføres (OM, OB eller OM + OB).
Cellekultur
Cellene holder seg raskt til plastoverflaten og ble segregert i parallelle ranker av celler som er langstrakt eller tapering, trekantet, multipolar, eller spindel-formet (figur 1A og 1B). Etter 8 dager i vitro flowcytometri analyse viser frekvensen av p75 positive celler, 71% i primær OB, og 13% i primær OM kulturer (Tall 1C og 1D).
Cellular transplantasjon og kirurgi
Cellene blir transplantert i en Matrigel-medium blanding på anastomosert RLN. Anastomose av RLN er laget av et punkt på 11,0 sutur (figur 2).
Evalueringer
Videolaryngosciering To måneder etter transplantasjon, laryngeal funksjoner ble analysert ved videolaryngoscopy og elektromyografi. For å realisere videolaryngoscopy anatomiske landemerker ble valgt for å måle forskjellen mellom bortføring og adduksjon (figur 3).
Elektromyografi
For å fullføre disse analysene EMG studier ble gjennomført med mono nålelektrode implantert i PCA muskler. Typiske spor for normale og reinnervated (seksjon / anastomoseres) dyr er presentert i Figur 4.
Histologiske analyser
For disse dyrene ble histologiske analyser av RLN utført av toluidin blå farging. Typiske fiber profiler for normale og reinnervated (seksjon / anastomoseres) dyr er presentert i figur 5A og 5B. For å fullføre disse histologiske analyser, ble sporing av GFP positive celler utført. Figur 5C illustrerer t han nærvær av GFP positive celler i isjiasnerven etter intra-nervøs transplantasjon. Sciatic nerve har vært brukt som kontroll som RLN størrelse ikke tillater intra-nervøse transplantasjon.
Figur 1. Morfologiske egenskaper og P75 ekspresjon i primære kulturer av OB (A og C) og OM (B og D) in vitro. (A og B) OECs i OB, og OM primære kulturer uttrykt langstrakte, trekantet, eller spindel-formede morfologi . (C og D) Cell overflate uttrykk av p75 i OB og OM primærkulturer ble bestemt av flowcytometri. Tallene indikerer den totale befolkningen, og andelen av celler til stede i de angitte gated regioner. Vennligst / 50590fig1highres.jpg "> klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilde av en anastomose av RLN utført med 11,0 sutur. (A) seksjonert RLN før kirurgi. (B) Anastomose mellom proksimale og distale stubben av RLN. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / files/ftp_upload/50590/50590fig3.jpg "/>
Figur 3. Typiske endoskopiske utsikt over rotte glottis plan. Under evalueringer, er landemerker bestemt for å ha samme synsfelt for hver innspilling. Fra present utsikt både maksimal bortføring (A) og maksimal adduksjon (B) måles. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 Eksempler på EMG-spor innhentet under respirasjon i PCA muskelen.. (A) Dyrene i kontrollgruppen presenterte en rik elektrisk muskelaktivitet, med en økning i løpet av inspirasjon. (
Figur 5. Histologiske nervøse studier. (A og B) Eksempel koronale seksjoner av RLN fra kontrollgruppen. Denne analysen viste at kontrollgruppen presentert et høyere antall myelinerte fibre. (A) Forstørrelse 3960 X og (B) forstørrelse 11900 X. (C) GFP merket OB-OECs holdt seg på lesjonen nettstedet inn knust rotte isjiasnerven. Forstørrelse 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene som presenteres her gjør OECs en nyttig modell for å studere cellulære transplantasjoner i perifere nerveskader modeller. Cellekultur-protokollen er relativt enkel og kan lett utføres. På den annen side, kirurgiske inngrep, spesielt punkt / anastomose av RLN, krever erfaring og må utføres av fagfolk.
Prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen markere viktige faktorer for å fokusere på for å oppnå best mulig resultat. Først under dissosiasjon av OM, anbefaler vi forsiktig disseksjon å skaffe bare lukte og ikke respiratorisk epitel. For det andre, for den anastomose av RLN, anbefaler vi å utføre bare ett poeng med en 11,0 sutur. For det tredje, ved evalueringer er det meget viktig å ha den samme dybden av anestesi mellom alle dyr. Spesielt reduserer dyp anestesi amplitude av bevegelse av stemmebåndene under videolaryngoscopy. Vi anbefaler removing laryngoskop så snart som mulig for å unngå kvelning av dyrene. I løpet av EMG-registrering, på grunn av størrelsen av de PCA muskler vi anbefaler nøye å plassere den monopolare nålelektrode. Til slutt, for histologiske undersøkelser, er det viktig å nøye orientere RLN prøvene for å skaffe koronale seksjoner. Det er også meget viktig å ta ut og analysere den distale delen av RLN der oppstår Wallerian degenerasjon.
Protokollene som er beskrevet her kan enkelt endres for å generere rensede kulturer av OECs fra OB og OM. For rensing av OECs fra OB anbefaler vi teknikken beskrevet av Nash 14 og for rensing av OECs fra OM vi anbefaler metoden beskrevet av Bianco 15. Disse to spesielle rensemetoder tillater å ha svært renset kulturer av OECs (90%), og tidligere er blitt godt beskrevet av forfatterne 14,15. En annen mulig endring er transplantasjon prosedyre der hvore cellene kan injiseres direkte inn i en perifer nerve som beskrevet tidligere for hoftenervene 7.. I dette tilfelle cellene kan injiseres uten Matrigel. Det er viktig å merke seg at på grunn av størrelsen på RLN er det ikke mulig å injisere cellene direkte inn i denne nerve. Endelig er en annen mulig modifikasjon er optimalisering av EMG-protokollen. Faktisk, kan muskelaktivitet opptak av PCA og membran muskler utføres sammen, noe som eliminerer behovet for synkronisering mellom strupehodet og pustemuskulaturen.
De aktuelle protokollene kan brukes i andre nervøse lesjon paradigmer. Vi har allerede transplantert OECs i flere modeller av PNI som sciatic og vagus nervene, kan disse terapi enkelt brukes i andre PNI paradigmer 8,11,12,16. Mer interessant celletransplantasjon OECs kan utvides til sentralnervesystemsykdommer i særdeleshet SCI. Metoden som beskrives her for måling av laryngealfunksjon etter RLN seksjon / anastomose kan også brukes til andre cellulære transplantasjoner protokoller. Faktisk kan strupe modeller være svært kraftig for å evaluere aksonale Etterveksten og synkinesis fenomener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Adir (Aide à Bosted aux Insuffisants Respiratoires) og Fondation de l'Avenir for deres økonomiske støtte og til Dr. Fanie Barnabé-Heider for redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
