Transplantation av Lukt Ensheathing celler att utvärdera funktionell återhämtning efter perifer nervskada
Summary
Olfactory ensheathing celler (OECS) är neurallistceller som tillåter tillväxt av de primära olfactory neurons. Denna särskilda egenskap kan användas för celltransplantation. Vi presenterar här en modell av cellulär transplantation baserad på användningen av OECS i en laryngeal nerve injury model.
Abstract
Olfactory ensheathing celler (OECS) är neurallistceller som tillåter tillväxt och återväxt av de primära olfactory neurons. I själva verket är det primära luktsystemet kännetecknas av sin förmåga att ge upphov till nya nervceller även hos vuxna djur. Denna speciella förmåga beror delvis på närvaron av OECS som skapar ett gynnsamt mikromiljö för neurogenes. Denna egenskap hos OECS har använts för cellulär transplantation såsom vid ryggmärgsskada modeller. Även det perifera nervsystemet har en större förmåga att regenerera efter nervskada än det centrala nervsystemet, kompletta sektioner inducerar feldirigering under axonal återväxt särskilt efter ansiktsbehandling av larynx nerv transection. Specifikt fullt sektionering av den återkommande larynx nerv (RLN) framkallar avvikande axonal återväxt vilket resulterar i synkinesis av stämbanden. I den här specifika modellen visade vi att OECS transplantation ökar effektivt axonal återväxt.
ve_content "> OECS utgöres av flera subpopulationer som är närvarande i både det olfaktoriska slemhinnan (OM-OECS) och de olfactory glödlampor (OB-OECS). Vi presenterar här en modell av cellulär transplantation baserad på användningen av dessa olika subpopulationer av OECS i en RLN skademodell. Med hjälp av detta paradigm har primära kulturer av OB-OECS och OM-OECS transplanterade i Matrigel efter avsnitt och anastomos av RLN. Två månader efter operationen, vi utvärderade transplanterade djur genom kompletterande analyser baserade på videolaryngoscopy, elektromyografi (EMG) och histologiska studier. Först videolaryngoscopy tillät oss att utvärdera laryngeal funktioner, särskilt muskel cocontractions fenomen. Sedan EMG analyser visat rikedom och synkronisering av muskelaktiviteter. Slutligen histologiska studier baserade på toluidinblå färgning tillät kvantifiering av antalet och profilen av myeliniserade fibrer.Alla tillsammans, beskriver vi här hur man isolera, kultur, idntify och transplantation OECS från OM och OB efter RLN avsnittet-anastomos och hur man ska värdera och analysera effektiviteten i de transplanterade cellerna på axonal återväxt och laryngeal funktioner.
Introduction
Det primära luktsystemet består av två separata delar, luktslemhinna (OM) i perifera nervsystemet och luktbulben (OB) i det centrala nervsystemet. Det primära luktsystemet kännetecknas av förmågan hos de primära lukt nervceller (PON) för att själv förnya hela livet i däggdjursarter. Denna förmåga är möjligt på grund av närvaron av neurala stamceller i OM. PON tillväxt och återväxt från OM till OB underlättas av specialiserade gliaceller kallas lukt ensheathing celler (OECS). OECS är neurallistceller som skapar ett gynnsamt mikromiljö för neurogenes av PON från OM till OB 1. Därigenom kan OECS finns i OM och i OB utgör olika subpopulationer av celler 2,3. De olika egenskaperna för OECS har bly forskare för att använda dem för celltransplantationer i flera nervsystemet lesion paradigm 4. Faktum OECS producerar tillväxtfaktorer, minska gliaceller skrämma, promote axonal återväxt, och kan fritt blandas med astrocyter 5,6. Men de allra flesta av dessa studier bygger på ryggmärgsskada (SCI), några av dem har använt OECS efter perifer nervskada (PNI) 7,8.
Även det perifera nervsystemet har en stor förmåga att regenerera efter nervskada, kompletta sektioner framkallar avvikande axonal återväxt. Ja, efter kompletta transections i ansiktet eller de återkommande larynx nerver (RLN) misrouted axoner orsakar muskel cocontractions kallas synkinesis. Därför är det av största vikt att föreslå en modell för PNI att inte bara kvantifiera axonal återväxt utan också för att utvärdera effektiviteten av muskelsammandragningar. I litteraturen den vanligaste modellen som beskrivs bygger på ansiktsnerven lesion 9,10. I denna modell är funktionella bedömningar baserade på återvinning av morrhår rörelser 10. Det är emellertid komplicerat att demonstrera effektiviteten i movements och att diskriminera de muskulära cocontractions fenomen. Vi föreslår här en modell som bygger på en RLN lesion. Denna modell gör det möjligt att utvärdera inte bara axonal återväxt och rörelser stämbanden utan även effektiviteten och funktionaliteten av dessa rörelser efter cellulära transplantationer 11,12. Protokollet ger en steg för steg för att kultur och transplantation OECS från OM och OB i en RLN sektion / anastomos modell och att utvärdera djur efter operationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De tekniker som presenteras här gör OECS en användbar modell för att studera cellulära transplantationer i perifera nervskador modeller. Cellodlings protokoll är relativt enkelt och lätt kan genomföras. Å andra sidan, kirurgiska ingrepp, särskilt avsnitt / anastomos av RLN, kräver erfarenhet och måste utföras av behörig personal.
De procedurer som beskrivs i detta protokoll belysa viktiga faktorer att fokusera på för att uppnå bästa möjliga resultat. Först under dissociat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för ADIR (Aide à Säte aux Insuffisants Respiratoires) och Fondation de l'Avenir för deras ekonomiska stöd och Dr Fanie Barnabé-Heider för redigering av manuskriptet.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
