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Neuroscience

परिधीय तंत्रिका चोट के बाद कार्यात्मक वसूली का मूल्यांकन करने के लिए घ्राण ensheathing कोशिकाओं के प्रत्यारोपण

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/50590
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1, 1,4, 1, 1,3
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

Summary

घ्राण ensheathing कोशिकाओं (OECs) प्राथमिक घ्राण न्यूरॉन्स के विकास की अनुमति है जो तंत्रिका शिखा कोशिकाओं रहे हैं. इस विशिष्ट संपत्ति सेलुलर प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम यहाँ एक laryngeal तंत्रिका चोट मॉडल में OECs के उपयोग पर आधारित सेलुलर प्रत्यारोपण का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

घ्राण ensheathing कोशिकाओं (OECs) प्राथमिक घ्राण न्यूरॉन्स के विकास और regrowth की अनुमति जो तंत्रिका शिखा कोशिकाओं रहे हैं. दरअसल, प्राथमिक घ्राण प्रणाली भी वयस्क पशुओं में नए न्यूरॉन्स को जन्म देने की क्षमता की विशेषता है. यह विशेष रूप से क्षमता neurogenesis के लिए एक अनुकूल microenvironment बना जो OECs की उपस्थिति के कारण आंशिक रूप से है. OECs की इस संपत्ति रीढ़ की हड्डी में चोट के मॉडल के रूप में सेलुलर प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया गया है. परिधीय तंत्रिका तंत्र केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से तंत्रिका चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए अधिक से अधिक क्षमता है, हालांकि पूरी वर्गों laryngeal तंत्रिका transection के चेहरे के बाद विशेष रूप से axonal regrowth के दौरान misrouting प्रेरित. विशेष रूप से, आवर्तक laryngeal तंत्रिका (RLN) की पूर्ण सेक्शनिंग मुखर रस्सियों के synkinesis में जिसके परिणामस्वरूप न्यायपालिका axonal regrowth लाती है. इस विशिष्ट मॉडल में, हम OECs प्रत्यारोपण कुशलतापूर्वक axonal regrowth बढ़ जाती है कि पता चला है.

ve_content "> OECs घ्राण म्यूकोसा (OM-OECs) और घ्राण बल्ब (ओ OECs) दोनों में मौजूद कई subpopulations का गठन किया जाता है. हम यहाँ एक में OECs के इन विभिन्न subpopulations के उपयोग पर आधारित सेलुलर प्रत्यारोपण की एक मॉडल पेश RLN चोट मॉडल. इस प्रतिमान का उपयोग करना, ओ OECs और ओम-OECs के प्राथमिक संस्कृतियों RLN की धारा और सम्मिलन के बाद Matrigel में प्रत्यारोपित किया गया. दो महीने सर्जरी के बाद, हम videolaryngoscopy पर आधारित पूरक विश्लेषण द्वारा प्रतिरोपित जानवरों का मूल्यांकन, विद्युतपेशीलेखन (EMG) , और ऊतकीय पढ़ाई. पहले, videolaryngoscopy विशेष में पेशी cocontractions घटना. फिर, EMG का प्रदर्शन समृद्धि और मांसपेशियों की गतिविधियों के तुल्यकालन का विश्लेषण करती है. अंत में, toluidine नीले रंग धुंधला पर आधारित ऊतकीय पढ़ाई संख्या और प्रोफाइल की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी, हमें स्वरयंत्रज कार्यों का मूल्यांकन करने की अनुमति दी मेलिनकृत फाइबर की.

सब एक साथ, हम, संस्कृति, आईडीई अलग करने के लिए कैसे यहाँ का वर्णनओम और ओबी से ntify और प्रत्यारोपण OECs RLN धारा सम्मिलन और कैसे axonal regrowth और laryngeal कार्यों पर इन प्रतिरोपित कोशिकाओं की दक्षता का मूल्यांकन और विश्लेषण करने के बाद.

Introduction

घ्राण म्यूकोसा (ओम) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में परिधीय तंत्रिका तंत्र और घ्राण बल्ब (ओ) में, प्राथमिक घ्राण प्रणाली दो अलग भागों से बना है. प्राथमिक घ्राण प्रणाली स्तनपायी प्रजातियों में जीवन भर स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए प्राथमिक घ्राण न्यूरॉन्स (PON) की क्षमता की विशेषता है. इस क्षमता के कारण ओम में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति को संभव बनाया है. ओम से ओबी को PON विकास और regrowth घ्राण ensheathing कोशिकाओं बुलाया विशेष glial कोशिकाओं (OECs) से मदद की है. OECs 1 ओबी को ओम से PON की neurogenesis के लिए एक अनुकूल microenvironment बना जो तंत्रिका शिखा कोशिकाओं रहे हैं. इस प्रकार, OECs कोशिकाओं 2,3 के विभिन्न subpopulations गठन ओम में और ओबी में पाया जा सकता है. OECs के विभिन्न गुणों कई तंत्रिका तंत्र घाव लद 4 में सेलुलर प्रत्यारोपण के लिए उन्हें इस्तेमाल करने के लिए नेतृत्व वैज्ञानिकों है. दरअसल, OECs उत्पादन वृद्धि कारकों, जनसंपर्क, glial डरा कमomote axonal regrowth, और स्वतंत्र रूप से astrocytes 5,6 साथ मिलाना कर सकते हैं. हालांकि, इन अध्ययनों के विशाल बहुमत के लिए रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के आधार पर कर रहे हैं, उनमें से कुछ परिधीय तंत्रिका चोट (PNI) 7,8 के बाद OECs का इस्तेमाल किया है.

परिधीय तंत्रिका तंत्र तंत्रिका चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए एक महान क्षमता है हालांकि, पूरा वर्गों न्यायपालिका axonal regrowth प्रेरित. दरअसल, (RLN) चेहरे या आवर्तक laryngeal नसों की पूरी लेनदेनों के बाद misrouted axons synkinesis बुलाया पेशी cocontractions कारण. इसलिए यह axonal regrowth यों के लिए ही नहीं बल्कि मांसपेशियों में संकुचन की दक्षता का मूल्यांकन करने के PNI के एक मॉडल का प्रस्ताव करने के लिए प्राथमिक महत्व का है. साहित्य में वर्णित सबसे आम मॉडल चेहरे तंत्रिका घाव 9,10 पर आधारित है. इस मॉडल में, कार्यात्मक मूल्यांकन गलमुच्छा आंदोलनों 10 की वसूली पर आधारित हैं. हालांकि यह mov की दक्षता प्रदर्शित करने के लिए जटिल हैements और मांसपेशियों cocontractions घटना भेदभाव करने के लिए. हम यहाँ एक RLN घाव पर आधारित एक मॉडल का प्रस्ताव. इस मॉडल axonal regrowth और मुखर रस्सियों के आंदोलनों लेकिन यह भी सेलुलर प्रत्यारोपण 11,12 के बाद इन आंदोलनों की दक्षता और कार्यक्षमता न केवल के मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल एक RLN अनुभाग / सम्मिलन मॉडल में ओम और ओबी से संस्कृति और प्रत्यारोपण OECs कदम प्रक्रिया द्वारा एक कदम प्रदान करता है और शल्य चिकित्सा के बाद पशुओं का मूल्यांकन करने के लिए.

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Protocol

1. घ्राण mucosa और घ्राण बल्ब की प्राथमिक संस्कृतियों

  1. विच्छेदन के लिए पहले
    1. की 44 मिलीलीटर जोड़कर, 50 मिलीलीटर के लिए, मध्यम बनाओ कैल्शियम मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल / भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 5 एमएल और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1 मिलीलीटर के साथ पूरक हाम F12 मध्यम (DMEM/F12),.
    2. कोट 75 सेमी पाली एल lysine (50 माइक्रोग्राम / एमएल, 1.5 ग्राम / 2 सेमी), कमरे के तापमान पर 1 घंटे के साथ 2 बोतल.
    3. पीबीएस 1x साथ बोतल कुल्ला.
    4. 1 सप्ताह के लिए फ्रिज में लेपित बोतल स्टोर.
  2. विच्छेदन
    1. इच्छामृत्यु के किसी भी विधि संस्थान के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पहले से अनुमोदित और योग्य कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए.
    2. ऐसे फिशर चूहों के रूप में जन्मजात चूहों चुनें.
    3. चूहा सोडियम pentobarbital या ऐसे ketamine / xylazine के रूप में संज्ञाहरण के अन्य इंजेक्शन रूपों के साथ गहरे संज्ञाहरण दर्ज किया है की पुष्टि की गई है, उसे और आर सिर काटनात्वचा emove.
    4. पूर्वकाल से पीछे भाग खोपड़ी खोलें.
    5. तानिका से बचने के लिए ओबी ख्याल रखने के लिए निकालें.
    6. एक ही चूहे में, नाक गुहा sagittaly खुला.
    7. ओम सांस mucosa से बचने के ख्याल रखने के लिए निकालें. ओम उपकला आसानी से अपने पीले रंग से पहचाना जा सकता है ध्यान दें.
    8. ओम के विच्छेदन के बारे में अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल पिछले एक में मिल जा सकता है जे विस. ऍक्स्प . प्रकाशन 13.
  3. संस्कृति
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 0.1% trypsin युक्त हांक बफर नमक समाधान (HBSS) में ओब रखें
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 0.05% collagenase युक्त HBSS में ओम रखें
    3. गर्म मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो.
    4. मध्यम के साथ कोशिकाओं को धो लें और 3 मिनट के लिए 300 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र.
    5. 2 के महीन चुर्ण बनाना नमूनेएक समरूप सेल निलंबन प्राप्त किया जाता है जब तक एक P1000 विंदुक का उपयोग मध्यम मिलीलीटर.
    6. गर्म माध्यम के 25 एमएल के साथ प्रीकोटेड बोतल (5-10 x 10 6 कोशिकाओं / फ्लास्क) में कोशिकाओं थाली.
    7. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते और संस्कृति.
    8. हर 2 दिन मध्यम के आधे बदलें.
    9. इन विट्रो में 6-8 दिनों के बाद, छोटे सेल के नमूने पर P75 सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात की जांच cytometry, या immunocytochemistry द्वारा प्रवाह द्वारा कृन्तकों में OECs मान लिया. इन विश्लेषण के लिए, अन्य मार्करों ऐसे GFAP और S100β के रूप में अध्ययन किया जा सकता है.
  4. प्रवाह cytometry विश्लेषण
    1. "सेलुलर प्रत्यारोपण" (अनुभाग नीचे 2.2) में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को इकट्ठा.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के दौरान P75 प्राथमिक एंटीबॉडी (1:100) के साथ उन्हें सेते
    3. पीबीएस EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और 3 मिनट के लिए 300 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र.
    4. 15 के दौरान पीई संयुग्मित विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते(1:200) अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम.
    5. पीबीएस EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और 3 मिनट के लिए 300 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र.
    6. पीबीएस EDTA के 500 μl में कोशिकाओं Resuspend.
    7. प्रवाह cytometer साथ 10-30 x 10 3 कोशिकाओं का विश्लेषण.
  5. Immunocytochemistry विश्लेषण
    1. "संस्कृति" (अनुभाग नीचे 1.1.2) में वर्णित के रूप में 48 घंटे के लिए precoated 6 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं थाली.
    2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    3. आरटी पर 15 मिनट के लिए पीएफए ​​4% के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
    4. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    5. आरटी पर 15 मिनट के लिए पीबीएस / ट्राइटन X100 (0.1%) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
    6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी (1:200) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं: रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर P75, S100β और GFAP
    8. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    9. अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के दौरान माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
    10. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    11. आर पर Hoechst 10 मिनट के साथ कोशिकाओं को सेतेअंधेरे में टी.
    12. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    13. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं का विश्लेषण.
  6. GFP लेबलिंग कोशिकाओं
    1. पांच दिनों के प्रत्यारोपण से पहले, बढ़ाया GFP (20 संक्रमण की बहुलता) को शरण देने lentiviral वेक्टर के साथ रात भर ओबी और ओम संस्कृतियों को संक्रमित.
    2. छोटे नमूने "संस्कृति" (धारा 1.1) में पहले से वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा GFP सकारात्मक कोशिकाओं की दर पर प्रत्यारोपण की जांच करने से पहले.

2. सर्जरी और प्रत्यारोपण

  1. बारम्बार तंत्रिका सम्मिलन
    1. जानवरों के साथ सभी प्रयोगों संस्था के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पहले से अनुमोदित और योग्य कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए.
    2. पहले सर्जरी आटोक्लेव के लिए सभी उपकरणों और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं भर में बाँझपन बनाए रखें.
    3. Ketamine हाइड्रोक्लोराइड की intraperitoneal इंजेक्शन (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) और chlorpromazine हाइड्रोक्लोराइड (द्वारा चूहे चतनाशून्य0.625 मिलीग्राम / किग्रा). सर्जरी से पहले पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्तता का आकलन करें.
    4. पृष्ठीय decubitus में चूहे रखें.
    5. एक स्केलपेल के साथ एक 2 सेमी खड़ी मध्यम ग्रीवा त्वचीय चीरा प्रदर्शन करना.
    6. औसत दर्जे का सफेद लाइन निम्नलिखित infrahyoid मांसपेशियों की एक ऊर्ध्वाधर चीरा प्रदर्शन करना.
    7. Infrahyoid मांसपेशियों के बीच autostatic प्रत्याकर्षक का उपयोग करके गला बेनकाब.
    8. RLN बेनकाब.
    9. सूक्ष्म नियंत्रण के तहत, सातवें सांस की नली की अंगूठी के स्तर पर microscissors के साथ पूरी तरह से तंत्रिका कटौती.
    10. सूक्ष्म नियंत्रण में 11.0 सीवन के एक बिंदु का उपयोग सम्मिलन प्रदर्शन करना. यह सर्जरी गला की एक विशिष्ट मोटर वितंत्रीभवन की ओर जाता है.
  2. सेलुलर प्रत्यारोपण
    1. बस प्रत्यारोपण से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.05% trypsin EDTA का उपयोग व्यंजनों से कोशिकाओं को हटाने
    2. गर्म मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो.
    3. 3 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र.
      4. 6 से 10 एक्स 1.2-6 के बीच कोशिकाओं थे.
    4. कलम बांधने का काम पहले 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में DMEM/F12-Matrige एल के 01:02 मिक्स (इस प्रयोग में 30 और 60 μl) के साथ सेलुलर तैयारी करें और बर्फ पर जगह है. , Unspecific प्रभाव से बचने के Matrigel कम वृद्धि कारक का उपयोग करें.
    5. बस प्रत्यारोपण करने से पहले Matrigel मध्यम मिश्रण को गर्म करने के कुछ सेकंड के लिए अपने हाथ में ट्यूब पकड़.
    6. एक पिपेट का उपयोग सम्मिलन साइट पर मिश्रण को अपदस्थ और घायल तंत्रिका पर मिश्रण स्वयं assembles जब तक प्रतीक्षा करें.
    7. एक 4.0 सीवन के साथ मांसपेशियों और त्वचा को बंद करें.
    8. हाउस चूहों को व्यक्तिगत रूप से और 24 घंटे के लिए एक हीटिंग दीपक के नीचे रहते हैं.

3. मूल्यांकन

  1. Laryngoscopy
    1. Intraperit द्वारा चूहों anesthetizeketamine हाइड्रोक्लोराइड (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) और chlorpromazine हाइड्रोक्लोराइड (0.625 मिलीग्राम / किग्रा) के Oneal इंजेक्शन. पुष्टि चूहों पूर्व प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के लिए एक पैर के अंगूठे चुटकी के साथ anesthetized हैं.
    2. पृष्ठीय decubitus में चूहे रखें.
    3. गला का सबसे अच्छा दृश्य प्रदान करने के लिए समायोजित एक 30 डिग्री videolaryngoscope डालें. प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए एक ही दृश्य को पुन: पेश करने के लिए शारीरिक स्थलों का निर्धारण करते हैं.
    4. Videolaryngoscope (5-10 दृश्यों / पशु) का उपयोग करते हुए मुखर गर्भनाल आंदोलनों रिकॉर्ड. प्रत्येक जानवर के लिए लगातार अधिक से अधिक प्रस्तुतीकरण और अधिक से अधिक अपहरण के तीन दृश्यों का चयन करें.
    5. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग स्वरयंत्रज समारोह का विश्लेषण करें. अधिक से अधिक अपहरण और मुखर तार की अधिकतम प्रस्तुतीकरण के आंदोलन के बीच अंतर को मापने के द्वारा पूर्ण कोणीय आंदोलन का निर्धारण करते हैं. आंदोलन आयाम को मापने के द्वारा गतिशील स्कोर निर्धारित करते हैं. Synkinesis और paradoxal आंदोलनों को मापने के द्वारा कार्यात्मक स्कोर निर्धारित करते हैं.
  2. (EMG) Electromyography
    1. "बारम्बार तंत्रिका सम्मिलन" (धारा 2.1) में पहले से वर्णित के रूप में त्वचा और मांसपेशियों को खोलने से गला और ट्रेकिआ बेनकाब.
    2. मुद्रिकावटुउपास्थिज उपास्थि बेनकाब.
    3. Microscissors का उपयोग पीछे मुद्रिकादर्विकी (पीसीए) मांसपेशी को बेनकाब करने के लिए मुद्रिकावटुउपास्थिज उपास्थि खोलें.
    4. पीसीए मांसपेशी में एक monopolar सुई इलेक्ट्रोड (38 x 0.45 मिमी) लागू.
    5. सहज वेंटिलेशन के दौरान एक अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग पीसीए मांसपेशियों की विद्युत पेशी गतिविधि रिकार्ड.
    6. श्वसन के साथ समृद्धि और तुल्यकालन के मामले में पेशी गतिविधि का विश्लेषण. अमीर गतिविधि के साथ अनुरेखण तुकांतवाला: बढ़ती श्वसन साथ अनुरेखण तुकांतवाला, लेकिन गरीब ट्रेसिंग (Neurogen), 2: प्रेरणा, 1 के दौरान unrhymed ट्रेसिंग, वृद्धि के बिना: 0: EMGS का विश्लेषण करने के लिए, निम्नलिखित पैमाने का उपयोग 0-3 गुणात्मक स्कोर आवंटित 3: एक मैं गठन, बहुत अमीर अनुरेखण तुकांतवालाएक अधिक से अधिक जानबूझकर गतिविधि के लिए इसी तरह nterference पैटर्न,.
    7. विलंबता और संभावित अवधि को मापने के लिए वेगस तंत्रिका बेनकाब. RLN कारण अपने छोटे आकार को उत्तेजना के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है क्योंकि वेगस तंत्रिका उत्तेजना के स्थल के रूप में चुना है.
    8. एक इलेक्ट्रोड के साथ वेगस तंत्रिका को उत्तेजित.
    9. पीसीए मांसपेशी में विद्युत संकेतों रिकॉर्ड. विलंबता और संभावित अवधि उपाय. यदि संभव हो तो ऐसी Powerlab प्रणाली के रूप में पेशी गतिविधि, विलंबता और संभावित अवधि रिकॉर्ड करने के लिए एक अधिग्रहण मॉड्यूल का उपयोग करें.
  3. ऊतक विज्ञान
    1. Pentobarbital अधिक मात्रा का उपयोग पशु euthanize.
    2. सूक्ष्म नियंत्रण में RLN के बाहर का स्टंप निकालें. RLN के बाहर का हिस्सा सम्मिलन और गला के बीच भाग के रूप में परिभाषित किया गया है. यह 11.0 सीवन एक nonabsorbable सीवन है क्योंकि कई हफ्तों सर्जरी के बाद सम्मिलन साइट खोजने के लिए संभव है कि ध्यान दें.
    3. 0.1 एम फॉस्फेट के साथ 2% glutaraldehyde में RLN के बाहर का भाग प्लेस4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए (= 7.3 पीएच)
    4. ध्यान से राज्याभिषेक वर्गों का एहसास करने के लिए नमूने पूरबी.
    5. फॉस्फेट बफर में नमूने धो लें.
    6. 1% cacodylate में कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए छोटे खंडों (3-4 मिमी लंबाई) और पोस्टफिक्स में कट Oso 4 और इथेनॉल के साथ निर्जलित बफर.
    7. ओरिएंट सिलिकॉन नए नए साँचे में नमूने और, POLYBED 812, DDSA और MNA में मिलकर रेजिन में एम्बेडेड त्वरक BDMA के 2% जोड़ा गया था जो.
    8. एक Pyramitome Ultramicrotomy प्रणाली का उपयोग करते हुए अर्द्ध पतली अनुप्रस्थ वर्गों (1μm मोटी) बनाते हैं.
    9. 70 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए 1% सोडियम tetraborate में 0.1% Toluidine ब्लू के साथ दाग
    10. एक गिनती विश्लेषण प्रणाली के साथ RLN नमूनों का विश्लेषण करें. फाइबर की संख्या की गणना और माइलिन आवरण की बाहरी और भीतरी सीमा निर्धारित करने से myelinated तंत्रिका फाइबर प्रोफाइल उपाय.
  4. प्रतिरोपण
    1. प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं को तैयार है और के रूप में पहले वर्णित कोशिकाओं का प्रत्यारोपण"सेलुलर प्रत्यारोपण" में (धारा 2.2).
    2. विश्लेषण
    3. Pentobarbital अधिक मात्रा का उपयोग पशु euthanize. जानवरों की कि निर्धारण पीएफए ​​की intracardiac इंजेक्शन 4% का उपयोग किया जा सकता है.
    4. RLN के लगभग 2 सेमी निकालें. समीपस्थ और RLN के बाहर का भागों का प्रयोग करें.
    5. तरल नाइट्रोजन में RLN नमूना ठीक करें.
    6. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने
    7. कट नमूने अनुलंबीय cryostat (10-20 माइक्रोन मोटी) का उपयोग कर.
    8. GFP सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे के नमूनों का विश्लेषण करें. विरोधी GFP एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बढ़ाने के लिए और costainings प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान दें.

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Representative Results

नियंत्रण और (अनुभाग / anastomosed) जानवरों reinnervated साथ रेखांकन परिणाम (ओम, ओबी या ओम + ओ) का प्रदर्शन सेलुलर प्रत्यारोपण के आधार पर भिन्न हो सकते हैं के रूप में चुना गया है.

सेल संस्कृति
कोशिकाओं प्लास्टिक सतह के लिए तेजी से पालन और लम्बी या गावदुम, त्रिकोणीय, बहुध्रुवीय, या धुरी के आकार हैं कि कोशिकाओं के समानांतर swaths में अलग हो गया (आंकड़े 1 ए और 1 बी). Cytometry विश्लेषण विट्रो प्रवाह में 8 दिनों के बाद P75 सकारात्मक कोशिकाओं की दर, प्राथमिक ओबी में 71%, और प्राथमिक ओम संस्कृतियों में 13% (आंकड़े 1 सी और 1 डी) से पता चलता है.

सेलुलर प्रत्यारोपण और सर्जरी
कोशिकाओं anastomosed RLN पर एक Matrigel मध्यम मिश्रण में प्रतिरोपित कर रहे हैं. RLN के सम्मिलन 11.0 सीवन के एक बिंदु (चित्रा 2) द्वारा किया जाता है.

मूल्यांकन
Videolaryngoscopy दो महीने प्रत्यारोपण के बाद, स्वरयंत्रज कार्यों videolaryngoscopy और विद्युतपेशीलेखन द्वारा विश्लेषण किया गया. महसूस करने के लिए videolaryngoscopy संरचनात्मक स्थलों अपहरण और प्रस्तुतीकरण के बीच अंतर (चित्रा 3) को मापने के लिए चुने गए हैं.

विद्युतपेशीलेखन
इन को पूरा करने के लिए EMG पढ़ाई पीसीए मांसपेशियों में प्रत्यारोपित monopolar सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया विश्लेषण करती है. सामान्य और reinnervated (अनुभाग / anastomosed) जानवरों के लिए विशिष्ट निशान चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं.

ऊतकीय विश्लेषण
इन जानवरों के लिए, RLN के histological विश्लेषण toluidine नीले धुंधला द्वारा प्रदर्शन किया गया. सामान्य और reinnervated (अनुभाग / anastomosed) जानवरों के लिए ठेठ फाइबर प्रोफाइल आंकड़े 5 ए और 5 ब में प्रस्तुत कर रहे हैं. इन ऊतकीय विश्लेषण पूरा करने के लिए, GFP सकारात्मक कोशिकाओं की ट्रैकिंग प्रदर्शन किया गया था. चित्रा 5C टी दिखाता है इंट्रा तंत्रिका प्रत्यारोपण के बाद sciatic तंत्रिका में GFP सकारात्मक कोशिकाओं का वह उपस्थिति. RLN आकार इंट्रा तंत्रिका प्रत्यारोपण की अनुमति नहीं है के रूप में Sciatic तंत्रिका नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया है.

चित्रा 1
ओबी और ओम में चित्रा 1. Morphological गुण और इन विट्रो में ओबी (ए और सी) और ओम (बी और डी) की प्राथमिक संस्कृतियों में P75 अभिव्यक्ति. (ए और बी) OECs प्राथमिक संस्कृतियों, लम्बी त्रिकोणीय, या धुरी के आकार morphologies व्यक्त . (सी और डी) ओबी और ओम प्राथमिक संस्कृतियों में P75 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था. संख्या कुल जनसंख्या और संकेत दिया gated क्षेत्रों में मौजूद कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है. कृपया / 50590fig1highres.jpg "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. RLN का सम्मिलन का चित्र 11.0 सीवन के साथ प्रदर्शन किया. (ए) sectioned RLN सर्जरी से पहले. समीपस्थ और RLN के बाहर का स्टंप के बीच (बी) के सम्मिलन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 3. चूहा उपजिह्वा योजना की विशिष्ट इंडोस्कोपिक देखा गया. मूल्यांकन के दौरान, स्थलों प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए देखने का एक ही क्षेत्र के क्रम में निर्धारित कर रहे हैं. प्रस्तुत दृश्य से अधिक से अधिक अपहरण (ए) और अधिक से अधिक हवाला देन (बी) के दोनों मापा जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. पीसीए मांसपेशी में श्वसन के दौरान प्राप्त EMG निशान के उदाहरण हैं. (ए) नियंत्रण समूह के पशु प्रेरणा के दौरान वृद्धि के साथ, एक अमीर बिजली पेशी गतिविधि प्रस्तुत किया. ( यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. Histological नर्वस पढ़ाई. (ए और बी) नियंत्रण समूह से RLN का राज्याभिषेक वर्गों का उदाहरण है. इस विश्लेषण नियंत्रण समूह मेलिनकृत फाइबर के एक उच्च संख्या प्रस्तुत दिखाया. (ए) आवर्धन 3,960 एक्स और (बी) बढ़ाई 11,900 एक्स ओ लेबल (सी) GFP-OECs कुचल चूहा sciatic तंत्रिका में घाव स्थल पर बने रहे. बढ़ाई 100X.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत तकनीक OECs परिधीय तंत्रिका चोट मॉडल में सेलुलर प्रत्यारोपण अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाते हैं. सेल संस्कृति प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और आसानी से किया जा सकता है. दूसरी ओर, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, RLN की विशेष अनुभाग / सम्मिलन में, अनुभव की आवश्यकता होती है और योग्य कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं संभव सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए पर ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों पर प्रकाश डाला. सबसे पहले, ओम की हदबंदी के दौरान, हम केवल घ्राण और सांस नहीं उपकला प्राप्त करने के लिए सावधान विच्छेदन की सलाह देते हैं. दूसरा, RLN के सम्मिलन के लिए, हम एक 11.0 सीवन के साथ केवल एक ही बिंदु प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं. तीसरा, मूल्यांकन के दौरान यह सभी जानवरों के बीच संज्ञाहरण के ही गहराई होना बहुत जरूरी है. विशेष रूप से, गहरी संज्ञाहरण videolaryngoscopy दौरान मुखर रस्सियों के आंदोलन के आयाम को कम करता है. हम आर की सिफारिशजानवरों की श्वासावरोध से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके कंठदर्शी emoving. EMG रिकॉर्डिंग के दौरान, कारण पीसीए मांसपेशियों के आकार से हम ध्यान से monopolar सुई इलेक्ट्रोड रखने की सलाह देते हैं. अंत में, ऊतकीय पढ़ाई के लिए इसे ध्यान से राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए RLN नमूने उन्मुख करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह Wallerian अध: पतन तब होता है जिसमें RLN के बाहर का हिस्सा हटाने के लिए और विश्लेषण करने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से ओबी और ओम से OECs का शुद्ध संस्कृतियों उत्पन्न करने के क्रम में संशोधित किया जा सकता है. ओबी से OECs की शुद्धि के लिए हम नैश 14 से वर्णित तकनीक की सलाह देते हैं और ओम से OECs की शुद्धि के लिए हम Bianco 15 से वर्णित विधि सलाह देते हैं. इन दो विशिष्ट शुद्धि तरीकों अत्यधिक OECs (90%) की संस्कृतियों शुद्ध होता है करने के लिए और पहले से अच्छी तरह से उनके लेखकों 14,15 से वर्णित किया गया है की अनुमति. एक अन्य संभावित संशोधन प्रत्यारोपण प्रक्रिया है wherई कोशिकाओं sciatic तंत्रिका 7 के लिए पहले से वर्णित के रूप में एक परिधीय तंत्रिका में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है. इस मामले में कोशिकाओं Matrigel बिना इंजेक्शन जा सकता है. यह कारण है कि यह सीधे इस तंत्रिका में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए संभव नहीं है RLN के आकार की है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. अंत में एक अन्य संभावित संशोधन EMG प्रोटोकॉल का अनुकूलन है. दरअसल, पीसीए और डायाफ्राम मांसपेशियों की मांसपेशियों गतिविधि रिकॉर्डिंग laryngeal और सांस की मांसपेशियों के बीच तुल्यकालन की आवश्यकता को समाप्त, एक साथ किया जा सकता है.

मौजूदा प्रोटोकॉल अन्य तंत्रिका घाव लद में लागू किया जा सकता है. हम पहले से ही इस तरह के नितंबीय और वेगस नसों के रूप में PNI के कई मॉडल में OECs प्रत्यारोपित किया है, इन उपचारों आसानी से अन्य PNI में इस्तेमाल किया जा सकता 8,11,12,16 लद. OECs की ज्यादा दिलचस्प सेलुलर प्रत्यारोपण विशेष एससीआई में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है. स्वरयंत्र की माप के लिए यहाँ वर्णित विधिRLN अनुभाग / सम्मिलन के बाद समारोह भी अन्य सेलुलर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, स्वरयंत्रज मॉडल axonal regrowth और synkinesis घटना का मूल्यांकन करने के लिए बहुत शक्तिशाली हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि संपादन के लिए उनकी वित्तीय सहायता के लिए और डॉ. फैनी Barnabé-Heider को Adir (अधिवास Aux Insuffisants Respiratoires à सहयोगी) और Fondation डे ल Avenir स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Invitrogen E3521T
FBS Invitrogen E3387M
Penicilin/streptomycin Invitrogen 1152-8876
HBSS Invitrogen M3467Y
Trypsin-EDTA Invitrogen M3513P
Cacodylate Merck 1.03256.0100
DDSA Biovalley 00563-450
MNA Biovalley 00886-450
BDMA Biovalley 00141-100
Polybed 812 Biovalley 08791-500
PE anti-mouse  BD Bioscience 550589
Matrigel GFR BD Bioscience 356231
Collagenase A Roche 10103586001
Mouse anti P75 Chemicon MAB 365
11.0 Wire Ethicon FG 2881
Toluidine Blue  Ral Diagnostics 361590-0025
Centrifuge Sigma Sigma 2-16PK
Incubator  Thermo Scientific
Laminar flow hood Faster BH-EN 2003 S
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
Microscope Zeiss
Videolaryngoscope Karl Storz Endoskope Telecam SL NLSC 20212120
Acquisition system AD Instruments Powerlab system
Pyramitome Ultramicrotomy System  Leica Ultracut S
Image analysis system Explora Nova Mercator

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 84 घ्राण ensheathing कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी की चोट प्रत्यारोपण गला आवर्तक laryngeal तंत्रिका परिधीय तंत्रिका चोट मुखर रस्सियों
परिधीय तंत्रिका चोट के बाद कार्यात्मक वसूली का मूल्यांकन करने के लिए घ्राण ensheathing कोशिकाओं के प्रत्यारोपण
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Guerout, N., Paviot, A.,… More

Guerout, N., Paviot, A., Bon-Mardion, N., Honoré, A., OBongo, R., Duclos, C., Marie, J. P. Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury. J. Vis. Exp. (84), e50590, doi:10.3791/50590 (2014).

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