Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

Published: February 23, 2014 doi: 10.3791/50590
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1, 1,4, 1, 1,3
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

Summary

תאי ensheathing חוש ריח (OECs) הם תאי רכס עצביים המאפשרים צמיחה של תאי עצב ההרחה הראשוניים. נכס ספציפי זה יכול לשמש להשתלת תאים. אנו מציגים כאן מודל של השתלה סלולרית המבוסס על השימוש בOECs במודל פציעת עצב בגרון.

Abstract

תאי ensheathing חוש ריח (OECs) הם תאי רכס עצביים המאפשרים צמיחה וצמיחה מחודשת של תאי עצב ההרחה הראשוניים. ואכן, מערכת ההרחה העיקרית מאופיינת ביכולתה להצמיח נוירונים חדשים גם בבעלי חיים מבוגרים. יכולת מסוימת זה נובעת בחלקו את נוכחותו של OECs אשר ליצור microenvironment נוח לנוירוגנזה. מאפיין זה של OECs נוצל בעבר להשתלה סלולרית כגון במודלים של פגיעה בחוט השדרה. למרות שמערכת העצבים ההיקפית יש קיבולת גדולה יותר להתחדש לאחר פגיעה בעצב מאשר במערכת העצבים המרכזית, חלקים שלמים לגרום misrouting במהלך צמיחה מחודשת אקסון בפרט לאחר פנים של חיתוך רוחב עצב בגרון. באופן ספציפי, חתך מלא של העצב חוזר ונשנה בגרון (RLN) גורם לצמיחה מחודשת אקסון חריג וכתוצאה מכך synkinesis של מיתרי קול. בדגם הספציפי הזה, הראינו כי השתלת OECs יעילות מגבירה צמיחה מחודשת עצב.

ve_content "> OECs הם היוו של כמה אוכלוסיות בהווה בשתי רירית ההרחה (OM-OECs) ונורות חוש הריח (OB-OECs). אנו מציגים כאן מודל של השתלה סלולרית המבוסס על השימוש באוכלוסיות שונות אלה של OECs ב מודל פציעת RLN. שימוש בפרדיגמה זו, תרבויות עיקריות של OB-OECs וOM-OECs הושתלו בMatrigel אחרי סעיף והשקה של RLN. חודשיים לאחר הניתוח, הערכנו בעלי חיים מושתלים בניתוחים משלימים הבוסס על videolaryngoscopy, (EMG) , ומחקרים היסטולוגית. ראשית, videolaryngoscopy אפשר לנו להעריך פונקציות בגרון, במיוחד תופעות cocontractions שרירים. לאחר מכן, EMG מנתח עושר וסנכרון של פעילות שרירית הפגין. לבסוף, מחקרים היסטולוגית מבוססים על כתמי כחולי toluidine אפשרו כימות של המספר והפרופיל של סיבי myelinated.

בסך הכל, אנו מתארים כאן כיצד לבודד, התרבות, identify והשתלת OECs מOM וOB לאחר חתך השקה וכיצד להעריך ולנתח את היעילות של תאים מושתלים אלה על פונקציות לצמיחה מחודשת וגרון אקסון RLN.

Introduction

מערכת ההרחה העיקרית מורכבת משני חלקים נפרדים: רירית ההרחה (OM) במערכת עצבים היקפית ונורת חוש הריח (OB) במערכת העצבים המרכזית. מערכת ההרחה העיקרית מאופיינת בקיבולת של נוירונים העיקרי חוש הריח (PON) עצמי לחדש לאורך כל חיים במינים יונקים. יכולת זו מתאפשרת בשל נוכחותם של תאי גזע עצביים בOM. צמיחת PON וצמיחה המחודשת מOM לOB היא הקלו על ידי תאים מיוחדים הנקראים תאי גליה ensheathing חוש ריח (OECs). OECs הם תאי רכס עצביים שיוצרים microenvironment נוח לנוירוגנזה של PON מOM לOB 1. ובכך, ניתן למצוא בOECs OM ובOB מהווים אוכלוסיות שונות של תאי 2,3. יש מאפיינים השונים של OECs מדענים הראשיים להשתמש בם להשתלות סלולריות בכמה פרדיגמות נגע מערכת עצבים 4. ואכן, גורמי גדילת תוצרת OECs, להפחית מפחידים גליה, יחסי ציבורצמיחה מחודשת אקסון אומוטה, והוא יכול באופן חופשי להתערבב עם 5,6 האסטרוציטים. עם זאת, רובם המכריע של מחקרים אלה מבוססים על פגיעה בחוט השדרה (SCI); כמה מהם השתמשו OECs לאחר פגיעה היקפית עצב (PNI) 7,8.

למרות שמערכת העצבים ההיקפית יש לו יכולת מצוינת להתחדש לאחר פגיעה עצבית, חלקים שלמים לגרום לצמיחה מחודשת אקסון סוטה. ואכן, לאחר transections של פנים או עצבים בגרון החוזרים ונשנים (RLN) מלא אקסונים misrouted לגרום cocontractions שרירים הנקרא synkinesis. לכן זה הוא בעל חשיבות העיקרית להציע מודל של PNI לכמת לא רק לצמיחה מחודשת באקסון, אלא גם כדי להעריך את היעילות של התכווצויות שרירים. בספרות המודל הנפוץ ביותר המתואר מבוסס על 9,10 נגע עצב פנים. במודל זה, הערכות תפקודיות מבוססות על ההתאוששות של תנועות זיף 10. עם זאת, הוא מסובך כדי להדגים את היעילות של movements ולהיפלות תופעות cocontractions שרירים. אנו מציעים כאן מודל המבוסס על נגע RLN. מודל זה מאפשר ההערכה של לא רק לצמיחה מחודשת באקסון ותנועות של מיתרי קול, אלא גם את היעילות ואת הפונקציונליות של תנועות אלה לאחר השתלות סלולריות 11,12. פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הליך לתרבות וההשתלה OECs במודל סעיף RLN / השקה מOM וOB ולהעריך בעלי חיים לאחר ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבויות עיקריות של חוש הריח וחוש ריח רירית נורות

  1. לפני לנתיחה
    1. הפוך בינוני, ל50 מיליליטר, על ידי הוספת 44 מיליליטר של סידן ללא השתנה Dulbecco של נשר / הבינוני של בשר חזיר F12 (DMEM/F12), בתוספת 5 מיליליטר של סרום שור העוברי (FBS) ו 1 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין.
    2. מעיל 75 סנטימטר 2 צלוחיות עם פולי-L-ליזין (50 מיקרוגרם / מיליליטר, 1.5 מיקרוגרם / 2 סנטימטר), 1 שעות בטמפרטורת חדר.
    3. יש לשטוף את צלוחיות עם PBS 1X.
    4. אחסן את צלוחיות מצופים במקרר למשך שבוע עד 1.
  2. בתור
    1. כל שיטה של ​​המתת חסד חייבת להיות מאושרת מראש על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימושו של המוסד ובוצעה על ידי טכנאי מוסמך.
    2. בחר חולדות מולדות כגון חולדות פישר.
    3. אחרי העכברוש אושר לנכנס הרדמה עמוקה עם pentobarbital נתרן או צורות אחרות של זריקות הרדמה כגון קטמין / xylazine, לערוף אותו וrסר העור.
    4. פתח את הגולגולת מהקדמית לחלק האחורי.
    5. הסר את טיפול לקיחת OB, כדי למנוע את קרומי המוח.
    6. באותו החולדה, פתח sagittaly חלל האף.
    7. הסר את OM לטפל כדי למנוע את הרירית של דרך הנשימה. שים לב שהאפיתל OM יכול להיות מזוהה בקלות על ידי הצבע הצהבהב שלה.
    8. פרוטוקולים נוספים מפורטים על נתיחה של OM ניתן למצוא בקודם J. Vis. Exp. פרסום 13.
  3. תרבות
    1. הנח OB בפתרון של האנק שנאגרו מלח (HBSS) המכיל טריפסין 0.1% 45 דקות ב37 ° C.
    2. הנח OM בHBSS המכיל 0.05% collagenase 45 דקות ב37 ° C.
    3. תפסיק עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום חם.
    4. לשטוף את התאים עם מדיום וצנטריפוגות XG 300 3 דקות.
    5. דגימות Triturate של 2מיליליטר של מדיום באמצעות פיפטה P1000 עד השעיה תא הומוגנית מתקבלת.
    6. פלייט התאים בצלוחיות Precoated (5-10 x 10 6 תאים / בקבוק) עם 25 מיליליטר של מדיום חם.
    7. דגירה ותרבות התאים ב37 ° C עם 5% CO 2.
    8. שינוי מחצית בינונית כל 2 ימים.
    9. אחרי 6-8 ימים במבחנה, לבדוק את חלקם של p75 בתאים חיוביים על דגימות תאים קטנות, הניח להיות OECs במכרסמים, על ידי cytometry זרימה או על ידי immunocytochemistry. לניתוחים אלו, ניתן ללמוד סמנים אחרים כגון GFAP וS100β.
  4. ניתוח תזרים cytometry
    1. לאסוף את התאים כמתואר ב" השתלה סלולרית "(סעיף 2.2 בהמשך).
    2. דגירה אותם עם p75 נוגדן ראשוני (1:100) במהלך 15 דקות ב 4 ° C.
    3. לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של PBS-EDTA ו צנטריפוגות XG 300 3 דקות.
    4. דגירה התאים עם נוגדנים משני אנטי עכבר PE מצומדות במהלך 15דקות ב 4 ° C בחושך (1:200).
    5. לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של PBS-EDTA ו צנטריפוגות XG 300 3 דקות.
    6. Resuspend התאים 500 μl של PBS-EDTA.
    7. לנתח 10-30 x 10 3 תאים עם זרימת cytometer.
  5. ניתוח Immunocytochemistry
    1. פלייט התאים ב6 צלחות היטב precoated ל48 שעות כפי שתואר ב" תרבות "(סעיף 1.1.2 להלן).
    2. לשטוף את התאים עם PBS.
    3. תקן את התאים עם PFA 4% ל15 דקות ב RT.
    4. לשטוף את התאים עם PBS.
    5. דגירה התאים עם PBS / טריטון X100 (0.1%) ל15 דקות ב RT.
    6. לשטוף את התאים עם PBS.
    7. דגירה התאים עם נוגדנים ראשוניים (1:200): p75, S100β וGFAP הלילה בשעה 4 ° C.
    8. לשטוף את התאים עם PBS.
    9. דגירה התאים עם הנוגדנים משני (1:500) בשעה 1 ב RT בחושך.
    10. לשטוף את התאים עם PBS.
    11. דגירה התאים עם Hoechst 10 דקות ב RT בחושך.
    12. לשטוף את התאים עם PBS.
    13. נתח את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  6. תאי תיוג GFP
    1. חמישה ימים לפני ההשתלה, להדביק תרבויות OB וOM לילה עם וקטור lentiviral מחסה GFP המשופר (ריבוי של זיהום: 20).
    2. לפני צ'ק השתלה על מדגמים קטנים השיעור של תאי GFP חיוביים על ידי זרימת cytometry כפי שתואר לעיל ב" תרבות "(סעיף 1.1).

2. כירורגיה והשתלות

  1. השקה עצב חוזרת
    1. כל הניסויים עם בעלי חיים חייבים להיות מאושרים מראש על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימושו של המוסד ובוצעו על ידי טכנאי מוסמך.
    2. לפני החיטוי ניתוח כל המכשירים ולשמור על סטריליות בכל הניתוחים.
    3. הרדימי עכברוש בזריקת intraperitoneal של קטמין הידרוכלוריד (12.5 מ"ג / קילוגרם) וhydrochloride chlorpromazine (0.625 מ"ג / קילוגרם). להעריך את הלימות של הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן לפני הניתוח.
    4. מניחים את החולדה בפחסה הגבי.
    5. בצע חתך 2 סנטימטר אנכי בינוני צוואר הרחם עורית עם אזמל.
    6. בצע חתך אנכי של שרירי infrahyoid הבאים הקו הלבן המדיאלי.
    7. לחשוף את הגרון באמצעות מפשק autostatic בין שרירי infrahyoid.
    8. לחשוף את RLN.
    9. תחת שליטה מיקרוסקופית, חתך את העצב באופן מלא עם microscissors ברמה של טבעת קנה הנשימה השביעית.
    10. מבצע השקה באמצעות נקודה אחת של 11.0 תפר תחת שליטה מיקרוסקופית. ניתוח זה מוביל לdenervation מנוע ספציפית של הגרון.
  2. השתלה סלולרית
    1. רגע לפני ההשתלה, להסיר את התאים מהמנות באמצעות 0.05% EDTA טריפסין למשך 5 דקות על 37 ° C.
    2. תפסיק עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום חם.
    3. צנטריפוגה XG 300 3 דקות.
      4. 6 תאים ב30 μl של DMEM/F12.
    4. לעשות הכנה סלולרית עם 1:02 תמהיל (30 ו60 μl בניסוי זה) של ליטר DMEM/F12-Matrige ב1.5 צינור מיליליטר לפני השתלה ולמקם אותו על קרח. כדי למנוע תופעות לא ספציפיות, השתמש בגורם גדילה המופחת Matrigel.
    5. רק לפני ההשתלה להחזיק את הצינור ביד שלך לכמה שניות כדי לחמם את תערובת Matrigel בינונית.
    6. להדיח את התמהיל באתר ההשקה באמצעות פיפטה ולחכות עד עצמי מרכיב התערובת על העצב נפגע.
    7. סגור את השרירים ועור עם תפר 4.0.
    8. בית החולדות בנפרד ולשמור תחת מנורת חימום ל24 שעות.

3. הערכה

  1. Laryngoscopy
    1. הרדימי חולדות על ידי intraperitהזרקת אוניל של קטמין הידרוכלוריד (12.5 מ"ג / קילוגרם) וhydrochloride chlorpromazine (0.625 מ"ג / קילוגרם). חולדות אשר מורדמים עם קמצוץ הבוהן לפני שתמשיך עם פרוטוקול.
    2. מניחים את החולדה בפחסה הגבי.
    3. הכנס 30 ° videolaryngoscope מותאמים למספק את התצוגה הטובה ביותר של הגרון. לקבוע ציוני דרך אנטומיים לשחזר את אותה תצוגה עבור כל הקלטה.
    4. הקלט את תנועות מייתרי קול באמצעות videolaryngoscope (5-10 רצפים / בעלי החיים). לכל חיה לבחור שלושה רצפים של הסתמכות מקסימלי רצופה וחטיפה מקסימלי.
    5. לנתח פונקצית גרון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. לקבוע תנועה זוויתית מוחלטת על ידי מדידת ההבדל בין התנועה של חטיפה מקסימלי והסתמכות מקסימלי של מיתרי קול. לקבוע ציון דינמי על ידי מדידת משרעת התנועה. לקבוע ציון תפקודי על ידי מדידת synkinesis ותנועות paradoxal.
  2. (EMG)
    1. לחשוף את הגרון ואת קנה הנשימה על ידי פתיחת עור ובשרירים כפי שתואר לעיל ב" השקה חוזרת עצבים "(סעיף 2.1).
    2. לחשוף את סחוס cricothyroid.
    3. פתח את סחוס cricothyroid לחשוף cricoarytenoid האחורי שריר (PCA) באמצעות microscissors.
    4. להציג את האלקטרודה monopolar מחט (38 x 0.45 מ"מ) בשריר PCA.
    5. להקליט את הפעילות השרירית החשמלית של השרירים PCA באמצעות מערכת רכישה במהלך אוורור ספונטני.
    6. נתח את הפעילות השרירית במונחים של עושר וסנכרון עם הנשימה. כדי לנתח EMGs, להקצות ציון איכותי 0-3 באמצעות הסולם הבא: 0: מעקב לא מחורזות, ללא עלייה בהשראה, 1: בחרוזים התחקות עם שאיפה גוברת, אך התחקות עלובה (אב עצבים), 2: בחרוזים התחקות עם פעילות עשירה יותר, 3: בחרוזים מעקב, עשיר מאוד, המהווה iדפוס nterference, בדומה לפעילות מכוונת מקסימלי.
    7. לחשוף את העצב התועה למדידת משך השהיה ופוטנציאלי. העצב התועה נבחר כאתר של גירוי בגלל RLN יכול להינזק במהלך הגירוי בשל גודלו הקטן.
    8. לגרות את העצב התועה עם אלקטרודה.
    9. להקליט אותות חשמליים בשריר PCA. למדוד Latency ומשך פוטנציאלי. אם אפשר להשתמש במודול רכישה להקליט פעילות שרירית, מיסות ומשך פוטנציאל כגון מערכת Powerlab.
  3. היסטולוגיה
    1. להרדים את בעלי החיים באמצעות מנת יתר pentobarbital.
    2. הסר את הגדם הדיסטלי של RLN תחת שליטה מיקרוסקופית. החלק הדיסטלי של RLN מוגדר כחלק בין ההשקה וגרון. שים לב כי ניתן למצוא באתר ההשקה מספר שבועות לאחר הניתוח, כי התפר 11.0 הוא תפר nonabsorbable.
    3. הנח את החלק הדיסטלי של RLN בglutaraldehyde 2% עם פוספט 0.1 M(PH = 7.3) עבור 2 שעות ב 4 ° C.
    4. לכוון בזהירות את הדגימות לממש סעיפי העטרה.
    5. לשטוף דגימות במאגר פוספט.
    6. לחתוך במקטעים קטנים יותר (אורך מ"מ 3-4) וpostfix ל60 דקות בטמפרטורת החדר בcacodylate 1% שנאגרו 4 oso ומיובש עם אתנול.
    7. דוגמאות אוריינט בתבניות סיליקון ומשובץ ברפים מורכב ב812 POLYBED, DDSA וMNA, שאליה התווסף 2% מהמאיץ BDMA.
    8. הפוך סעיפי חצי דקים רוחביים (1μm העובי) באמצעות מערכת Ultramicrotomy Pyramitome.
    9. כתם עם 0.1% כחולים Toluidine ב1% tetraborate נתרן ל75 שניות ב70 ° C.
    10. ניתוח דגימות RLN עם מערכת ניתוח ספירה. לספור את מספר הסיבים ולמדוד פרופילי סיבי עצב myelinated על ידי קביעת הגבול החיצוני ופנימי של מעטפת המיאלין.
  4. השתלה
    1. הכן את התאים להשתלה והשתלת התאים כפי שתוארו לעילב" השתלה סלולרית "(סעיף 2.2).
    2. אנליזה
    3. להרדים את בעלי החיים באמצעות מנת יתר pentobarbital. שים לב שהקיבעון של בעלי החיים יכול להתבצע באמצעות הזרקת intracardiac של PFA 4%.
    4. הסר סביב 2 סנטימטר של RLN. השתמש הפרוקסימלית וחלקים מרוחקים של RLN.
    5. תקן מדגם RLN בחנקן נוזלי.
    6. דגימות חנות ב -80 ° C.
    7. דגימות Cut longitudinally באמצעות cryostat (10-20 מיקרומטר עבה).
    8. ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות תאי GFP חיוביים. שים לב שהנוגדן אנטי-GFP ניתן להשתמש כדי להגדיל את פליטת הקרינה ולבצע costainings.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איורים עם שליטה וreinnervated (סעיף / anastomosed) בעלי חיים שנבחרו כתוצאות יכולות להשתנות בהתאם להשתלות הסלולריות שבוצעו (OM, OB או OM + OB).

תרבית תאים
התאים לדבוק במהירות למשטח הפלסטיק והפכו הפרדה לנתחים מקבילים של תאים הנמצאים מוארכים או מתחדדים, משולשים, קוטביים, או ציר בצורה (1A ומספרים 1 ב '). אחרי 8 ימים במבחנת זרימת cytometry הניתוח מראה את שיעור התאים חיוביים p75, 71% בOB הראשוני, ו13% בתרבויות OM עיקריים (1C דמויות ו1D).

השתלה וניתוח נייד
התאים מושתלים בתמהיל Matrigel הבינוני על RLN anastomosed. השקה של RLN נעשית על ידי נקודה אחת של 11.0 תפר (איור 2).

הערכות
Videolaryngoscעתק כחודשיים לאחר ההשתלה, פונקציות גרון נותחו על ידי videolaryngoscopy ואלקטרומיוגרפיה. ציוני דרך אנטומיים videolaryngoscopy לממש נבחרו למדידת הבדל בין החטיפה ואדוקציה (איור 3).

אלקטרומיוגרפיה
כדי להשלים את אלה ניתוחי מחקרי EMG בוצעו באמצעות אלקטרודה מחט monopolar הושתלה בשרירי PCA. עקבות אופייניות ל( סעיף / anastomosed) בעלי חיים נורמלים וreinnervated מוצגות באיור 4.

ניתוחים היסטולוגית
לבעלי חיים אלו, ניתוחים היסטולוגית של RLN בוצעו על ידי מכתים הכחול toluidine. פרופילי סיבים אופייניים ל( סעיף / anastomosed) בעלי חיים נורמלים וreinnervated מוצגים ב5A דמויות ו5B. כדי להשלים ניתוחים היסטולוגית אלה, מעקב של תאי GFP חיוביים בוצע. איור 5 ג ממחיש t נוכחותו של תאי GFP חיוביים לתוך העצב השת לאחר השתלת הפנים עצבנית. עצב השת שמש כבקרה כגודל RLN אינו מאפשר השתלת הפנים עצבנית.

איור 1
איור 1. מאפיינים מורפולוגיים וביטוי P75 בתרבויות העיקריות של OB (A ו-C) ואום (B ו-D) במבחנה. (A ו-B) OECs בOB וOM תרבויות עיקריות הביעו מורפולוגיות מוארכות, משולשות, או ציר בצורה . (C ו-D) ביטוי פני תא של p75 בתרבויות עיקריות OB וOM נקבע על ידי cytometry זרימה. מספרים מציינים את כלל האוכלוסייה ואחוז התאים המצויים באזורים שצוינו מגודרות. אנא / 50590fig1highres.jpg "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תמונה של השקה של RLN הופיעה עם 11.0 תפר. () RLN לפני מחולק ניתוח. השקה (ב ') בין הפרוקסימלית והגדם הדיסטלי של RLN. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" / files/ftp_upload/50590/50590fig3.jpg "/>
איור 3. צפיות אנדוסקופית טיפוסיות של תכנית בית קול חולדה. במהלך הערכות, ציוני דרך נקבעות על מנת לקבל את אותו שדה ראייה לכל הקלטה. מהתצוגה מוצגת גם החטיפה המקסימלי () וההסתמכות המקסימלי (ב ') נמדדות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. דוגמאות של עקבות EMG שהושגו במהלך הנשימה בשריר PCA. () בעלי חיים מקבוצת הביקורת הוצגו פעילות שרירית חשמל עשיר, עם עלייה בהשראה. ( לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. מחקרי עצבים היסטולוגית. (A ו-B) דוגמא לסעיפי העטרה של RLN מקבוצת ביקורת. ניתוח זה הראה כי בקבוצת הביקורת הציגה מספר גבוה יותר של סיבי myelinated. () X 3,960 הגדלה וגדלה (B) 11,900 X. GFP (C) שכותרתו OB-OECs נשאר באתר הנגע לתוך העצב השת של החולדה כתושות. ההגדלה 100x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקות שהוצגו כאן להפוך OECs מודל שימושי ללמוד השתלות סלולריות במודלים של פגיעה העצבית היקפיים. פרוטוקול תרבית התאים הוא פשוט יחסית ויכול להתבצע בקלות. מצד השני, פעולות כירורגיות, בסעיף / השקה מסוימת של RLN, דורשות ניסיון וחייבת להתבצע על ידי טכנאי מוסמך.

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה להדגיש גורמים חשובים להתמקד על מנת לקבל את התוצאות הטובות ביותר אפשריות. ראשית, בניתוק של OM, אנו ממליצים לנתיחה זהירה כדי להשיג אפיתל הרחה ולא בדרכי הנשימה בלבד. שנית, להשקה של RLN, אנו ממליצים לביצוע רק נקודה אחת עם תפר 11.0. שלישית, במהלך הערכות שזה מאוד חשוב שיהיה באותו עומק ההרדמה בין כל בעלי החיים. בפרט, הרדמה עמוקה מפחיתה את המשרעת של תנועה של מיתרי הקול במהלך videolaryngoscopy. אנו ממליצים removing ראי הגרון בהקדם האפשרי כדי למנוע חנק של בעלי החיים. במהלך הקלטת EMG, בשל הגודל של שרירי PCA אנו ממליצים להניח בזהירות את האלקטרודה מחט monopolar. לבסוף, ללימודים היסטולוגית חשוב לכוון בזהירות את דגימות RLN להשיג חלקי העטרה. זה גם מאוד חשוב להסיר ולנתח את חלקו האחורי של RLN בי ניוון Wallerian מתרחש.

הפרוטוקולים שתוארו כאן ניתן לשנות בקלות על מנת ליצור תרבויות מטוהרת של OECs מOB וOM. לטיהור OECs מOB אנו ממליצים על הטכניקה שתוארה על ידי נאש 14 ולטיהור OECs מOM אנו ממליצים על השיטה שתוארה על ידי 15 ביאנקו. שתי שיטות טיהור ספציפיות אלה מאפשרים ליש מטוהרים מאוד תרבויות של OECs (90%) וכבר בעבר שתואר היטב על ידי כותביהם 14,15. עוד שינוי אפשרי הוא הליך השתלת wherדואר התאים יכולים להיות מוזרקים ישירות לתוך עצב היקפי כפי שתואר לעיל לעצב השת 7. במקרה זה ניתן להזריק התאים ללא Matrigel. חשוב לציין כי בשל גודלו של RLN לא ניתן להזריק תאים ישירות לתוך העצב הזה. לבסוף עוד שינוי אפשרי הוא אופטימיזציה של פרוטוקול EMG. ואכן, הקלטות פעילות שריריות של שרירי PCA והסרעפת יכולות להתבצע ביחד, ומבטלות את הצורך בסנכרון בין גרון ושרירי נשימה.

ניתן ליישם הפרוטוקולים הנוכחיים בפרדיגמות נגע עצבים אחרות. יש לנו כבר הושתלו OECs במספר דגמים של PNI כגון עצבי הירך ותועים, טיפולים אלה יכולים לשמש בקלות בPNI האחר פרדיגמות 8,11,12,16. השתלה מעניינת סלולרית יותר של OECs יכולה להתארך למחלות של מערכת עצבים מרכזיות בSCI מסוים. השיטה המתוארת כאן למדידה בגרוןגם פונקציה אחרי סעיף RLN / השקה יכולה לשמש לפרוטוקולי השתלות סלולריות אחרים. אכן, מודלים בגרון יכולים להיות חזקים מאוד כדי להעריך תופעות צמיחה מחודשת וsynkinesis אקסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר אדיר (עוזרו במגורים aux Insuffisants Respiratoires) וFondation de l'Avenir על תמיכה הכספית ולד"ר פאני Barnabé-היידר לעריכת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Invitrogen E3521T
FBS Invitrogen E3387M
Penicilin/streptomycin Invitrogen 1152-8876
HBSS Invitrogen M3467Y
Trypsin-EDTA Invitrogen M3513P
Cacodylate Merck 1.03256.0100
DDSA Biovalley 00563-450
MNA Biovalley 00886-450
BDMA Biovalley 00141-100
Polybed 812 Biovalley 08791-500
PE anti-mouse  BD Bioscience 550589
Matrigel GFR BD Bioscience 356231
Collagenase A Roche 10103586001
Mouse anti P75 Chemicon MAB 365
11.0 Wire Ethicon FG 2881
Toluidine Blue  Ral Diagnostics 361590-0025
Centrifuge Sigma Sigma 2-16PK
Incubator  Thermo Scientific
Laminar flow hood Faster BH-EN 2003 S
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
Microscope Zeiss
Videolaryngoscope Karl Storz Endoskope Telecam SL NLSC 20212120
Acquisition system AD Instruments Powerlab system
Pyramitome Ultramicrotomy System  Leica Ultracut S
Image analysis system Explora Nova Mercator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
  2. Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
  3. Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
  4. Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
  5. Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
  6. Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
  7. Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
  8. Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
  9. Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
  10. Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
  11. Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
  12. Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
  13. Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
  14. Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
  15. Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
  16. Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).

Tags

Neuroscience גיליון 84 תאי ensheathing חוש הריח פגיעה בחוט השדרה השתלה גרון עצב בגרון חוזר ונשנה פגיעה עצבית היקפית מיתרי קול
השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guerout, N., Paviot, A.,… More

Guerout, N., Paviot, A., Bon-Mardion, N., Honoré, A., OBongo, R., Duclos, C., Marie, J. P. Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury. J. Vis. Exp. (84), e50590, doi:10.3791/50590 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter