Summary
Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.
Abstract
Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei en de hergroei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Inderdaad, is de primaire olfactorische systeem gekenmerkt door het vermogen om aanleiding te geven tot nieuwe neuronen zelfs bij volwassen dieren. Deze bijzondere vermogen is deels te wijten aan de aanwezigheid van OECS die een gunstig micro-omgeving te creëren voor de neurogenese. Deze eigenschap van OECS is gebruikt voor cellulaire transplantatie zoals bij ruggenmergletsel modellen. Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grotere capaciteit om te regenereren na zenuwschade dan het centrale zenuwstelsel, compleet secties induceren misrouting tijdens axonale hergroei in het bijzonder na het gezicht van laryngeus doorsnijding. Specifiek, volledige opdeling van de recurrens (RMN) induceert afwijkende axonale hergroei resulteert in synkinesis van de stembanden. In dit specifieke model, hebben we aangetoond dat OECS transplantatie efficiënt verhoogt axonale hergroei.
ve_content "> OECS worden gevormd van verschillende subpopulaties aanwezig in zowel de olfactorische mucosa (OM-OECS) en reukbollen (OB-OECS). We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van deze verschillende subpopulaties OECS in een RLN letsel model. Met behulp van dit paradigma, primaire culturen van OB-OECS en OM-OECS werden getransplanteerd in Matrigel na sectie en anastomose van de RLN. Twee maanden na de operatie, we door aanvullende analyses geëvalueerd getransplanteerde dieren op basis van videolaryngoscopy, elektromyografie (EMG) en histologische studies. eerste videolaryngoscopy konden we larynx functies uitwerken, met name spier cocontractions verschijnselen. Vervolgens EMG analyses toonden rijkdom en synchronisatie van spieren activiteiten. Tenslotte histologische studies gebaseerd op toluidine blauw kleuring kon de kwantificering van het aantal en profiel gemyeliniseerde vezels.Alles bij elkaar, beschrijven we hier hoe te isoleren, cultuur, identify en transplantatie OECS van OM en OB na RLN sectie-anastomose en hoe te evalueren en analyseren van de efficiëntie van deze getransplanteerde cellen op axonale hergroei en laryngeale functies.
Introduction
Het primaire olfactorische systeem bestaat uit twee afzonderlijke delen, de olfactorische mucosa (OM) in perifere zenuwstelsel en de bulbus olfactorius (OB) in het centrale zenuwstelsel. Het primaire olfactorische systeem wordt gekenmerkt door het vermogen van de primaire olfactorische neuronen (PON) om te hernieuwen hele leven zoogdiersoorten. Dit vermogen wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van neurale stamcellen in de OM. PON groei en hergroei van OM tot OB wordt gefaciliteerd door gespecialiseerde gliacellen genoemd olfactorische ensheathing cellen (OECS). OECS zijn neurale lijst cellen die een gunstig micro-omgeving te creëren voor neurogenese van de PON van OM tot OB 1. Daardoor kan OECS worden gevonden in OM en in OB vormen verschillende subpopulaties van cellen 2,3. De verschillende eigenschappen van OECS hebben geleid wetenschappers om ze te gebruiken voor cellulaire transplantaties in verschillende zenuwstelsel laesie paradigma 4. Inderdaad, OECS produceren groeifactoren, verminderen gliale littekens, promote axonale hergroei, en kan vrij vermengen met astrocyten 5,6. De overgrote meerderheid van deze studies zijn gebaseerd op ruggenmergletsel (SCI), weinige daarvan OECS gebruikt na perifere zenuwschade (PNI) 7,8.
Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grote capaciteit om te regenereren na zenuwletsel, compleet secties induceren afwijkende axonale hergroei. Inderdaad, na volledige doorsnijdingen van het gezicht of de terugkerende larynx zenuwen (RMN) ze verkeerd verzonden axonen veroorzaken gespierde cocontractions genoemd synkinesis. Daarom is het van primair belang om een model van PNI voorstellen om niet alleen kwantificeren axonale hergroei maar ook de efficiëntie van de spiersamentrekkingen evalueren. In de literatuur het meest voorkomende model wordt beschreven, is gebaseerd op het gezicht zenuwlaesie 9,10. In dit model worden functionele evaluaties op basis van het herstel van de snorhaar bewegingen 10. Het is echter ingewikkeld om de efficiëntie van de mov tonenements en de gespierde cocontractions verschijnselen discrimineren. We stellen hier een model gebaseerd op een RLN laesie. Dit model maakt de evaluatie van niet alleen axonale hergroei en bewegingen van de stembanden maar ook de efficiëntie en functionaliteit van deze bewegingen na cellulaire transplantaties 11,12. Dit protocol voorziet in een stapsgewijze procedure om de cultuur en de transplantatie OECS van OM en OB in een RLN sectie / anastomose model en dieren te evalueren na de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primaire culturen van olfactorische slijmvlies en reukbollen
- Voorafgaand aan ontleding
- Maak medium, 50 ml door toevoeging van 44 ml calcium-vrije Dulbecco's gemodificeerd Eagle's / Ham's F12-medium (DMEM/F12), aangevuld met 5 ml foetaal runderserum (FBS) en 1 ml penicilline / streptomycine.
- Coat 75 cm2 flessen met poly-L-lysine (50 ug / ml, 1,5 ug / cm 2), 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Spoel kolven met PBS 1x.
- Bewaar de gecoate kolven in de koelkast tot 1 week.
- Ontleding
- Elke methode van euthanasie moet vooraf worden goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comite van de instelling en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel.
- Kies inteelt ratten zoals Fischer ratten.
- Nadat de rat is bevestigd diepe narcose te zijn aangegaan met natrium-pentobarbital of andere injecteerbare vormen van anesthesie, zoals ketamine / xylazine, onthoofden hem en rchrap de huid.
- Open de schedel van de voorste tot de achterste deel.
- Verwijder de OB verzorgen naar de hersenvliezen voorkomen.
- In dezelfde rat, opent de neusholte sagittaly.
- Verwijder het OM en zorg ervoor dat de luchtwegen slijmvlies vermijden. Merk op dat de OM epitheel gemakkelijk geïdentificeerd door een geelachtige kleur.
- Verdere gedetailleerde protocollen over dissectie van OM kan vinden in een eerdere J. Vis. Exp . publicatie 13.
- Cultuur
- Plaats OB in Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) die 0,1% trypsine gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
- Plaats OM in HBSS met 0,05% collagenase A gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
- Stop enzymatische vertering door toevoeging van 2 ml warm medium.
- Was de cellen met medium en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten.
- Vermaal monsters 2ml medium met een P1000 pipet totdat een homogene celsuspensie wordt verkregen.
- Plaat de cellen in de vooraf beklede kolven (5-10 x 10 6 cellen / kolf) met 25 ml warm medium.
- Incubeer en cultuur van de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Verander de helft van het medium om de 2 dagen.
- Na 6-8 dagen in vitro, check het aandeel van de p75-positieve cellen op kleincellige monsters, verondersteld OECS in knaagdieren, door flowcytometrie of immunocytochemie. Voor deze analyses, kunnen andere markers worden bestudeerd zoals GFAP en S100β.
- Flowcytometrieanalyse
- Het verzamelen van de cellen zoals beschreven in "cellulaire transplantatie" (punt 2.2).
- Incubeer ze met p75 primaire antilichaam (1:100) gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Was de cellen met 2 ml PBS-EDTA en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten.
- Incubeer de cellen met PE geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam gedurende 15min bij 4 ° C in het donker (1:200).
- Was de cellen met 2 ml PBS-EDTA en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 500 ui PBS-EDTA.
- Analyseer 10-30 x 10 3 cellen met stroom-cytometer.
- Immunocytochemie analyse
- Plate de cellen in 6-well platen voorgecoat voor 48 uur, zoals beschreven in "cultuur" (paragraaf 1.1.2 hieronder).
- Was de cellen met PBS.
- Fixeer de cellen met 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met PBS.
- Incubeer de cellen met PBS / Triton X100 (0,1%) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met PBS.
- Incubeer de cellen met primaire antilichamen (1:200): p75, S100β en GFAP nacht bij 4 ° C.
- Was de cellen met PBS.
- Incubeer de cellen met de secundaire antilichamen (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de cellen met PBS.
- Incubeer de cellen met Hoechst 10 min bij RTT in het donker.
- Was de cellen met PBS.
- Analyseer de cellen met een fluorescentiemicroscoop.
- GFP etikettering cellen
- Vijf dagen voor de transplantatie, infecteren OB en OM culturen overnachting met lentivirale vector die versterkt GFP (multipliciteit van infectie: 20).
- Vóór de transplantatie controle op kleine steekproeven de snelheid van de GFP-positieve cellen door flow-cytometrie zoals eerder beschreven in "cultuur" (punt 1.1).
2. Chirurgie en Transplantatie
- Recurrens anastomose
- Alle experimenten met dieren moeten vooraf worden goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comite van de instelling en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel.
- Voorafgaand aan chirurgie autoclaaf alle instrumenten en onderhouden steriliteit gedurende de chirurgische procedures.
- Verdoven rat door intraperitoneale injectie van ketamine hydrochloride (12,5 mg / kg) en chloorpromazine hydrochloride (0.625 mg / kg). Beoordelen toereikendheid van de anesthesie door teen knijpen voorafgaand aan de operatie.
- Plaats de rat in dorsale decubitus.
- Voer een 2 cm verticale medium cervicale cutane incisie met een scalpel.
- Voer een verticale insnijding van de infrahyoid spieren na de mediale witte lijn.
- Expose strottenhoofd door gebruik autostatic retractor tussen infrahyoid spieren.
- Expose de RLN.
- Onder microscopische controle, snijd de zenuw volledig met microscissors op het niveau van de zevende tracheale ring.
- Voer anastomose met behulp van een punt van 11,0 hechtdraad onder microscopische controle. Deze operatie leidt tot een specifieke motor denervatie van het strottenhoofd.
- Cellulaire transplantatie
- Net voor transplantatie, verwijdert de cellen van de gerechten met 0,05% trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Stop enzymatische vertering door toevoeging van 2 ml warm medium.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten.
- Maak cellulaire voorbereiding met 1:02 mix (30 en 60 ul in dit experiment) van DMEM/F12-Matrige l in 1,5 ml tube voor het enten en plaats het op het ijs. Om niet-specifieke effecten te vermijden, te gebruiken groeifactor verminderd Matrigel.
- Enkel voorafgaand aan transplantatie houden de buis in je hand voor een paar seconden op te warmen de Matrigel-medium mix.
- Onttronen de mix op de anastomose site met behulp van een pipet en wacht tot het mengsel zelf-assembleert op de beschadigde zenuw.
- Sluit de spieren en de huid met een 4,0 hechtdraad.
- Huis de ratten individueel en houden onder een warmtelamp voor 24 uur.
3. Evaluatie
- Laryngoscopie
- Verdoven ratten door intraperitoneal injectie van ketamine hydrochloride (12,5 mg / kg) en chloorpromazine hydrochloride (0.625 mg / kg). Bevestig ratten worden verdoofd met een teen knijpen voordat u verdergaat met het protocol.
- Plaats de rat in dorsale decubitus.
- Plaats een 30 ° videolaryngoscope aangepast aan het beste uitzicht van het strottenhoofd te bieden. Bepaal anatomische oriëntatiepunten om dezelfde weergave voor elke opname te reproduceren.
- Noteer stembanden bewegingen met behulp van de videolaryngoscope (5-10 sequenties / dier). Voor elk dier selecteert drie reeksen van opeenvolgende maximale adductie en maximale ontvoering.
- Analyseer laryngeale functie met behulp van software voor beeldanalyse. Bepaal absolute hoekige beweging door het meten van het verschil tussen de beweging van de maximale abductie en maximale adductie van de stembanden. Bepaal dynamische score door het meten van de beweging amplitude. Bepaal functionele score door het meten van de synkinesis en paradoxale bewegingen.
- Elektromyografie (EMG)
- Expose strottenhoofd en de luchtpijp door het openen van de huid en spieren, zoals eerder beschreven in "recurrens anastomose" (paragraaf 2.1).
- Expose de cricothyroid kraakbeen.
- Open de cricothyroid kraakbeen aan het achterste cricoarytenoid (PCA) spier bloot behulp microscissors.
- Introduceer een monopolaire naald elektrode (38 x 0,45 mm) in de PSO spier.
- Noteer de elektrische spieractiviteit van de PSO spier met behulp van een acquisitie systeem tijdens spontane ademhaling.
- Analyseer de spieractiviteit in termen van rijkdom en synchronisatie met de ademhaling. Om EMGs analyseren, wijs een kwalitatieve score 0-3 met behulp van de volgende schaal: 0: unrhymed tracing, zonder stijging in inspiratie, 1: rijmde tracing met inspiratoire toe, maar slechte tracing (Neurogen), 2: rijmde tracing met rijkere activiteit, 3: rijmende tracing, zeer rijk, vormt een interference patroon, vergelijkbaar met een maximale opzettelijke activiteit.
- Expose de nervus vagus te latency en mogelijke duur te meten. De nervus vagus wordt gekozen als de locatie van stimulatie omdat RLN tijdens de stimulatie kan worden beschadigd als gevolg van de kleine omvang.
- Stimuleren van de nervus vagus met een elektrode.
- Noteer elektrische signalen in de PSO spier. Meet latency en mogelijke duur. Indien mogelijk gebruik maken van een overname module om spieractiviteit, latency en mogelijke duur van het opnemen van bijvoorbeeld Powerlab systeem.
- Histologie
- Euthanaseren het dier met behulp van pentobarbital overdosis.
- Verwijder de distale stomp van RLN onder microscopische controle. Het distale deel van RMN wordt gedefinieerd als het gedeelte tussen anastomose en strottenhoofd. Merk op dat het mogelijk is de anastomose site enkele weken na de operatie omdat de 11,0 hechtdraad is een resorbeerbaar hechtdraad.
- Plaats het distale gedeelte van RMN in 2% glutaaraldehyde met 0,1 M fosfaat(PH = 7,3) gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Voorzichtig oriënteren de monsters naar coronale secties realiseren.
- Was monsters in fosfaatbuffer.
- Snij in kleinere segmenten (3-4 mm lang) en postfix gedurende 60 min bij kamertemperatuur in 1% cacodylate gebufferde OsO 4 en gedehydrateerd met ethanol.
- Orient monsters siliconen mallen en ingebed in harsen bestaande in Polybed 812, DDSA en MNA, waaraan werd toegevoegd 2% van het gaspedaal BDMA.
- Maak semi-dunne dwarsdoorsneden (1 pm-dik) met een Pyramitome ultramicrotomie System.
- Kleuren met 0,1% toluidineblauw in 1% natriumtetraboraat voor 75 sec bij 70 ° C.
- Analyseer RLN monsters met een telling analysesysteem. Tel het aantal vezels en meet gemyeliniseerde zenuwvezels profielen door bepaling van de buitenste en binnenste begrenzing van de myelineschede.
- Transplantatie
- Bereid cellen voor transplantatie en de transplantatie van de cellen zoals eerder beschrevenin "cellulaire transplantatie" (paragraaf 2.2).
- Analyse
- Euthanaseren het dier met behulp van pentobarbital overdosis. Merk op dat fixatie van de dieren kan worden uitgevoerd met intracardiale injectie van 4% PFA.
- Verwijder ongeveer 2 cm van RLN. Gebruik proximale en distale delen van de RMN.
- Fix RLN monster in vloeibare stikstof.
- WINKEL monsters bij -80 ° C.
- Doorsneden lengterichting behulp cryostaat (10-20 micrometer dik).
- Analyseren monsters onder fluorescentiemicroscoop om GFP positieve cellen te detecteren. Merk op dat anti-GFP antilichaam kan worden gebruikt om fluorescentie-emissie te vergroten en costainings voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Illustraties met controle en reinnervated (sectie / geanastomoseerd) dieren zijn gekozen als resultaten kunnen variëren, afhankelijk van de cellulaire transplantaties uitgevoerd (OM, OB of OM + OB).
Celcultuur
De cellen hechten zich snel aan het kunststof oppervlak en werd gescheiden in evenwijdige banen van cellen die lange of taps, driehoekig, multipolaire of spoelvormige zijn (Figuren 1A en 1B). Na 8 dagen in vitro flowcytometrieanalyse toont het percentage van p75-positieve cellen, 71% in primaire OB, en 13% in primaire OM culturen (figuren 1C en 1D).
Cellulaire transplantatie en chirurgie
De cellen worden getransplanteerd in een Matrigel-medium mix op geanastomoseerd RLN. Anastomose van de RMN wordt door een bijzondere 11,0 hechtdraad (figuur 2).
Evaluaties
Videolaryngoscopy Twee maanden na de transplantatie, larynx functies werden geanalyseerd door videolaryngoscopy en elektromyografie. Om te beseffen videolaryngoscopy anatomische oriëntatiepunten werden gekozen om verschil tussen ontvoering en adductie (figuur 3) te meten.
Elektromyografie
Om deze te voltooien analyseert EMG onderzoek met behulp van monopolaire naald elektrode geïmplanteerd in de PSO spieren. Typische sporen voor normaal en reinnervated (sectie / geanastomoseerd) dieren zijn weergegeven in figuur 4.
Histologische analyses
Voor deze dieren werden histologische analyses van de RLN uitgevoerd door toluïdineblauw kleuring. Typische fiber profielen voor normaal en reinnervated (sectie / geanastomoseerd) dieren worden gepresenteerd in de figuren 5A en 5B. Om deze histologische analyses te voltooien, het volgen van GFP-positieve cellen werd uitgevoerd. Figuur 5C illustreert t Hij aanwezigheid van GFP-positieve cellen in de heupzenuw na intra-nerveus transplantatie. Heupzenuw is gebruikt als controle als de RLN grootte doet er niet toe dat de intra-nerveus transplantatie.
Figuur 1. Morfologische eigenschappen en P75 expressie in primaire, OB (A en C) en OM (B en D) in vitro. (A en B) OECS in OB en OM primaire kweken uitgedrukt langwerpig, driehoekig of spoelvormige morfologie . (C en D) celoppervlak expressie van p75 in OB en OM primaire kweken werd bepaald door flow cytometrie. Nummers geven de totale populatie en het percentage cellen in de aangegeven gated regio. Alstublieft / 50590fig1highres.jpg "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Beeld van een anastomose van de RLN uitgevoerd met 11,0 hechtdraad. (A) Sectioned RLN voor de operatie. (B) Anastomosis tussen de proximale en de distale stomp van de RLN. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
"Src =" / files/ftp_upload/50590/50590fig3.jpg "/>
Figuur 3. Typische endoscopische uitzicht op de rat glottis plan. Tijdens evaluaties, oriëntatiepunten zijn vastbesloten om hetzelfde gezichtsveld have voor elke opname. Uit de gepresenteerde uitzicht zowel de maximale ontvoering (A) en de maximale adductie (B) worden gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Voorbeelden van EMG sporen verkregen tijdens de ademhaling in de PSO spier. (A) dieren van de controlegroep presenteerde een rijke elektrische spieractiviteit, met een stijging tijdens inspiratie. (
Figuur 5. Histologische studies nerveus. (A en B) Voorbeeld van coronale secties van de RMN uit controlegroep. Er bleek in de controlegroep presenteerde een groter aantal gemyeliniseerde vezels. (A) Vergroting 3960 X en (B) vergroting 11.900 X. (C) GFP gelabelde OB-OECS bleef op de laesie in heupzenuw verpletterd rat. Vergroting 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde technieken maken OECS een bruikbaar model om cellulaire transplantaties studeren in perifere zenuwschade modellen. De celkweek protocol is relatief eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd. Aan de andere kant, chirurgische ingrepen, met name punt / anastomose van de RLN, vereist ervaring en moeten door gekwalificeerd personeel worden uitgevoerd.
De in dit protocol beschreven procedures markeer belangrijke factoren te richten op om de best mogelijke resultaten te verkrijgen. Eerste, tijdens de dissociatie van OM, adviseren wij voorzichtig dissectie alleen olfactorische en niet ademhalingsepitheel verkrijgen. Ten tweede, voor de anastomose van de RLN, raden wij aan het uitvoeren van slechts een punt met een 11,0 hechtdraad. Ten derde, in evaluaties is zeer belangrijk om dezelfde diepte van anesthesie tussen alle dieren. Met name diepe anesthesie vermindert de amplitude van de beweging van de stembanden tijdens videolaryngoscopy. Wij raden removing de laryngoscoop zo spoedig mogelijk verstikking van de dieren te voorkomen. Tijdens EMG opname, vanwege de grootte van de PSO spieren raden wij zorgvuldig plaatsen van de monopolaire naald elektrode. Tenslotte histologische studies is het belangrijk om de RMN monsters voorzichtig oriënteren coronale secties verkrijgen. Het is ook belangrijk te verwijderen en te analyseren het distale deel van de RMN waarin Wallerian degeneratie optreedt.
De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd om reinculturen van OECS van OB en OM genereren. Voor zuivering van OECS van OB raadzaam de door Nash 14 techniek en voor de zuivering van OECS van OM raadzaam de door Bianco 15 methode. Deze twee specifieke zuiveringsmethoden laten zeer te hebben gezuiverd culturen van OECS (90%) en zijn eerder goed beschreven door hun auteurs 14,15. Een andere mogelijke wijziging is de transplantatie procedure where de cellen kunnen direct worden geïnjecteerd in een perifere zenuw zoals eerder beschreven voor de heupzenuw 7. In dit geval kunnen de cellen worden geïnjecteerd zonder Matrigel. Het is belangrijk op te merken dat vanwege de grootte van de RMN niet mogelijk om cellen direct te injecteren in de zenuw. Eindelijk weer eens een mogelijke wijziging is optimalisatie van de EMG-protocol. Inderdaad, kan spieractiviteit opnames van de PSO en middenrif spieren samen uitgevoerd, waardoor de noodzaak voor synchronisatie tussen larynx en ademhalingsspieren.
De huidige protocollen kunnen worden toegepast in andere zenuwbeschadiging paradigma. Wij hebben reeds getransplanteerd OECS in verschillende modellen van PNI zoals ischiadicus en vagus zenuwen kunnen deze therapieën gemakkelijk in andere PNI paradigma 8,11,12,16. Interessanter cellulaire transplantatie van OECS kan worden uitgebreid tot het centrale zenuwstelsel ziekten in het bijzonder SCI. De hier beschreven methode voor het meten van laryngealefunctie na RLN deel / anastomose kan ook gebruikt worden voor andere cellulaire transplantaties protocollen. Inderdaad, kan het strottenhoofd modellen zijn zeer krachtig axonale hergroei en synkinesis verschijnselen te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants respiratoires) en Fondation de l'Avenir erkennen voor hun financiële steun en Dr Fanie Barnabe-Heider voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
