Summary
Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum der primären Riechzellen zu ermöglichen. Diese spezielle Eigenschaft kann für die zelluläre Transplantation verwendet werden. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf der Verwendung von OECs in einer Kehlkopfnervenschädigung-Modell.
Abstract
Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum und das Nachwachsen der primären Riechzellen zu ermöglichen. Tatsächlich wird die primäre olfaktorische System durch seine Fähigkeit, sich neue Neuronen auch bei erwachsenen Tieren zu geben ist. Diese besondere Fähigkeit ist teilweise auf die Anwesenheit von OECs die eine günstige Mikroumgebung für die Neurogenese zu erstellen. Diese Eigenschaft der OECs hat für Mobil Transplantation wie in Rückenmarksverletzung Modelle verwendet. Obwohl das periphere Nervensystem hat eine größere Kapazität nach Nervenverletzung als das zentrale Nervensystem zu regenerieren, komplette Abschnitte induzieren Fehlleitung während der axonalen Nachwachsen insbesondere nach Gesichts von Kehlkopfnervendurchtrennung. Insbesondere voller Schnitte des N. recurrens (RLN) induziert abweichenden axonalen Nachwachsen was Synkinese der Stimmbänder. In diesem speziellen Modell haben wir gezeigt, dass OECs Transplantation effizient axonalen Nachwachsen erhöht.
ve_content "> OECs aus sowohl in der Riechschleimhaut (OM-OECs) und Riechkolben (OB-OECs) weisen mehrere Subpopulationen gebildet. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation auf Basis der Verwendung dieser verschiedenen Subpopulationen von OECs in eine RLN Verletzungsmodell. Mit diesem Paradigma wurden Primärkulturen von OB-OECs und OM-OECs in Matrigel nach Schnitt und Anastomose der RLN transplantiert. Zwei Monate nach der Operation, werteten wir transplantierten Tieren durch komplementäre Analysen auf der Basis videolaryngoscopy, Elektromyographie (EMG) und histologische Untersuchungen. Erstens erlaubt videolaryngoscopy uns Kehlkopffunktionen auszuwerten, insbesondere Muskelkokontraktionen Phänomene. Dann analysiert EMG gezeigt Reichtum und Synchronisation von Muskelaktivitäten. Schließlich histologische Studien basierend auf Toluidinblau-Färbung erlaubt die Quantifizierung der Anzahl und Profil von markhaltigen Fasern.Alle zusammen, beschreiben wir hier, wie Sie, Kultur, ide isolierenntify und Transplantation OECs von OM und OB nach Abschnitt RLN-Anastomose und wie zu bewerten und zu analysieren, die Effizienz der transplantierten Zellen auf das Nachwachsen der axonalen und Kehlkopffunktionen.
Introduction
Die Riechschleimhaut (OM) in peripheren Nervensystems und des olfaktorischen Bulbus (OB) in das zentrale Nervensystem, die primäre olfaktorische System besteht aus zwei unterschiedlichen Teilen zusammengesetzt. Der primäre olfaktorische System wird durch die Kapazität der primären olfaktorischen Neuronen (PON) zur Selbsterneuerung während des gesamten Lebens in Säugetierarten gekennzeichnet. Diese Fähigkeit wird durch die Anwesenheit von neuralen Stammzellen in dem OM ermöglicht. PON Wachstum und Nachwachsen von OM zu OB wird von spezialisierten Gliazellen genannt ensheathing Riechzellen (OECs) erleichtert. OECs sind Neuralleistenzellen, die einen günstigen Mikroumgebung für die Neurogenese des PON von OM in den OB 1 erstellen. Dadurch kann OECs in OM und OB bilden unterschiedliche Subpopulationen von Zellen 2,3 gefunden werden. Die unterschiedlichen Eigenschaften der OECs haben Wissenschaftler führen, um sie für die Zelltransplantationen in mehreren Nervensystem Läsion Paradigmen 4 zu verwenden. Tatsächlich OECs produzieren Wachstumsfaktoren, Glia-Narben zu reduzieren, prOmote axonalen Nachwachsen und kann frei vermischen sich mit 5,6 Astrozyten. Allerdings sind die überwiegende Mehrheit dieser Studien zu Rückenmarksverletzungen (SCI) basiert; wenige von ihnen haben OECs nach peripherer Nervenverletzung (PNI) 7,8 verwendet.
Obwohl das periphere Nervensystem hat eine große Kapazität, nach Nervenverletzung zu regenerieren, komplette Abschnitte induzieren abweichenden axonalen Nachwachsen. In der Tat, nach der vollständigen Querschnitten erhalten des Gesichts oder der wiederkehrenden Kehlkopfnerven (RLN) fehlgeleitet Axone verursachen Muskelkokontraktionen Synkinese genannt. Deshalb ist es von grundlegender Bedeutung, um ein Modell der PNI schlagen nicht nur quantitativ axonale Nachwachsen sondern auch die Wirksamkeit der Muskelkontraktionen zu bewerten. In der Literatur wird beschrieben häufigste Modell ist auf Gesichtsnerv Läsion 9,10 basiert. In diesem Modell werden funktionelle Auswertungen auf die Erholung der Whisker Wanderung 10 basiert. Es ist jedoch schwierig, die Effizienz des beweglichen demonstrierenements und die Muskelkokontraktionen Phänomene zu unterscheiden. Wir schlagen vor, hier ein Modell auf der Basis einer RLN Läsion. Dieses Modell ermöglicht die Auswertung der nicht nur das Nachwachsen der axonalen und Bewegungen der Stimmbänder, sondern auch die Effizienz und Funktionalität dieser Bewegungen nach Zelltransplantationen 11,12. Dieses Protokoll bietet eine Schritt für Schritt vor, um Kultur-und Transplantations OECs von OM und OB in einem Abschnitt RLN / Anastomose Modell und zu den Tieren nach der Operation zu beurteilen.
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Protocol
1. Primärkulturen von Riechschleimhaut und Riechkolben
- Vor der Präparation
- Machen Medium, 50 ml, durch Zugabe von 44 ml einer kalziumfreien Dulbeccos modifiziertem Eagle-/ Ham 's F12-Medium (DMEM/F12) mit 5 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 1 ml Penicillin / Streptomycin ergänzt.
- Mantel 75 cm 2-Kolben mit Poly-L-Lysin (50 ug / ml, 1,5 &mgr; g / cm 2), 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie Flaschen mit PBS 1x.
- Lagern Sie die Flaschen beschichtet im Kühlschrank bis zu 1 Woche.
- Präparation
- Jede Methode der Sterbehilfe ist im Voraus von Tierpflege und Verwendung Ausschuss des Organs genehmigte und von qualifiziertem Personal durchgeführt werden.
- Wählen Inzuchtratten wie Fischer-Ratten.
- Nachdem die Ratte wurde bestätigt, tiefe Narkose mit Natrium-Pentobarbital oder anderen injizierbaren Formen der Anästhesie wie Ketamin / Xylazin eingegeben haben, ihn zu enthaupten und rntfernen die Haut.
- Öffnen Sie den Schädel von der vorderen bis zur hinteren Teil.
- Entfernen Sie den OB kümmert, um die Hirnhaut zu vermeiden.
- In der gleichen Ratte, öffnen Sie die Nasenhöhle sagittaly.
- Entfernen der OM kümmert sich um den Schleimhaut der Atemwege zu vermeiden. Beachten Sie, dass der OM Epithel kann leicht durch seine gelbliche Farbe identifiziert werden.
- Weitere detaillierte Protokolle über Dissektion der OM in einer früheren finden werden J. Vis. Exp . Veröffentlichung 13.
- Kultur
- Platzieren OB in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS), enthaltend 0,1% Trypsin für 45 min bei 37 ° C.
- Platzieren OM in HBSS, enthaltend 0,05% Collagenase A für 45 min bei 37 ° C.
- Stoppen enzymatischen Verdau durch Zugabe von 2 ml warmem Medium.
- Waschen Sie die Zellen mit Medium und zentrifugieren bei 300 g für 3 min.
- Man reibt Proben von 2ml Medium mit einer Pipette P1000, bis eine homogene Zellsuspension erhalten wird.
- Platte die Zellen in den Flaschen-Fertig (5-10 x 10 6 Zellen / Flasche) mit 25 ml warmem Medium.
- Inkubieren und Kultur der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 2 Tage.
- Nach 6-8 Tagen in vitro, überprüfen Sie den Anteil der p75-positiven Zellen auf kleinen Zellproben, angenommen OECs in Nagetieren Zytometrie oder durch Immunzytochemie sein, durch die Strömung. Für diese Analysen können auch andere Marker wie GFAP und S100β sucht werden.
- Durchflusszytometrie-Analyse
- Sammeln Sie die Zellen, wie in "Zelltransplantation" (Abschnitt 2.2) beschrieben.
- Inkubieren mit p75 primären Antikörper (1:100) für 15 min bei 4 ° C.
- Waschen der Zellen mit 2 ml PBS-EDTA und zentrifugieren bei 300 × g für 3 min.
- Die Zellen mit PE-konjugierten Anti-Maus-Sekundäranti Inkubation bei 15min bei 4 ° C im Dunkeln (1:200).
- Waschen der Zellen mit 2 ml PBS-EDTA und zentrifugieren bei 300 × g für 3 min.
- Resuspendieren der Zellen in 500 ul PBS-EDTA.
- Analysieren 10-30 x 10 3 Zellen mit Durchflusszytometer.
- Immunocytochemistry Analyse
- Platte der Zellen in 6-Well-Platten für 48 Stunden schwemmt wie in "Kultur" (Abschnitt 1.1.2) beschrieben.
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Fixieren die Zellen mit 4% PFA für 15 min bei RT.
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Die Zellen für 15 min bei RT inkubieren mit PBS / Triton X100 (0,1%).
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Inkubieren der Zellen mit primären Antikörpern (1:200): p75, S100β GFAP und über Nacht bei 4 ° C.
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Während 1 h bei RT in Dunkelheit Inkubieren Sie die Zellen mit den Sekundärantikörper (1:500).
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Inkubieren der Zellen mit Hoechst 10 min bei RT in der Dunkelheit.
- Mit PBS Waschen Sie die Zellen.
- Analysieren der Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.
- GFP-Markierung von Zellen
- Fünf Tage vor der Transplantation, infizieren OB und OM Kulturen über Nacht mit lentiviralen Vektor, der verstärkte GFP (Multiplizität der Infektion, 20).
- Vor der Transplantation Prüfung auf kleine Proben der Anteil der GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie, wie zuvor in "Kultur" (Abschnitt 1.1) beschrieben.
2. Chirurgie und Transplantations
- Wiederkehrende Nervenanastomose
- Alle Experimente mit Tieren müssen im Voraus von Tierpflege und Verwendung Ausschuss des Organs genehmigte und von qualifiziertem Personal durchgeführt werden.
- Vor der Operation Autoklaven alle Instrumente und pflegen Sterilität in den chirurgischen Eingriffen.
- Ratten anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (12,5 mg / kg) und Chlorpromazin-Hydrochlorid (0,625 mg / kg). Bewerten Angemessenheit der Anästhesie durch Zehe Prise vor der Operation.
- Legen Sie die Ratte in Rückenlage.
- Führen Sie eine 2 cm senkrecht Mediums Gebärmutterhalskrebs Hautschnitt mit einem Skalpell.
- Führen Sie einen vertikalen Schnitt der infrahyoideus folgenden medialen weiße Linie.
- Expose Kehlkopf durch die Verwendung autostatische Aufroller zwischen infrahyoideus.
- Setzen Sie die RLN.
- Unter mikroskopischer Kontrolle, schneiden Sie den Nerv voll mit Mikroschere auf der Ebene des siebten Trachealring.
- Führen Anastomose mit einem Punkt von 11,0 Naht unter mikroskopischer Kontrolle. Diese Operation führt zu einer spezifischen Motor Denervierung des Kehlkopfes.
- Zelluläre Transplantation
- Kurz vor der Transplantation zu entfernen, die Zellen von den Schalen unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C.
- Stoppen enzymatischen Verdau durch Zugabe von 2 ml warmem Medium.
- Zentrifugieren bei 300 g für 3 min.
- Machen Zellzubereitung mit 1.02-Mix (30 und 60 ul in diesem Experiment) des DMEM/F12-Matrige l in 1,5-ml-Röhrchen vor dem Pfropfen und legen Sie es auf Eis. Um unspezifische Effekte zu vermeiden, verwenden Wachstumsfaktor reduziert Matrigel.
- Kurz vor der Transplantation halten den Schlauch in der Hand für ein paar Sekunden zum Aufwärmen der Matrigel-Medium-Mix.
- Depose den Mix auf der Anastomose mit einer Pipette und warten, bis die Mischung selbst montiert auf den verletzten Nerv.
- Schließen Sie die Muskeln und die Haut mit einem 4,0 Faden.
- Haus die Ratten einzeln zu halten und unter einer Wärmelampe für 24 Stunden.
3. Auswertung
- Laryngoskopie
- Anesthetize Ratten durch intraperitoneal Injektion von Ketamin-Hydrochlorid (12,5 mg / kg) und Chlorpromazin-Hydrochlorid (0,625 mg / kg). Ratten bestätigen sind mit einer Zehe Prise vor mit Protokoll fortfahren betäubt.
- Legen Sie die Ratte in Rückenlage.
- Legen Sie ein 30 ° videolaryngoscope angepasst, um den besten Blick auf den Kehlkopf zu liefern. Anatomischen Landmarken zu bestimmen, um die gleiche Ansicht für jede Aufnahme wiederzugeben.
- Nehmen Stimmbandbewegungen mit der videolaryngoscope (5-10 Sequenzen / Tier). Für jedes Tier wählen drei Sequenzen von aufeinander maximale Adduktion und maximale Entführung.
- Analysieren Kehlkopf-Funktion mit Bildanalyse-Software. Bestimmen Sie absolute Winkelbewegung durch Messung der Differenz zwischen der Bewegung der maximalen Entführung und maximale Adduktion der Stimmbänder. Bestimmen Sie dynamische Punktzahl durch die Messung der Bewegungsamplitude. Bestimmen funktionalen Bewertung durch die Messung der Synkinese und paradoxen Bewegungen.
- Elektromyographie (EMG)
- Expose Kehlkopfes und der Luftröhre durch Öffnen Haut und Muskeln wie zuvor in "wiederkehrende Nervenanastomose" (Abschnitt 2.1) beschrieben.
- Setzen Sie die cricothyroideum Knorpel.
- Öffnen Sie die cricothyroideum Knorpel, um die hinteren cricoarytenoid (PCA) mit Mikroschere Muskel aussetzen.
- Einführung eines monopolaren Nadelelektrode (38 x 0,45 mm) in der PCA Muskel.
- Notieren Sie die elektrische Muskelaktivität des PCA Muskel mit einem Erfassungssystem während der spontanen Ventilation.
- Analysieren Sie die Muskelaktivität in Bezug auf Reichtum und die Synchronisation mit der Atmung. Um zu analysieren, EMG, weisen eine qualitative Punktzahl von 0-3 anhand der folgenden Skala: 0: unrhymed Verfolgung, ohne Erhöhung während der Inspiration, 1: gereimt Tracing mit Inspirations Erhöhung, aber schlechte Rückverfolgung (NEUROGEN), 2: gereimt Tracing mit reicher Tätigkeit 3: gereimt Tracing, sehr reich, ein i bildennterference Muster, ähnlich einer maximalen absichtliche Aktivität.
- Expose der Vagusnerv, um die Latenz und potentiellen Dauer zu messen. Der Vagusnerv ist als Standort gewählt, weil der Stimulation RLN können während der Stimulation auf Grund seiner geringen Größe beschädigt werden.
- Anregung der Vagusnerv mit einer Elektrode.
- Aufzeichnung von elektrischen Signalen in dem PCA Muskel. Messen der Latenzzeit und Dauer Potenzial. Wenn möglich verwenden Sie ein Erfassungsmodul, um die Muskelaktivität, Latenz und Potentialdauer aufzeichnen wie Powerlab System.
- Histologie
- Euthanize das Tier mit Pentobarbital-Überdosis.
- Entfernen Sie den distalen Stumpf des RLN unter mikroskopischer Kontrolle. Der distale Teil des RLN ist der Teil zwischen Anastomose und Kehlkopf definiert. Man beachte, dass es möglich ist, die Anastomose mehrere Wochen nach der Operation zu finden, weil die 11.0 Nahtmaterial ein nicht-absorbierbare Naht.
- Platzieren des distalen Abschnitts des RLN in 2% Glutaraldehyd mit 0,1 M Phosphat(PH = 7,3) für 2 h bei 4 ° C.
- Sorgfältig orientieren die Proben koronalen Abschnitte zu realisieren.
- In Phosphatpuffer waschen Proben.
- Schneiden in kleinere Segmente (3-4 mm Länge) und Postfix für 60 min bei Raumtemperatur in 1% OsO 4 gepuffert und mit Ethanol dehydriert.
- Orient Proben in Silikonformen und in Harzen, bestehend in POLYBED 812, DDSA und MNA eingebettet, um die 2% des Beschleunigers BDMA zugegeben wurde.
- Machen Semidünnquerschnitte (1 um dick) mit einem Pyramitome Ultramikrotomie-System.
- Fleck mit 0,1% Toluidinblau in 1% Natriumtetraborat für 75 sec bei 70 ° C.
- Analysieren RLN Proben mit einem Zähl-Analyse-System. Die Anzahl der Fasern zu messen und myelinisierten Nervenfaserprofile durch Bestimmung der äußeren und inneren Begrenzung der Myelinscheide.
- Transplantation
- Vorbereitung der Zellen für die Transplantation und Transplantation der Zellen wie zuvor beschriebenin "Zelltransplantation" (Abschnitt 2.2).
- Analyse
- Euthanize das Tier mit Pentobarbital-Überdosis. Beachten Sie, dass die Fixierung der Tiere mit intrakardiale Injektion von PFA 4% durchgeführt werden.
- Entfernen Sie ca. 2 cm der RLN. Verwenden proximalen und distalen Teile der RLN.
- Fix RLN Probe in flüssigem Stickstoff.
- Proben bei -80 ° C
- Cut-Proben in Längsrichtung mit Kryostat (10-20 um dick).
- Analysieren Sie die Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop mit GFP-positiven Zellen zu erkennen. Beachten Sie, dass anti-GFP-Antikörper können zur Fluoreszenzemission erhöhen und costainings durchzuführen.
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Representative Results
Abbildungen mit Steuerung und reinnervierte (Abschnitt / anastomosiert) Tiere wurden ausgewählt, als Ergebnisse können in Abhängigkeit von der Zelltransplantationen durchgeführt (OM, OB oder OM + OB) variieren.
Zellkultur
Die Zellen anhaften schnell auf der Kunststoffoberfläche und wurde in parallelen Schwaden von Zellen, die länglich oder verjüngt, dreieckig, mehrpolige oder spindelförmig getrennt sind (Fig. 1A und 1B). Nach 8 Tagen in vitro Durchflusszytometrie-Analyse zeigt die Rate der p75-positiven Zellen, 71% in der Primär OB, und 13% in Primärkulturen OM (1C und 1D).
Zelluläre Transplantation und Chirurgie
Die Zellen werden in einem Matrigel-Medium Mischung auf anastomosed RLN transplantiert. Anastomose der RLN wird durch einen Punkt von 11,0 Naht (Abbildung 2) gemacht.
Auswertungen
Videolaryngoscopy Zwei Monate nach der Transplantation wurden Kehlkopffunktionen videolaryngoscopy Elektromyographie und analysiert. Zu erkennen, videolaryngoscopy anatomischen Landmarken wurden ausgewählt, um Unterschied zwischen Ab-und Adduktion (Abbildung 3) zu messen.
Elektromyographie
Um diese zu vervollständigen EMG-Analysen wurden durchgeführt, mit monopolaren Nadelelektrode in den PCA Muskulatur implantiert. Typische Spuren für normale und reinnervierte (Abschnitt / anastomosiert) Tiere sind in Abbildung 4 dargestellt.
Die histologische Analysen
Bei diesen Tieren wurden histologische Analysen der RLN durch Toluidinblaufärbung durchgeführt. Typische Faserprofile für normale und reinnervierte (Abschnitt / anastomosiert) Tiere sind in den 5A und 5B dargestellt. Um diese histologische Analysen zu vervollständigen, wurde Tracking von GFP-positiven Zellen durchgeführt. 5C stellt t er Vorhandensein von GFP-positiven Zellen in den Ischiasnerv nach intraNervenTransplantation. Ischiasnerv wurde als Kontrolle verwendet worden, wie die RLN Größe nicht innerNervenTransplantation zu ermöglichen.
Fig. 1 ist. Morphologische Eigenschaften und P75-Expression in primären Kulturen von OB (A und C) und OM (B und D) in vitro. (A und B) in OECs OB und OM Primärkulturen exprimiert länglichen, dreieckig oder spindelförmige Morphologien . (C und D) Die Zelloberflächenexpression von p75 in OB und OM Primärkulturen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Zahlen geben die Gesamtbevölkerung und den Prozentsatz an Zellen in den angegebenen Wohn Regionen präsent. Bitte / 50590fig1highres.jpg "> hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Bild einer Anastomose der RLN durchgeführt mit 11,0 Naht. (A) unterteiltes RLN vor der Operation. (B) Anastomose zwischen dem proximalen und distalen Stumpf des RLN. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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3. Typische endoskopische Ansichten der Ratte Stimmritze Plan. Während Auswertungen, Landmarken, um die gleichen Sichtfeld für jede Aufnahme haben bestimmt. Von der Ansicht präsentiert sowohl die maximale Entführung (A) und die maximale Adduktion (B) gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Beispiele für EMG Spuren während der Atmung in der PCA-Muskels erhalten. (A) Die Tiere der Kontrollgruppe präsentiert eine reiche elektrische Muskelaktivität mit einem Anstieg bei der Inspiration. (
Abbildung 5. Nerven histologische Studien. (A und B) Beispiel eines koronalen Abschnitte der RLN von Kontrollgruppe. Diese Analyse zeigte, daß die Kontrollgruppe präsentiert eine höhere Anzahl von myelinisierten Fasern. (A) Vergrößerung 3960 X und (B) Vergrößerung 11.900 X. (C) GFP-markierten OB-OECs blieb auf der Läsion in Ischiasnerv zerquetscht Ratte. Vergrößerung 100X.
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Discussion
Die hier vorgestellten Techniken machen OECs ein nützliches Modell, um Zelltransplantationen in peripheren Nervenverletzung Modelle zu studieren. Das Zellkulturverfahren ist relativ einfach und leicht durchgeführt werden. Auf der anderen Seite, chirurgische Eingriffe, insbesondere Abschnitt / Anastomose der RLN, erfordern Erfahrung und muss von qualifiziertem Fachpersonal durchgeführt werden.
Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren markieren wichtige Faktoren zu konzentrieren, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen. Erstens, während die Dissoziation von OM, empfehlen wir eine sorgfältige Präparation nur olfaktorische und nicht respiratorischen Epithel zu erhalten. Zweitens, für die Anastomose der RLN, empfehlen wir die Durchführung nur einen Punkt mit einem 11,0 Naht. Drittens, während der Auswertungen ist es sehr wichtig, um die gleiche Tiefe der Anästhesie zwischen allen Tieren. Insbesondere tiefe Narkose verringert die Amplitude der Bewegung der Stimmbänder während videolaryngoscopy. Wir empfehlen removing das Laryngoskop so bald wie möglich, Asphyxie der Tiere zu vermeiden. Während der EMG-Aufzeichnung, aufgrund der Größe der PCA Muskeln empfehlen wir sorgfältig Platzierung der monopolaren Nadelelektrode. Schließlich ist es für histologische Untersuchungen wichtig, sorgfältig zu orientieren, die RLN Proben koronalen Abschnitte zu erhalten. Es ist auch sehr wichtig, zu entfernen und zu analysieren, den distalen Teil des RLN in dem Waller-Degeneration auftritt.
Die hier beschriebenen Protokolle können einfach um Reinkulturen von OECs von OB und OM erzeugen geändert werden. Zur Reinigung von OECs von OB empfehlen wir die von Nash 14 beschriebene Technik und für die Reinigung von OECs von OM empfehlen wir die von Bianco 15 beschriebenen Methode. Diese beiden spezifischen Reinigungsverfahren zu ermöglichen, haben hochgereinigten Kulturen OECs (90%) und wurden zuvor auch von ihren Autoren 14,15 beschrieben. Eine weitere mögliche Modifikation ist die Transplantation Verfahren überall dorte können die Zellen direkt in einen peripheren Nerv, wie zuvor für den Ischiasnerv 7 beschrieben injiziert werden. In diesem Fall können die Zellen ohne Matrigel injiziert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass aufgrund der Größe des RLN ist es nicht möglich, Zellen direkt in diesen Nerv zu injizieren. Schließlich eine weitere mögliche Modifikation ist die Optimierung der EMG-Protokoll. Tatsächlich kann die Muskelaktivität Aufnahmen der PCA und Zwerchfellmuskeln zusammengeführt werden, wodurch die Notwendigkeit für eine Synchronisation zwischen Kehlkopf-und Atemmuskulatur.
Die aktuellen Protokolle können in anderen Nerven Läsion Paradigmen angewendet werden. Wir haben bereits in verschiedenen Modellen von PNI wie Ischias und vagus transplantiert OECs, können diese leicht in anderen Therapien PNI verwendet werden Paradigmen 8,11,12,16. Noch interessanter ist die Transplantation von Zell OECs können Erkrankungen des zentralen Nervensystems, insbesondere SCI erweitert werden. Die zur Messung der Kehlkopf hier beschriebenen VerfahrenFunktion nach Abschnitt RLN / Anastomose kann auch für andere Zelltransplantationen Protokolle verwendet werden. Tatsächlich kann Kehlkopfmodelle sehr mächtig, um das Nachwachsen der axonalen und Synkinese Phänomene zu beurteilen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants respiratoires) und Fondation de l'Avenir für ihre finanzielle Unterstützung und Dr. Fanie Barnabé-Heider für die Bearbeitung des Manuskripts bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T | |
| FBS | Invitrogen | E3387M | |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 | |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P | |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 | |
| DDSA | Biovalley | 00563-450 | |
| MNA | Biovalley | 00886-450 | |
| BDMA | Biovalley | 00141-100 | |
| Polybed 812 | Biovalley | 08791-500 | |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 | |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 | |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 | |
| Toluidine Blue | Ral Diagnostics | 361590-0025 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Microscope | Zeiss | ||
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 | |
| Acquisition system | AD Instruments | Powerlab system | |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S | |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
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