Multi-elektrode patch-clamp opptak utgjør en kompleks oppgave. Her viser vi hvordan, ved automatisering av mange av de eksperimentelle skritt, er det mulig å akselerere prosessen fører til kvalitativ forbedring i ytelse og antall innspillinger.
Den patch-clamp teknikken er i dag den mest veletablert metode for registrering av elektrisk aktivitet fra enkelte nerveceller eller deres subcellulære avdelinger. Ikke desto mindre å oppnå stabile opptak, og med fra de enkelte celler, er en tidkrevende prosess av betydelig kompleksitet. Automatisering av mange trinn i forbindelse med effektiv informasjonsdisplay kan i stor grad hjelpe experimentalists i å utføre et større antall innspillinger med større pålitelighet og på kortere tid. For å oppnå store innspillinger konkluderte vi den mest effektive tilnærmingen er ikke å fullautomatisere prosessen, men for å forenkle de eksperimentelle skritt og redusere mulighetene for menneskelige feil ved effektivt å innlemme eksperimentator erfaring og visuell tilbakemelding. Med disse målene i tankene vi utviklet et datastøttet system som sentraliserer alle de tiltak som er nødvendige for en multi-elektrode patch-clamp eksperiment i et enkelt grensesnitt, en commercially tilgjengelig trådløs gamepad, mens du viser eksperiment relatert informasjons-og veiledningspekepinner på dataskjermen. Her beskriver vi de forskjellige komponentene i systemet som mulig for oss å redusere den tid som kreves for å oppnå opptakskonfigurasjon og vesentlig øke sjansene for vellykket opptak av et stort antall neuroner samtidig.
Kapasitet til å ta opp og stimulere flere nettsteder med mikrometer presisjon er svært nyttig for eksperimentelt å oppnå en bedre forståelse av nervesystemer. Mange teknikker er blitt utviklet for dette formål, men ingen gir den submillivolt oppløsning oppnådd ved patch-clamp teknikk, essensiell for å studere subthreshold aktivitet og enkelte postsynaptiske potensial. Her dekker vi utviklingen av en tolv-elektrode datamaskin-assistert patch-clamp system rettet mot samtidig opptak og stimulere et stort antall enkeltceller med tilstrekkelig presisjon for studiet av nevronale tilkobling. Selv om mange andre anvendelser kan tenkes for et slikt system, gir det seg spesielt godt til studiet av synaptiske tilkoblings gitt at antall mulige forbindelser innen en gruppe av nerveceller vokser proporsjonalt med kvadratet av antall neuroner det gjelder. Derfor, mens et system med tre elektroder gjør det mulig å testeForekomsten av opp til seks forbindelser og oftest innspilling av et eneste, opptak tolv nevroner kan teste forekomsten av opp til 132 forbindelser og ofte observere over ett dusin (figur 1). Observasjonen av en rekke forbindelser som gjør det mulig samtidig å analysere organiseringen av små nettverk og antyde statistiske egenskaper av nettstruktur som ikke kan bli analysert på annen måte en. Videre tillater presis stimulering av mange celler også kvantifisering av rekruttering av postsynaptiske celler to.
En umiddelbar spørsmål vanligvis oppstår om frekvensen av suksessen av prosedyren vi beskrevet. For høy suksessrate forberedelser er viktig. Pipetter må ha tips åpninger som er tilstrekkelig for cellenes vesener registrert. Filtrering av den intracellulære løsning for å unngå å tette pipetter er også viktig. Ekstremt rene, nytappet pipetter er et annet krav. En binomial fordeling er den enkleste modell som kan brukes til å forstå hvordan disse forhold påvirker det endelige utbyttet. Det er rimelig å forv…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, og Sonia Garcia for verdifulle råd om forbedringer for patch-clamp prosedyre automatisering. Vi takker Rajnish Ranjan for verdifulle råd og hjelp med programvare implementering. Dette arbeidet ble finansiert delvis av EU Synapse prosjektet og dels av Human Frontiers Science Program.
Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
Membrane pump | Schego | Optimal |