Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية Published: November 4, 2013 doi: 10.3791/50631

Summary

توضح هذه المقالة ثلاث الاستعدادات الجهاز العصبي باستخدام العلق: تسجيل داخل الخلايا من الخلايا العصبية في العقد البطنية، زراعة الخلايا العصبية من العقد البطنية، وتسجيل من رقعة من الجلد معصب لتعيين حقول الحسية.

Abstract

علقة المياه العذبة، العلقة medicinalis، هو كائن نموذج متعدد الاستعمالات التي استخدمت لمعالجة المسائل العلمية في مجالات الفسيولوجيا العصبية، neuroethology، والبيولوجيا التطورية. الهدف من هذا التقرير هو تعزيز أساليب فنية تجريبية من نظام علقة في مادة واحدة من شأنها أن تكون ذات فائدة للفسيولوجي ذوي الخبرة في غيرها من الاستعدادات الجهاز العصبي، أو لطلاب البيولوجيا مع خبرة قليلة أو معدومة الكهربية. ونحن لشرح كيفية تشريح علقة لتسجيل داخل الخلية من الدوائر العصبية التي تم تحديدها في العقدة. المقبل نظهر كيف يمكن إزالة الخلايا الفردية من وظيفة معروفة من العقدة ليكون مثقف في طبق بيتري، وكيفية تسجيل من تلك الخلايا العصبية في الثقافة. ثم نحن لشرح كيفية إعداد رقعة من الجلد معصب لاستخدامها لرسم خرائط حقول الحسية أو الحركية. لا تزال تستخدم على نطاق واسع هذه الاستعدادات علقة لمعالجة الخصائص الكهربائية الأساسية من الشبكه العصبيةكانساس، والسلوك synaptogenesis، و، والتنمية. بل هي أيضا وحدة التدريب المناسب لعلم الأعصاب أو علم وظائف الأعضاء مختبرات التدريس.

Introduction

إعداد علقة مفيد للتحقيق وظيفة يمكن تحديدها (الحسية والحركية وبين الخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي الحيوان (CNS). الخاصية مفيدة من الخلايا العصبية علقة هو أن شكل امكانات العمل وممتلكاتهم الفيزيائية الحيوية هي سمة ل نظرا نوع من الخلايا (أي P، N، T، Rz مشاهدة). الخلايا العصبية وعلاوة على ذلك يمكن إزالتها من الحيوان والمثقف في وسيلة مناسبة في الخلايا التي تحافظ على خصائصها الكهربائية لطالما 45 يوما 1،2.

وهناك ميزة متميزة من العقدة علقة لتعلم كيفية جعل التسجيلات الكهربية هو أن الخلايا مميز وموثوق بها مرتبة في العقدة في النمط الذي يسمح تحديد أنواع الخلايا متميزة من العقدة إلى العقدة ومن الحيوان الى الحيوان. وأشار الموقع الفريد ومورفولوجيا الخلايا العصبية في العقد علقة بواسطة رتزيوس في وقت مبكر من 1891 3. المعرفة من الالهوية الإلكترونية وظيفة الخلايا العصبية هو مفيد للتحقيق في الدوائر العصبية وبإجراء تجارب مع نوع من الخلايا معين. ويرجع ذلك إلى somata كبيرة نسبيا من الخلايا العصبية ضمن العقدة تكون مرئية مع مجهر تشريح، وsomata يمكن مخوزق انتقائي مع microelectrodes لتسجيل ممتلكاتهم الكهربائية.

ويمكن حقن الأصباغ والجزيئات الكبيرة إلى الخلايا الفردية وخصائص القناة التي يدرسها المشبك التصحيح. وقد تم تحديد التيارات الأيونية التي تؤدي إلى أشكال مختلفة من إمكانات العمل المميزة في مختلف الخلايا العصبية 4-7. من التحقيقات في نمط تعصيب والمتفرعة من الخلايا العصبية الفردية داخل الجهاز العصبي المركزي، وقد استنسخت الاتصالات متشابك في الثقافة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها 2،8. وقد وفرت دراسات في العقد علقة ثاقبة في تطوير الدوائر الوظيفية التي يمكن قياسها مع الكهربية وكذلك مع مصنعونالبريد سلوك الحيوان الدراسات. وقد عمل الجهاز العصبي المركزي علقة أيضا تمهيدا للتحقيق قيمة الآليات التي تشارك مع إصلاح الخلايا العصبية والتجديد في الحيوان كله وفي الثقافة 4-6،9-12.

في أدمغة الثدييات بل هو مهمة شاقة لتفسير السلوك من حيث الخصائص وصلات الخلايا العصبية التي تم تحديدها الفردية. من حيث المبدأ يمكن للمرء أن يأمل أن دراسة أنظمة أقل تعقيدا مثل علقة يمكن أن تساعد على تحديد الآليات الأساسية المستخدمة في الحيوانات العليا. الاتصالات التي تستخدم التي تكمن وراء وجود نمط السباحة 13،14 والنظمية من القلب 15 وقد اتسمت جيدا في علقة. قدرة بعض الخلايا العصبية علقة لتشكيل كل من الاتصالات الكهربائية والكيميائية للفضول. بعض الاتصالات هي ثنائية الاتجاه حين أن البعض الآخر أحادي الاتجاه ثنائي الاتجاه ولكن كيميائيا كهربائيا 7. فهم اتصالات متشابك داخل الحيوان فضلا عن إعادة نفس الطباع(ه) من اتصالات في صحن الثقافة هي أدوات قوية للتحقيق في synaptogenesis 16-18 وكذلك التنميط الدوائية من نقاط الاشتباك العصبي 19. تقنيات التسجيل وتحفيز الخلايا الموصوفة هنا توفر أساسا لفحوصات الدوائية والبحوث في neuroethology والتنمية.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تشريح قطعي الحبل البطني العصب مع رقعة من الجلد معصب. مع القدرة على الحفاظ على رقعة من الجلد والخلايا العصبية على قيد الحياة، وحقول تقبلا الحسية يمكن بحثها من خلال تسجيل الإشارات الكهربائية من خلايا الجسم (أي سوما) من الخلايا العصبية الحسية داخل العقدة في البطن منها في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي يمكن للمرء أن تقييم حساسية النهايات الحسية من خلال تطبيق درجات متفاوتة من القوة على الجلد وتعيين حقول تقبلا: لمسة خفيفة، والضغط، والضارة (مؤلمة) محفزات 20،21.

ميزة هذا علقة إعداد العقدة الجلد هو أن كاليفورنيا واحدةن رسم خريطة الحقل تشريحيا تقبلا وتتبع العمليات العصبية إلى الخلايا العصبية التي تم تحديدها مرة واحدة ويتم تسجيل الاستجابات الكهربائية. التجارب علقة الثلاث المذكورة أدناه يمكن أن تكتمل كل عدة مرات مع عينة واحدة، مما يجعل هذا وحدة نمطية التدريس فعالة من حيث التكلفة للمختبرات الأكاديمية.

Protocol

1. إعداد أقطاب ومحلول ملحي

  1. إعداد المالحة الفسيولوجية والأقطاب قبل أن يتم تشريح الحيوان. يتكون الحل علقة رينغر مما يلي: 115.3 مم كلوريد الصوديوم، 1.8 مم CaCl 4.0 ملي بوكل، 10 ملي تريس / حمض الماليك أو HEPES. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
  2. إعداد الأسلاك حج-CL بواسطة غمس سلك الفضة تنظيفها في كمية صغيرة من المبيض لمدة 20 دقيقة أو حتى السلك لديها الانتهاء من الرمادي الداكن على نحو سلس. يغسل السلك بالماء المقطر قبل استخدام. ثم ضع السلك إلى صاحب micropipette ان السدادات الى مكبر للصوت.
  3. إعداد الزجاج الكهربائي حادة من الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة. يجب أن تكون المقاومة الكهربائي بناء على أمر من 20 MΩ.
  4. الردم ماصة مع 3 M البوتاسيوم محلول خلات وضعه في حيز صاحب micropipette.
  5. للإلكترود خارج الخلية إعداد ماصة الزجاج الحادة كما هو موضح أعلاه، وكسر غيض مرة أخرى من قبلفرك ماصة حادة أخرى بالقرب من حافة حادة. ثم اطلاق النار تلميع غيض بحيث لا المسيل للدموع أدوات الوصل. سوف أقطاب خارج الخلية البلاستيك أيضا العمل طالما هناك اتصالات جيدة بين القطب والعصب.
  6. إدراج القطب تسجيل خارج الخلية إلى صاحب micropipette (مع سلك حج-CL) التي يتم تركيبها مع أنبوب المطاط وحقنة لشفط. استخدام حقنة لرسم المالحة في القطب على الأقل إلى مستوى السلك الفضة.
  7. إعداد الجهاز (مكبر للصوت والمعزل التحفيز) والمعلمات تسجيل البرنامج عن طريق اتباع دليل لديك وحدة تسجيل إشارة محددة. انظر Leksrisawat وآخرون. 22 لعرض التفاصيل حول المعدات المستخدمة في التجارب المذكورة أدناه.

2. بطني العقدة تشريح

  1. تشريح علقة في سيليكون طبق كبير مبطنة المطاط الصناعي مع حل علقة رينغر. إذا امتدت الحيوان طوليا وسوفيكون من الأسهل لإزالة الحبل البطني العصب (انظر الشكل 1A).
  2. مع # 10 أو # 11 حجم مشرط، وجعل شق طولي مع تخفيضات الضحلة جدا في خط الوسط بطني. حوالي منتصف 2/3rd من قطع بطني هو مبين في الشكل 1B. ليس محاولة لقطع طريق تخزين الأسود (الجيب الدم البطنية) حتى يتم فتح بالكامل الحيوان وامتدت الجيوب الأنفية الدم دون مكامن الخلل. هذه الجيوب الأنفية الدم يمتد على طول هذا الحيوان على طول خط الوسط بطني. يرد VNC داخل هذه الأوعية الدموية.
  3. بعد أن تم قطع الجلد كامل طول الحيوان استخدام مقص القزحية الجميلة إلى نيك الجيب الدم (الشكل 2). تنزلق شفرة واحدة من مقص القزحية الجميلة تحت الجيوب الأنفية وزيادة طفيفة في شفرة لفصلها عن الأنسجة العصبية. قطع الجيوب الأنفية طول VNC مع تجنب الجذور العصبية والأعصاب قطعي، أو أدوات الوصل بين العقد.
  4. المقبل، وإزالة جزء من الحبل البطني العصب بواسطةقطع الجذور البعيدة إلى حيث ينضم إلى الأوعية الدموية الجذور. كرر هذه العملية لكل عقدة على طول الحبل البطني العصب.
  5. نقل جزء من واحد أو اثنين من العقد إلى طبق بتري أصغر. في العقد أو العقدة واحد يحتاج إلى أن يعلق مشدود مع بعض الركود.
  6. دبوس أدوات الوصل والجذور بحيث يتم امتدت غمد العقدة الدبقية قليلا لمنع أجسام الخلايا العصبية من التحرك عندما التخوزق من خلال غمد الدبقية والخلايا العصبية في المصالح. يجب وضع دبابيس من خلال الجيوب الأنفية الأسود عن جذور وفي منتصف أدوات الوصل اثنين لتقليل الضرر من المحاور (الشكل 3).
  7. وضع طبق بتري مع إعداد تحت المجهر وثبته مع الشمع في أسفل الإناء لمنع الحركة.
  8. التركيز بعناية شعاع الضوء باستخدام مرآة ومكثف الضوء على رؤية الخلايا العصبية كما في الشكل 4A (كما هو موضح في الشكل تخطيطي 4B
  9. لجعل تسجيل داخل الخلايا من Rz مشاهدة، T، P، والخلايا العصبية N، وضع بعناية غيض من القطب على خلية من الفائدة وخفض بلطف غيض حتى ينظر إلى الدمل في غمد الدبقية.
  10. اضغط على حامل قطب كهربائي أو مناور (بعناية فائقة) بحيث القطب غيض "الملوثات العضوية الثابتة" في الخلية من الفائدة.
  11. حقن نبضات قصيرة (30-40 ميللي ثانية) من التيار الموجب (1-10 غ) في الخلية لاستحضار إمكانات العمل.

3. زراعة الخلايا العصبية من العقدة إعداد بطني

  1. دبوس الجانب البطني العقد حتى في صحن نظيف تحتوي على L-15 مع مصل العجل الجنين (FCS) (الشكل 3). دبوس الجذور بحيث يتم تمدد العقد قليلا كما فعلت أعلاه للحصول على تسجيلات داخل الخلايا. مع مقص غرامة، نيك الكبسولة الدبقية في نهاية واحدة، والانزلاق مقص شفرة واحدة تحت الكبسولة، ثم قص عبر كبسولة الدبقيةكما هو مبين في الشكل 5A.
  2. إضافة 100 ميكرولتر قسامة من كولاجيناز / Dispase إلى الطبق ومكان على شاكر لمدة 15 دقيقة. فحص الخلايا عن طريق تحريك سائل الإعلام والثقافة حول أجسام الخلايا عرضة للخطر. العودة الخلايا لشاكر لمدة 15 دقيقة أو أكثر أخرى حتى الخلايا يخرج مع الحد الأدنى من الشفط.
  3. استخدام ماصة تعلق على حقنة لاستخراج بلطف الخلايا من العقدة. النار تلميع غيض ماصة بحيث يكون أكبر قليلا من قطر جسم الخلية. لخلايا Rz مشاهدة في علقة الكبار، ينبغي أن يكون قطرها حوالي 50 ميكرون.
  4. إعداد مجموعة متنوعة من الماصات بأقطار مختلفة دون خيوط وهذا يقلل من فرص الخلايا الشائكة داخل ماصة. تخزين ماصات في زجاجة تحتوي على 80٪ من الإيثانول (ETOH) باستخدام القطن الكرة في أسفل لحماية نصائح من التقطيع. تذكر لغسل ETOH من ماصة مع المتوسط ​​قبل الشفط الخلايا.
  5. بعد العلاج الانزيم، تغسلالمتوسطة مع L-15 (مع FCS) 2X التي تحتوي على الانزيم. تحديد الخلايا من الفائدة ورسم لهم بلطف في ماصة عن طريق سحب المحقنة (الشكل 6A). أداء الخلايا يستنشق في طبق آخر والذي يحتوي على L-15 (مع FCS).
  6. حتى الآن، كانت كلها إجراءات غير معقمة. نفذ الخطوات التالية في غطاء العقيمة. وضع 3-4 قطرات كبيرة من معقم L-15 (مع FCS) في مواقع مختلفة داخل طبق بتري معقمة.
  7. ماصة الخلايا في واحدة من قطرات قبل الذكر، وتهب حول لهم في الانخفاض لغسلها. كرر هذا في سلسلة في 3 أو 4 قطرات من المتوسط.
  8. وضع الخلايا في طبق بتري نظيفة مليئة L-15 (مع FCS).
  9. احتضان الخلايا لمدة 1-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك الخلايا النظيفة يمكن مطلي. من خلال ترك الخلايا لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها المصفوفة خارج الخلية يأتي قبالة بسهولة. لوحة الخلايا على الفور لتوليد العمليات لفترة أطول.
  10. استخدام الركيزة العقيمة إلى معطف دي microwell ش واتركه حتى يجف تماما (بين عشية وضحاها) قبل زراعة التجارب.
  11. بعد أن تم المغلفة الطبق، وغسل الطبق برفق مع الماء المعقم وبعد ذلك مع كمية صغيرة من متوسطة L-15. تذكر أن استخدام الحل L-15 دون FCS وأضاف للسماح للخلايا على الانضمام إلى الطبق. وسيلة يمكن تغيير بلطف لL-15 مع FCS بعد انضمت الخلايا إلى الركيزة. إذا كانت الخلايا لاستخدامها بعد ساعات قليلة من الطلاء، ثم التحول على المدى المتوسط ​​إلى L-15 مع FCS ليست ضرورية.
  12. وضع الخلايا بجانب بعضها البعض في وقت والطلاء للحث على synaptogenesis السريع (الشكل 6B). بعد 24 ساعة قياس النشاط الفسيولوجي في أزواج من الخلايا العصبية.
  13. استخدام تقنيات الكهربية داخل الخلايا لتسجيل RP أو ردود متشابك في أزواج مثقف الخلايا (الخلايا العصبية من خلال تحفيز 1 إلكترود وسجل داخل الخلايا الاستجابات من الخلايا المقترنة باستخدام الخلايا القطب 2).
عنوان "> 4. العقدة الجسم إعداد ستريت

  1. دبوس الجانب الظهري علقة أسفل في طبق مبطنة المطاط الصناعي كما هو موضح أعلاه.
  2. دبوس الجلد على جانب واحد مع الجذور على الجانب الآخر من العقدة مقطوعة (7A الشكل، تضخيم في الشكل 7B) أو جعل نافذة على الجانب البطني من علقة أكثر من العقدة (الشكل 7C) مع كل جذور للجسم الجدار سليمة.
  3. بعد الحصول على تسجيل داخل الخلايا مستقرة في واحدة من الخلايا الحسية (T، P، N) استخدام قضيب الزجاج الصغيرة التي تم إطلاق النار مصقول لمسة خفيفة على الجلد في نفس القطاع. إذا كانت الخلايا العصبية التي سجلت من هو الخلية N ثم سوف تحتاج المزيد من الضغوط ليتم تطبيقها على الجلد. في معظم الحالات، سوف الخلية N تستجيب فقط إذا تم مقروص الجلد مع ملاقط. لهذا السبب يجب أن يحاكم هذه الخلايا مشاركة واحدة قد يؤدي إلى تلف الجلد أو تهجير إعادة ترميز داخل الخلايا بواسطة إزعاج إعداد في مثل هذه الطريقة.
  4. ينبغي للمرء أن يكونقادرة على رسم الجلد بسرعة والعقدة مع تفاصيل كافية أن خريطة واحدة حيث تطرق يمكن استخدامها لتحديد مجال تقبلا للعصبون معينة. بعد تسجيل أكبر عدد ممكن من الخلايا T و P ممكن على كلا الجانبين من العقدة محاولة الخلايا N.
  5. من أجل فحص ما إذا كان لديها عمليات الخلايا العصبية الحسية التي تنتقل عبر أدوات الوصل بطريقة أو منقاري الذيلية ومن ثم الخروج جذور في الجزء المجاور للجلد، وأدوات الوصل بين العقد ويمكن خفض وحقول تقبلا إعادة النظر في ما يخص انتشار الكشف. في الأساس واحدة تدرس ما إذا كان هناك أي خسارة في مجال تقبلا.

5. حقن الأصباغ نيون

  1. إعداد العقدة علقة كما هو موضح أعلاه.
  2. ملء مسرى مكروي مع حل لوسيفر الصفراء-CH (3.0٪) وكلوريد الليثيوم (300 ملم).
  3. أسعد واحدة من الخلايا الحسية أو خلايا Rz مشاهدة على الجانب البطني من العقدة كما هو موضحأعلاه.
  4. حقن صبغة في الخلية عن طريق تمرير تيار السلبية (3NA) من خلال القطب لمدة 15 دقيقة. تعيين مدة النبضة إلى 100 ميللي ثانية وتردد إلى 2 هرتز.
  5. تصور الخلايا العصبية مليئة الصبغة التي كتبها مثيرة الصبغة مع مصباح الزئبق وتصفية مجموعة FITC / GFP.

Representative Results

وتتميز تسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية الحسية في العقدة علقة كتبها متميزة آثار الجهد وقتهم هو مبين في الشكل 4C. ويستريح المحتملة غشاء الخلية في الخلايا علقة العقدة صحي هو -45 إلى -60 بالسيارات. إذا الامكانيات هي أصغر (أقل سلبية) ينبغي للمرء تغيير الزجاج الكهربائي، أو إذا كانت المحتملة لا تزال منخفضة، والانتقال إلى مقطع آخر من الحبل العصبية. إمكانات العمل العفوي مع السعة الصغيرة قد يشير إلى أن القطب هو في الخلايا العصبية الحركية. إذا كان هذا يحدث في الجدار العقدة الجسم على حقن الحالية يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية يعصب أي من العضلات لا تزال تعلق على الجلد. الخلايا العصبية الحركية بالطوق نصب (AE) هو على الجانب البطني من العقدة (الشكل 4B)، وأنه سيتسبب للحلقة (التلال أو شرائح) لترتفع من خلال تفعيل العضلات الناصبة بالطوق.

ينبغي حقن الحالية في الخلايا الحسية استحضار إمكانات العملق مع الطول الموجي مميزة هو مبين في الشكل 4C. إذا كان الطول الموجي تبدو مختلفة يمكن أن تكون راجعة إلى الجسر غير متوازن أو التعويض السعة الإزاحة. ينبغي للمرء أن يتشاور دليل الذي يرافق وحدة اكتساب إشارة للحصول على تفاصيل حول كيفية تحقيق التوازن بين الجسر داخل الخلية. لاحظ القطع الأثرية التحفيز في بداية ونهاية البقول الحالية في الشكل 4C. هذه هي الطريقة التي ننظر التحف عند الجسر هو متوازن.

ثقافات الأولية من الخلايا العصبية من العقدة علقة تشكيل نقاط الاشتباك العصبي الكهربائية والكيميائية في الطبق. في البداية الخصائص الكهربائية للخلايا المستزرعة ليست بالضبط نفس كما هي الحال في الجسم الحي. ولكن بعد أيام قليلة من الدوافع لا يمكن تمييزها تقريبا من تلك التي تم تسجيلها في العقدة. ويتجلى هذا في الشكل 6C مع زوج من الخلايا Rz مشاهدة. بعد 7 ساعة في الثقافة واتساع إمكانات متشابك 1-2 بالسيارات. بعد 56 ساعة في الثقافة سيكانت إمكانات naptic أكبر من 10 بالسيارات (آثار الأعلى في الشكل 6C). شكل إمكانات العمل يتغير أيضا بعد 56hr في الثقافة. في ظل ظروف وصفها هذه الخلايا قابلة للبقاء لعدة أيام.

يمكن البرهنة الاتصالات بين الخلايا من خلال تحفيز الجذور العصبية أو أدوات الوصل وتسجيل من الخلايا العصبية في العقدة. تحفيز هذه الأعصاب يولد إمكانات متشابك قوية وإمكانات العمل في خلايا العقدة مختلفة. وسجلت آثار في الشكل 8B من خلية رتزيوس في العقدة التي تم إزالتها من الحيوان ويعلق في طبق. وقد أثار التتبع السوداء من قبل التحفيز دون العتبي تطبيقها مع إلكترود خارج الخلية إلى الضام. زيادة الجهد التحفيز تسبب في خلية لاطلاق النار إمكانات العمل (التتبع الحمراء). الأصباغ أو البيروكسيداز الفجل الفلورسنت يمكن حقنها في هذه الخلايا لدراسة التشكل. تم حقن وسيفر الأصفر إلى Rz مشاهدةالخلايا العصبية عن طريق تمرير تيار كهربائي من خلال السلبية. بديل هو لحقن الصبغة باستخدام نفث من ضغط الهواء. يبين الشكل 9A الصبغة بعد وقت قصير من بدء الحقن. بعد ثلاثين دقيقة الصبغة بالفعل قد تنتشر في جذور الأعصاب (الشكل 9B). نوع من الصبغة يعتمد على التطبيق، وتستخدم الأصباغ الوزن الجزيئي صغيرة مثل التي يمكن أن تمر من خلال تقاطعات الفجوة لتحديد نقاط الاشتباك العصبي الكهربائي.

الشكل 1
الشكل 1. . بطني تشريح علقة (A) هو الحيوان دبس بدقة الجانب بطني حتى في طبق مبطنة المطاط الصناعي مليئة علقة المالحة (B) A شق الضحلة التي تمتد الأمامي: يتكون المحور الخلفي الجانبي فقط إلى خط الوسط لتجنب إتلاف الأعصاب الحبل. الجيب الدم الأسود (والذي إحتوىنانوثانية الحبل البطني العصب) يمكن بسهولة أن ينظر إليها. ملاحظة العقدة يتعرض واحد هو أن البيض مقارنة مع غمد. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. تشريح الجيب السوداء. والأوعية الدموية (السهم) يجب أن تقطع بعناية على جانب واحد لفضح الحبل البطني العصب (سهم مزدوج). ترك شرائح الأوعية الدموية سليمة حول الجذور قطعي لاستخدامها بوصفها مقبض لمعالجة الحبل البطني العصب عند نقل بين تشريح والأطباق تسجيل. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3 الرقم 3. قسم المعزولة من الحبل البطني العصب. التدبيس الحبل البطني العصب بواسطة شظايا الأوعية الدموية المتبقية على جذور وقطعي في نهايات من أدوات الوصل قطعي يعرض العقد للتسجيلات الكهربية. A مشدود تمتد من العقد يسمح احد لرؤية أجسام الخلايا تحديدها وسوف تسمح لاختراق أسهل من غمد الدبقية مع الزجاج الكهربائي حادة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 4
الشكل 4. التشريح الخلوية من العقدة علقة (أ) من الناحية المثالية الخلايا رتزيوس (R) وأجسام الخلايا الكبيرة الأخرى (P الصحافةلدى عودتهم، وسوف T-تعمل باللمس، N-مسبب للألم، AE-بالطوق الناصبة) تكون مرئية بوضوح إذا تم تعيين المجهر والمكثف تضيء بشكل صحيح. (B) عرض تخطيطي من الخلايا في العقدة. سوف الاختلافات الطفيفة في موقع SOMAS تحدث في كل عقدة بسبب كيفية امتدت العقدة ودبس مشدود. إمكانات (C) العمل المسجلة من سوما من هذه الخلايا العصبية لديها الطول الموجي مميزة. وقد أثار هذه المسامير عن طريق حقن الحالية إيجابية في الخلية (نبض مربع تتراكب آثار الجهد من الوقت). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 5
الرقم 5. Desheathing العقدة لإزالة أجسام الخلايا الفردية. (A) وغمد الدبقيةيجب أن تقطع بعناية عبر العقدة لتجنب الخلايا الضارة من الفائدة. الخط الأحمر يشير إلى وجود قطع لتجنب ضرب سوما من الخلايا العصبية Rz مشاهدة. فتح غمد يعطي الإنزيمات الهضمية الوصول إلى مصفوفة الأنسجة الضامة. (B) أجسام الخلايا الصحية انتفاخ الخروج من العقدة بعد أن تم فتح غمد الدبقية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 6
سوف يتم يستنشق الرقم 6. زراعة الخلايا العصبية من العقدة علقة. (A) خلايا من العقدة باستخدام micropipette ونقل إلى صحن يحتوي سائل الإعلام والثقافة. (B) وضع خلايا متعددة بالقرب من بعضها البعض زيادة معدل synaptogenesis بين الخلايا العصبية يمكن تحديدها. هنا ستووقد شكلت النواب اثنين من الخلايا العصبية في المشبك. (C) الخلايا العصبية في الثقافة المعرض خصائص كهربائية مختلفة قليلا. تظهر أعلى آثار إمكانات متشابك أثار من خلال تحفيز الخلايا المجاورة 7 ساعة و 56 ساعة بعد أن تم مطلي الخلايا. وقد أثار آثار أسفل عن طريق حقن الحالي مباشرة إلى واحدة من الخلايا Rz مشاهدة. ملاحظة الزيادة في السعة المحتملة متشابك وتغيير في العمل الموجي المحتملة بعد 56 ساعة في الثقافة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 7
الرقم 7. علقة العقدة الجسم إعداد الجدار لحقول تقبلا رسم الخرائط. (A) نهج واحد هو إزالة قسم كامل من جدار الجسم مع العقد 1-3. هنا جذور على جانب واحد وبوقد يعلق قطع التابعين والعقدة إلى الجانب (B) A معلقة من العقدة في أعلى التكبير. (C) وثمة نهج آخر هو خلق نافذة صغيرة في جدار الجسم وسجل من العقد سليمة حين تعيين حقل تقبلا (DG) كل من الخلايا العصبية الحسية يسلك استجابة مميزة لحافز الميكانيكية. (D) لمسة ضوء يثير النشاط في خلايا T ولكن ليس في خلايا P أو N (E) واستجابة الخلايا T يغلق ردا على أقوى المحفزات، مما يتيح وسيلة لتفعيل الخلية P. كما يحصل التحفيز الخلايا N أقوى يصبح المنشط (FG). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 8
الارقام ..ه 8. النشاط مستدعى في العقدة علقة. التحفيز خارج الخلية من أدوات الوصل يمكن استخدامها لدفع انتقال متشابك في الحبل العصبية. (A) ويتم ذلك عن طريق ربط القطب الشفط إلى واحدة من أدوات الوصل وتطبيق الجهد الصغيرة. القطب الزجاج الحادة (السهم) ويمكن رؤية التخوزق خلية رتزيوس في العقدة. (B) آثار الجهد لمرة وتظهر قطعة أثرية التحفيز تليها متشابك المحتملة (الأسود)، وإمكانات العمل (الحمراء). اضغط هنا لمشاهدة أكبر الصورة .

الرقم 9
الرقم 9. حقن الصبغة في الخلايا العصبية علقة. (A) ويمكن حقن وسيفر الصفراء في سوما عن طريق تمرير ترو الحاليلاف تسجيل مسرى مكروي. ويمكن بعد ذلك مصباح الزئبق وFITC تصفية مجموعة استخدامها لتصور مضان. وقد تنتشر (B) صبغ في Rz مشاهدة محاور حوالي 30 دقيقة بعد الحقن. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

وكان الغرض من هذه المجموعة من التجارب 1) لتعليم ويحمل المبادئ الأساسية للتسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية يمكن تحديدها و2) التعرف على الأشكال المميزة من الإشارات الكهربائية التي يمكن أن تنشأ من هذه الأنواع العصبية معينة باستخدام العلق الكبار. هناك تاريخ غني من التحقيقات باستخدام علقة للتحقيقات العصبية والبحث جار في معالجة مسائل الدوائر العصبية وتنظيم الجينات خلال التنمية، وكذلك خلال إصلاح وتجديد متشابك 10. تعديل العمليات العصبية، لا سيما من خلال مسارات أمين الاحيائية، وقد تم أيضا اتجاه البحوث الناجحة في علقة. بإضافة الدوبامين وكلاء الدوائية الأخرى إلى الجهاز العصبي من خلال محلول ملحي، وقد تبين أن ينظم الشبكات العصبية الدوبامين المشاركة في 23 و أنماط السلوك الحركي للالزحف 24،25 صنع القرار. هذا النهج التجريبي هو المبسطةلو (وغير مكلفة) طريقة لدمج التشكيل في المختبر التدريس، وتعديل التركيبة الأيونية للمحلول ملحي هو وسيلة فعالة لتعليم المعادلات نرنست وغولدمان هودجكين-كاتز.

لتكون ناجحة مع الاستعدادات العقدة فمن المهم أن يكون العقدة مشدود قبل محاولة لكزة سوما مع القطب داخل الخلايا. وإلا فإن سوما سوف تتحرك عند الضغط لأسفل على حزمة الدبقية. بالإضافة إلى ذلك، عندما desheathing العقدة لإزالة الخلايا العصبية للثقافة، وتجنب المنطقة من اهتمام عندما قطع عبر العقدة حتى لا تتضرر SOMAS كما تتم إزالتها. أيضا، الحضانة المفرطة في الإنزيمات قد يؤدي في الخلايا العصبية كونها هشة جدا بحيث لا يمكن إزالتها. أنها تتطلب بعض التجربة والخطأ لتحقيق فترة حضانة مثالية لأن كل دفعة من الانزيمات هي مختلفة قليلا في أعمالهم.

مزيد من التحقيقات لتحسين سائل الإعلام والثقافة يمكن أن تحسن هذه التقنية. فاريالعوامل الأوس، مثل وجود الأنسولين، والسكريات، أو عوامل نمو يمكن دراستها لصيانة أطول من الثقافات. لتحديد ما إذا كان الحفاظ على الخلايا قدرتها على تجميع أجهزة الإرسال، مثل تخليق السيروتونين في الخلايا Rz مشاهدة، وتلطيخ أحمر محايدة يمكن تطبيقها على تسمية العمليات هرمون السيروتونين. الغزو دبقية أيضا إلى النسيج المصاب وتجديد يمكن قياسها كميا بواسطة البقع النووية يوما بعد الاصابة.

على الرغم من أن هذا المستحضر له فوائد عديدة لتقدمه في دراسة التجديد والإصلاح، فضلا عن الدوائر العصبية، وتحديد الدوائية والجزيئية لمختلف أنواع فرعية مستقبلات في نقاط الاشتباك العصبي لم تتميز بشكل كامل. تسلسل مكتبة العلامة أعرب متاح 26، ويجري حاليا تجميع الجينوم الطبية علقة 27، ولكن القيد الرئيسي في علقة مقارنة ببعض الاستعدادات النموذج هو القدرة على تعديل الجينات في الجينوم للانتقائية في أنواع معينة من الخلايا. في الأجنة روقد تناولت الحد له عن طريق حقن الحمض النووي أو الرنا المزدوج الجديلة لتنظيم التعبير الجيني 28. وقد تم مؤخرا استخدام تقنية مدفع الجينات للتعبير عن connexin اللافقارية (innexin) البروتينات في الخلايا العصبية علقة. تعبير عن innexin من العلقة verbana (HVE-inx6) كافية لتشكيل تقاطعات الفجوة خارج الرحم في علقة الطبية 29. علقة أو الطبية H. لويزة كما انها كانت 30 من المؤكد أن تقدم فهمنا للعلم وظائف الأعضاء وتطور من نقاط الاشتباك العصبي الكهربائي على مدى السنوات القليلة المقبلة.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Dow Corning 182 silicone kit
NaCl Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Tris/maleic acid Sigma-Aldrich
Bleach  Sigma-Aldrich To chloride silver wire
NaOH Sigma-Aldrich 221465 To adjust pH
HCl Sigma-Aldrich H1758 To adjust pH
Collagenase/Dispase Boehringer Mannheim 269-638
Leibovitz L-15 with L-Glutamine Gibco 041-01415H
Fetal calf serum Ready Systems Ag
04-001
D-Glucose-Monohydrate Merck 8342
Gentamycin sulfate  any supplier 10 mg/ml
Glutamine Gibco 043-0503H
HEPES Sigma 3375 Free acid, crystalline
Concanavalin A Type IV Sigma C 2010
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma P 7890 MW 15-30,000
 Microwell plate, 60 x 10 μl Falcon 3034 Flat bottom, 10 in a bag
Dissecting tools World Precision Instruments assortment
Intracellular electrode probe
Faraday cage
Insect Pins Fine Science Tools, Inc 26001-60
Dissecting microscope (100X)
Fiber optic lamp
Small adjustable mirror To direct light beam toward the preparation.
Glass electrodes Sigma-Aldrich CLS7095B5X Box of 200, Suction electrodes
Micromanipulator World Precision Instruments MD4-M3-R  Can fix for base or on a metal rod
Raised preparation stand
Silver wire (10/1,000 inch) A-M Systems 782500
Computer any company
AC/DC differential amplifier A-M Systems Model 3000
PowerLab 26T AD Instruments 27T
Head stage AD Instruments Comes with AC/DC amplifier
LabChart7 AD Instruments
Electrical leads any company
Glass tools  make yourself For manipulating nerves
Cable and connectors any company
Pipettes with bulbs  Fisher Scientific 13-711-7 Box of 500
Beakers any company
Wax or modeling clay any company or local stores
Stimulator Grass Instruments SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode local hardware store (Watt’s brand) ¼ inch OD x 0.170 inch ID Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
  2. Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
  3. Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
  4. Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
  5. Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. 1-17 (1990).
  6. Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 217-222 (1992).
  7. Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 236-253 (1989).
  8. Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
  9. Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
  10. Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
  11. Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
  12. Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
  13. Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
  14. Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
  15. Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
  16. Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. McGill University. (1995).
  17. Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
  18. French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
  19. Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
  20. Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
  21. Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
  22. Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
  23. Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
  24. Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
  25. Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
  26. Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
  27. Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
  28. Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
  29. Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
  30. Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف،<i> العلقة الطبية</i
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Titlow, J., Majeed, Z. R., Nicholls, J. G., Cooper, R. L. Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis. J. Vis. Exp. (81), e50631, doi:10.3791/50631 (2013).More

Titlow, J., Majeed, Z. R., Nicholls, J. G., Cooper, R. L. Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis. J. Vis. Exp. (81), e50631, doi:10.3791/50631 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter