Summary
I artikeln beskrivs tre nervsystemet preparat använda blodiglar: intracellulär inspelning från neuroner i ventrala ganglier, odling av nervceller från ventrala ganglier, och spelar in från en lapp av innerveras hud att kart sensoriska områden.
Abstract
Sötvatten igel, Hirudo medicin, är en mångsidig modell organism som har använts för att behandla vetenskapliga frågor inom områdena neurofysiologi, neuroethology, och utvecklingsbiologi. Målet med denna rapport är att konsolidera experimentella tekniker från igel systemet till en enda artikel som kommer att vara till nytta för fysiologer med expertis inom andra nervsystemet preparat, eller till biologi studenter med liten eller ingen elektrofysiologi erfarenhet. Vi visar hur man dissekera blodigel för inspelning intracellulärt från identifierade nervbanor i ganglion. Nästa visar vi hur enskilda celler med känd funktion kan tas bort från ganglion som odlas i en petriskål, och hur du spelar in från dessa nervceller i kultur. Sedan visar vi hur man förbereder en lapp av innerveras skal som ska användas för att kartlägga sensoriska eller motoriska områden. Dessa igel förberedelser fortfarande i stor utsträckning används för att ta itu med grundläggande elektriska egenskaper neural nätverksks, uppförande, synaptogenesis och utveckling. De är också en lämplig utbildningsmodul för neurovetenskap och fysiologi undervisningslaboratorier.
Introduction
Den igel beredningen är användbar för att undersöka funktionen av identifierbar (sensoriska, motoriska och inter-neuroner inom djurets centrala nervsystemet (CNS). Den användbara egenskapen hos blodigel neuroner är att formen på deras verkningspotentialer och biofysikaliska egenskaper är karaktäristiska för en given celltyp (dvs. P, N, T, Rz). Dessutom nervceller kan avlägsnas från djuret och odlas i ett lämpligt medium för cellerna behålla sina elektriska egenskaper så länge som 45 dagar 1,2.
En tydlig fördel med blodigel ganglion för att lära sig att göra elektrofysiologiska inspelningar är att cellerna är karakteristiskt och tillförlitligt arrangerade i ganglion i ett mönster som gör det möjligt att identifiera olika celltyper från ganglion till ganglion och från djur till djur. Den unika läge och morfologi av nervceller i igel ganglier noterades av Retzius redan 1891 3. Kunskap om the identitet och funktion av en neuron är fördelaktig för att utreda nervbanor och för att göra försök med en given celltyp. På grund av den relativt stora somata av neuronerna inom en ganglion de är synliga med ett dissektionsmikroskop och somata selektivt kan spetsas med mikroelektroder för registrering av deras elektriska egenskaper.
Färgämnen och stora molekyler kan injiceras in i individuella celler och kanalegenskaperna som studerats av patch clamp. Jonströmmar som ger upphov till de olika formerna av de karakteristiska aktionspotentialer i olika nervceller har identifierats 4-7. Från undersökningar i mönstret av innervation och förgrening av enskilda nervceller inom CNS, har synapsförbindelser återgivits i kultur med identifierade nervceller 2,8. Studier i akterliket ganglierna har gett insikt i utvecklingen av funktionella kretsar som kan mätas med elektrofysiologi samt med groe djurens beteende studier. Blodigeln CNS har också fungerat som en värdefull förberedelse för att undersöka mekanismer som är involverade med neuronal reparation och förnyelse i hela djuret och i kultur 4-6,9-12.
I däggdjurshjärnor är det en svår uppgift att förklara beteende när det gäller egenskaper och anslutningar för enskilda identifierade nervceller. I princip kan man hoppas att studera mindre komplexa system såsom blodigeln kan bidra till att definiera grundläggande mekanismer som används i högre djur. Anslutningarna som används som ligger bakom en simtur mönster 13,14 och rhythmicity av hjärtat 15 är väl karakteriserade i akterliket. Förmågan hos vissa igel nervceller för att bilda både elektrisk och kemisk kommunikation är spännande. Vissa anslutningar är dubbelriktad medan andra är enkelriktade kemiskt men dubbelriktad elektriskt 7. Förstå synapsförbindelser inom djur och återskapa samma type av anslutningar i en odlingsskål är kraftfulla verktyg för att undersöka synaptogenesis 16-18 samt farmakologisk profilering av synapser 19. De intracellulära inspelning och stimuleringstekniker som beskrivs här ger en grund för farmakologiska analyser och forskning i neuroethology och utveckling.
Dessutom kan den segmentventrala nerv sladd dissekeras med en lapp av innerveras hud. Med möjligheten att hålla en bit hud och nervceller vid liv, kan sensoriska receptiva fält sonderas genom att spela in elektriska signaler från cellkroppen (dvs. soma) av sensoriska neuroner inom respektive buken ganglion i CNS. Därmed kan man bedöma hur känsliga de sensoriska ändelser genom att tillämpa olika grader av kraft på huden och karta receptiva fält: lätt beröring, tryck och skadligt (smärtsam) stimuli 20,21.
En fördel med denna igel ganglion-hudpreparat är att en can dra anatomiskt den receptiva fältkartan och spåra neuronala processerna till den identifierade neuron när de elektriska svaren spelas in. De tre leech experiment som beskrivs nedan kan alla fyllas flera gånger med ett enda prov, vilket gör detta till en kostnadseffektiv undervisning modul för akademiska laboratorier.
Protocol
1. Framställning av elektroder och saltlösning
- Förbered fysiologisk saltlösning och elektroder innan djuret dissekeras. Leech Ringers lösning består av följande: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / maleinsyra eller HEPES. Justera pH till 7,4.
- Bered en Ag-Cl tråd genom att doppa en rengjorda silvertråden i en liten mängd blekmedel under 20 min eller till dess att tråden har en jämn mörkgrå yta. Tvätta tråd med destillerat vatten före användning. Placera sedan tråden i en mikropipett hållare som ansluts till förstärkaren.
- Förbered en kraftig glaselektrod av borosilikatglas med en pipett avdragare. Elektrod resistans skall vara i storleksordningen 20 Mohm.
- Återfyllning pipetten med 3 M kaliumacetat-lösning och för in i in i mikropipetten hållaren.
- För ett extracellulärt elektrod förbereda en skarp glas pipett som beskrivits ovan, bryta spetsen tillbakagnugga en annan skarp pipetten nära den skarpa kanten. Sedan eld polera spetsen så att den inte riva konnektiv. Plastcellulära elektroder kommer även att arbeta så länge som det finns god kontakt mellan elektroden och nerven.
- Sätt i extracellulära inspelning elektroden i en mikropipett hållaren (med Ag-Cl tråd) som är försedd med en gummislang och spruta för sugning. Använd sprutan för att dra saltlösning i elektrod åtminstone till nivån av silvertråden.
- Ställa in maskinvaran (förstärkare och stimulans isolator) och programvara inspelningsparametrarna genom att följa bruksanvisningen för din specifika signalinspelningsenhet. Se Leksrisawat et al. 22 för att visa information om utrustning som används i de experiment som beskrivs nedan.
2. Ventral Ganglion Dissection
- Dissekera blodigel i en stor silikonelastomer fodrad skålen med igel Ringers lösning. Om djuret är utsträckt på längden kommer det attvara lättare att ta bort den ventrala nerv sladd (se figur 1 A).
- Med # 10 eller # 11 storleks skalpell görs en längsgående snitt med mycket grunt nedskärningar i den ventrala mittlinjen. Om mitt 2/3rd av den ventrala snitt visas i figur 1B. Försök inte att skära igenom den svarta strumpan (den ventrala blod sinus) till dess att djuret är helt öppet och blodet sinus sträcks utan veck. Detta blod sinus löper längs djuret längs den ventrala mittlinjen. VNC finns inuti denna blodkärl.
- När huden har skurits hela längden av djuret använda de fina iris sax till nick blod sinus (Figur 2). Slip ett blad av de fina iris sax under sinus och något höja bladet för att skilja den från nervvävnad. Skär sinus längden av VNC samtidigt undvika nervrötterna, segmentella nerver, eller de konnektiv mellan ganglierna.
- Ta sedan bort en del av den ventrala nerv sladd medskära rötterna distalt där blodkärlet förenar rötterna. Upprepa processen för varje ganglion längs den ventrala nerv sladd.
- Överför ett segment av en eller två ganglier till en mindre petriskål. Den ganglierna eller enda ganglion måste nålas spända med lite slack.
- Nåla konnektiv och rötterna så ganglion gliaceller slida är något utsträckt för att förhindra att neuroncellkroppar från att flytta runt när spetsa genom gliaceller slidan och in i neuronen av intresse. Stiften skall placeras genom den svarta sinus för rötterna och i mitten av de två konnektiv att minimera skada på axoner (Figur 3).
- Placera petriskål med förberedelser under mikroskop och säkras med vax i botten av skålen för att förhindra rörelser.
- Inriktas försiktigt ljusstrålen med hjälp av en spegel och belysnings kondensor visa nervceller som i figur 4A (som schematiskt visas i figur 4B
- För att göra en intracellulär inspelning av Rz, T, P och N neuroner försiktigt placera spetsen hos elektroden över cellen av intresse och att försiktigt sänka spetsen tills en grop ses i glia mantel.
- Knacka på elektrodhållaren eller manipulator (mycket noggrant), så att elektrodspetsen "poppar" in i cellen av intresse.
- Injicera korta pulser (30-40 ms) av positiv ström (1-10 nA) in i cellen för att framkalla aktionspotentialer.
3. Odling nervceller från den ventrala ganglion Förberedelse
- Klämma ganglierna ventrala sidan uppåt i en ren skål innehållande L-15 med fetalt kalvserum (FCS) (Figur 3). Nåla rötterna så att ganglierna är något utsträckt som görs ovan för intracellulära inspelningar. Med fina saxar, nick gliaceller kapseln i ena änden, sätt en sax blad under kapseln, skär sedan över gliaceller kapselnsåsom visas i fig. 5A.
- Tillsätt 100 ul alikvot av kollagenas / Dispase till skålen och placera på en shaker i 15 min. Undersök cellerna genom att flytta odlingsmedia runt de exponerade cellkropparna. Återgå cellerna till shaker för en annan 15 minuter eller längre tills cellerna kommer ut med minimal sug.
- Använd en pipett fäst vid en spruta för att försiktigt extrahera celler från ganglion. Brand polera pipettspetsen så att det är något större än cellkroppen diameter. För Rz celler i en vuxen igel, bör diametern vara ca 50 um.
- Förbered en mängd pipetter med olika diametrar utan en glödtråd som det minskar risken för att cellerna fastnar inne i pipetten. Förvara pipetterna i en flaska som innehåller 80% etanol (EtOH) med hjälp av en bomullstuss i botten för att skydda tips från flisning. Kom ihåg att tvätta EtOH ur pipetten med mediet innan aspirera celler.
- Efter enzymbehandlingen, tvätta urenzyminnehållande medium med L-15 (med FCS) 2x. Identifiera cellerna av intresse och försiktigt dra dem in i pipetten genom att dra sprutan (Figur 6A). Ladda ur de aspirerade cellerna i en annan skål som innehåller L-15 (med FCS).
- Fram till nu har alla förfaranden som var icke-steril. Utför följande steg i en steril huva. Placera 3-4 stora droppar av steril L-15 (med FCS) på olika platser inne i en steril petriskål.
- Pipettera cellerna i en av de tidigare nämnda droppar, blåser dem runt i drop för att tvätta dem. Upprepa detta i serie i tre eller fyra droppar av medium.
- Placera cellerna i en ren petriskål fylld med L-15 (med FCS).
- Inkubera cellerna under 1-24 timmar vid rumstemperatur. Efteråt de rena celler kan pläteras. Genom att lämna cellerna i ett par timmar eller över natten den extracellulära matrisen lossnar lätt. Plate cellerna omedelbart generera längre processer.
- Använd sterila substrat att belägga en mikro di sh och låt den torka ordentligt (över natten) innan odling experiment.
- Efter det att skålen har belagts, tvätta skålen försiktigt med sterilt vatten och därefter med en liten mängd av det L-15 medium. Kom ihåg att använda L-15 lösning utan FCS tillsättes för att tillåta cellerna att vidhäfta till skålen. Mediet kan försiktigt ändrades till L-15 med FCS efter att cellerna har vidhäftat till substratet. Om cellerna skall användas ett par timmar efter utstrykning, sedan byta mediet till L-15 med FCS är inte nödvändigt.
- Placera cellerna bredvid varandra vid tidpunkten för plätering för att inducera snabb synaptogenes (Figur 6B). Efter 24 timmar åtgärd fysiologisk aktivitet i pair av nervceller.
- Använd intracellulära elektrofysiologiska metoder för att spela RP eller synaptiska svar i odlade par av celler (stimulera 1 neuron genom en intracellulär elektrod och spela in svar från den parade cellen med hjälp av en 2: a intracellulär elektrod).
- Klämma blodigeln ryggsidan nedåt i en elast-fodrade skål som beskrivits ovan.
- Nåla huden på ena sidan med rötter på andra sidan av den avhuggna ganglion (Figur 7A, förstorat i figur 7B) eller göra ett fönster på den ventrala aspekten av igel över en ganglion (figur 7C) med alla rötter i kroppen vägg intakt.
- Efter att ha fått en stabil intracellulär inspelning i en av de sinnesceller (T, P, N) använder en liten glasstav som har eld polerat att nuddar huden i samma segment. Om neuronen som spelas in från är en N cell då mer tryck måste appliceras på huden. I de flesta fall kommer det N cellen bara svara om huden är klämd med pincett. Av denna anledning är dessa celler bör prövas sist som en kan skada huden eller förskjuta den intracellulära omkodning genom att störa framställningen på ett sådant sätt.
- Man bör varakunna snabbt skissa huden och ganglion med detaljer tillräcklig nog att en karta över var en beröring kan användas för att bestämma det receptiva fält för en speciell neuron. Efter inspelning från så många T och P-celler som möjligt på båda sidor av ett ganglion prova N-celler.
- För att undersöka om de sensoriska nervceller har processer som färdas genom konnektiv i en rostralt eller svans sätt och sedan ut rötterna i det angränsande segmentet på huden, kan de konnektiv mellan ganglier kapas och de receptiva fält omprövas i avseende på spridningen av detektion. I grund och botten en undersöker om det skett någon förlust i den receptiva fält.
5. Injektion av fluorescerande färgämnen
- Förbered en igel ganglion som beskrivits ovan.
- Fyll en mikroelektrod med en lösning av Lucifer Yellow-CH (3,0%) och litiumklorid (300 mM).
- Impale en av de sensoriska celler eller Rz celler på den ventrala sidan av ganglion, såsom beskrivitsovan.
- Injicera färgämne in i cellen genom att leda negativ ström (3Na) genom elektroden för 15 min. Ställ pulslängden till 100 msek och frekvensen till 2 Hz.
- Visualisera de färgämnesfyllda nervceller genom spännande färgen med en kvicksilverlampa och en FITC / GFP filter set.
Representative Results
Intracellulära inspelningar från sensoriska neuroner i akterliket ganglion kännetecknas av sin distinkta spänning-time spår som visas i figur 4C. Den vilande cellmembranpotentialen hos friska blodigel ganglieceller är -45 till -60 mV. Om potentialer är mindre (mindre negativ) man bör byta glaselektrod, eller om potentialen är fortfarande låg, gå vidare till ett annat segment av nerven sladden. Spontana aktionspotentialer med liten amplitud kan tyda på att elektroden är i ett motorneuron. Om detta händer i ganglion-kroppsväggen en ströminjektion kan användas för att bestämma om neuronen innerverar alla de muskler fortfarande fäst till huden. Ringen Erector motor neuron (AE) är på den ventrala sidan av ganglion (Figur 4B) och det kommer att leda till att ringarna (åsar eller segment) för att stiga genom att aktivera ring erector muskeln.
Att injicera ström in i de sensoriska celler bör framkalla aktionspotentials med de karakteristiska vågformerna som visas i figur 4C. Om vågformerna ser olika det kan bero på en obalanserad bro eller offset kapacitans ersättning. Man bör konsultera manualen som följer med signalförvärvsenheten för information om hur man balanserar bron inne i en cell. Lägg märke till de stimulans artefakter i början och slutet av strömpulserna i figur 4C. Detta är hur de artefakter ser när bryggan är balanserad.
Primära kulturer av nervceller från akterliket ganglion bildas elektriska och kemiska synapser i skålen. Initialt de elektriska egenskaperna hos de odlade cellerna inte är exakt desamma som de är in vivo. Men efter några dagar impulserna är nästan omöjlig att skilja från de som registrerats i ganglion. Detta visas i figur 6C med ett par Rz celler. Efter 7 timmar i kultur amplituden för synaptiska potentialer var 1-2 mV. Efter 56 timmar i kultur synaptic potentialerna var större än 10 mV (översta spår i fig 6C). Formen på aktionspotentialen ändras även efter 56hr i kultur. Under de betingelser som beskrivs dessa celler är livskraftiga under flera dagar.
Intercellulära kommunikationen kan påvisas genom att stimulera nervrötter eller konnektiv och inspelning från nervceller i ganglion. Att stimulera dessa nerver genererar robusta synaptiska potentialer och aktionspotentialer i olika ganglion celler. Spår i figur 8B registrerades från en Retzius cell i ett ganglion som hade tagits bort från djuret och nålas i en skål. Den svarta kurvan var framkallade av en subthreshold stimulans appliceras med ett extracellulärt elektrod i bind. En ökning av stimulus spänning orsakad cellen att avfyra en aktionspotential (röd linje). Fluorescerande färgämnen eller pepparrotsperoxidas kan injiceras in i dessa celler för att studera deras morfologi. Lucifer gul injicerades i en Rzneuron genom att en negativ ström genom elektroden. Ett alternativ är att injicera färgämnet med användning puffar av lufttrycket. Figur 9A visar färgämnet kort efter injektion började. Trettio minuter senare färgämnet redan hade diffunderat in i nervrötterna (fig 9b). Den typ av färgämne beror på tillämpningen, t.ex. små molekylvikt färgämnen som kan passera genom gap junctions används för att identifiera elektriska synapser.
Figur 1. . Ventrala igel dissektion (A) Djuret är ordentligt nålas ventrala sidan uppåt i en elastomer-fodrade skål fylld med blodigel saltlösning (B) Ett grunt snitt som spänner över den främre. Bakre axel görs bara i sidled med mittlinjen för att undvika skador på nerven sladd. Den svart blod sinus (vilket behållarenns den ventrala nerv sladd) kan lätt ses. Notera den exponerade ganglion som är vit jämfört med slida. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Dissekering av den svarta sinus. Blodkärlet (pil) bör noggrant skära på ena sidan för att exponera den ventrala nerven sladden (dubbel pil). Lämna segment av blodkärl intakta runt segment rötter för användning som ett handtag för att manipulera den ventrala nerv sladd vid överföring mellan dissektion och inspelning rätter. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Isolerad sektion av den ventrala nervsträngen. Nålning den ventrala nerven sladden genom blodkärls fragmenten kvarvarande på segmentell rötter och vid ändarna av de segment konnektiv exponerar ganglierna för elektrofysiologiska inspelningar. En spänd sträckning av ganglierna gör att man kan se de identifierbara cellkroppar och gör att en lättare penetrering av gliaceller slida med en vass glaselektrod. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Cellular anatomi blodigel ganglion. (A) Helst Retzius celler (R) och andra stora cellkroppar (P-pressure, kommer T-touch, N-nociceptiv, AE-ringen erector) synas tydligt om mikroskopet och lätta kylare är korrekt inställda. (B) Schematisk bild av celler i ganglion. Mindre skillnader i placeringen av de SOMAS kommer att inträffa i varje ganglion på grund av hur den ganglion sträcks och nålas spänd. (C) Aktionspotentialer som spelats in från soma av dessa neuroner har karakteristiska vågformer. Dessa spikar har framkallat genom att injicera positiv ström in i cellen (fyrkantig puls ligger över den spänning-time spår). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Desheathing ganglion för att stryka enskilda cellkroppar. (A) Den gliaceller slidabör klippas försiktigt över ganglion att undvika skadliga celler av intresse. Den röda linjen visar ett snitt för att undvika att slå i soma av Rz nervceller. Att öppna höljet ger matsmältningsenzymer tillgång till bindvävsmatrisen. (B) Friska cellkroppar utbuktning av ganglion efter gliaceller skidan har öppnats. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Odling neuroner från blodigeln ganglion. (A) Celler sugs från ganglion med användning av en mikropipett och överförs till en skål innehållande odlingsmediet. (B) placering av multipla celler i närheten av en annan kommer att öka graden av synaptogenesis mellan identifierbara nervceller. Här stumps av två nervceller har bildat en synaps. (C) nervceller i kultur uppvisar något olika elektriska egenskaper. De övre spåren visar synaptiska potentialer framkallade genom stimulering av den intilliggande cellen 7 h och 56 h efter det att cellerna ströks ut. Botten spåren var framkallade genom att injicera ström direkt in i en av Rz cellerna. Notera ökningen av synaptiska potentialen amplitud och ändra i åtgärden potentiella vågform efter 56 timmar i kultur. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Den igel ganglion-kroppen väggen förberedelse för kartläggning receptiva fält. (A) Ett sätt är att ta bort en hel del av kroppen väggen längs med 1-3 ganglierna. Här rötterna på ena sidan har been klippa och ganglion har knutits ut åt sidan. (B) A nålas ut ganglion vid högre förstoring. (C) En annan metod är att skapa ett litet fönster i kroppen väggen och spela in från den intakta ganglierna samtidigt kartlägga en receptiva fält . (GD) Var och en av de sensoriska neuroner uppvisar en karakteristisk respons på ett mekaniskt stimulus. (D) en lätt beröring framkallar aktivitet i T-celler, men inte i P eller N-celler. (E) T-cellssvaret stängs av som svar på starkare stimuli, ger vika för aktivering av P cellen. Som stimulans blir starkare N celler blir aktiverade (FG). Klicka här för att visa en större bild .
Figure 8. Evoked aktivitet i akterliket ganglion. Extracellulär stimulering av konnektiv kan användas för att driva synaptisk transmission i nerven sladden. (A) Detta görs genom att ansluta en sug elektrod till en av de konnektiv och applicera en liten spänning. Den kraftiga glaselektrod (pil) syns spetsa en Retzius cell i ganglion. (B) Spänning-time spår som visar den stimulans artefakt följt av en synaptisk potential (svart) och en aktionspotential (röd). Klicka här för att visa en större image .
Figur 9. Att injicera färgämnet i leech neuroner. (A) Lucifer Yellow kan injiceras i soma genom att leda ström through inspelningsmikroelektrod. En kvicksilverlampa och FITC-filter set kan sedan användas för att visualisera fluorescens. (B) Dye har spritt in i Rz Axoner ca 30 min efter injektionen. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Syftet med denna uppsättning experiment var 1) att lära och ställa ut de grundläggande principerna för intracellulära inspelningar från identifierbara nervceller och 2) för att känna igen de karakteristiska former av elektriska signaler som kan uppstå just dessa neuronala typer med hjälp av vuxna blodiglar. Det finns en rik historia av undersökningar med hjälp av blodigel för neurofysiologiska undersökningar och forskning pågår för att ta itu frågor av neurala kretsar och genreglering under utveckling och under synaptiska reparation och förnyelse 10. Neuromodulering, särskilt genom biogena amin vägar, har också varit en framgångsrik forskning riktning i akterliket. Genom att lägga till dopamin och andra farmakologiska medel till nervsystemet genom koksaltlösning, har det visat sig att dopamin modulerar neurala nätverk som är inblandade i beslutsfattandet 23 och motoriska mönster för krypande beteende 24,25. Denna experimentella metod är en simple (och billigt) sätt att införliva modulation i undervisningen laboratorium, och justera den joniska makeupen av koksaltlösning är ett effektivt sätt att lära Nernsts och Goldman-Hodgkin-Katz ekvationer.
För att lyckas med ganglion preparat är det viktigt att ha ganglion sträckt innan du försöker peta en soma med en intracellulär elektrod. Annars soma rör sig när man trycker ner på gliaceller paketet. Dessutom, när desheathing ganglion för borttagning av nervceller för kultur, undvika regionen av intresse när man skär igenom ganglion så SOMAS inte skadas när de tas bort. Dessutom kan överdriven inkubation i de enzymer resultera i neuronerna att vara alltför sköra för att tas bort. Det kräver lite trial and error för att uppnå en perfekt inkubationstid eftersom varje sats av enzymer är något annorlunda i sina handlingar.
Ytterligare undersökningar för att optimera odlingsmedia skulle kunna förbättra denna teknik. Varikunde undersökas OU faktorer, såsom närvaro av insulin, socker eller tillväxtfaktorer för längre underhåll av kulturer. För att avgöra om cellerna behålla sin förmåga att syntetisera sändare, till exempel serotonin syntes i Rz celler, kan neutral röd färgning användas för att märka serotonerga processer. Också microglial invasion till skadade och regenerera vävnad kan kvantifieras genom nukleära fläckar dagar efter en skada.
Även om detta preparat har många fördelar att erbjuda för att undersöka förnyelse och reparation samt neurala kretsar, den farmakologiska och molekylära identifiering av de olika receptorsubtyper vid synapser har inte fullt karakteriserats. En uttryckt sekvens tag bibliotek är tillgängligt 26 och den medicinska blodigeln genomet närvarande monteras 27, men den största begränsningen i igel jämfört med vissa modell förberedelser är förmågan att ändra arvsmassan för selektiva gener i specifika celltyper. I embryon tsin begränsning har tagits upp genom att injicera DNA eller dsRNA att reglera genuttrycket 28. Den genkanon teknik har nyligen använts för att uttrycka invertebrate connexin (innexin) proteiner i blodigel neuroner. Expression av en innexin från Hirudo verbana (Hve-inx6) är tillräcklig för bildningen av ektopiska gap junctions i läkemedlet akterlik 29. Läkemedlet igel-eller H. verbena så att säga 30 är säker på att förbättra vår förståelse av fysiologi och utveckling av elektriska synapser under de närmaste åren.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
