Temporal Kvantifiering av MAPK inducerat uttryck i Single jästceller
Summary
Två kompletterande metoder baserade på flödescytometri och mikroskopi presenteras som möjliggör kvantifiering vid singelcellnivå, av dynamiken i genexpression som induceras av aktiveringen av en MAPK-reaktionsvägen i jäst.
Abstract
Kvantifieringen av genuttryck vid den enda cellnivå avslöjar nya regleringsmekanismer skyms i mätningar som utförs på befolkningsnivå. Två metoder baserade på mikroskopi och flödescytometri presenteras för att visa hur sådana uppgifter kan förvärvas. Expressionen av en fluorescerande reporter induceras vid aktivering av hög osmolaritet glycerol MAPK-vägen i jäst används som ett exempel. De specifika fördelarna med varje metod är markerade. Flödescytometri mäter ett stort antal celler (10000) och ger ett direkt mått på dynamiken av proteinexpression som är oberoende av den långsamma mognads kinetiken för det fluorescerande proteinet. Avbildning av levande celler genom mikroskopi är däremot begränsad till mätningen av den mognade formen av reportern i färre celler. Däremot kan de datamängder som genereras av denna teknik vara extremt rika tack vare en kombination av flera reportrar och till den rumsliga och tidsmässiga uppgiftererhållas från enskilda celler. Kombinationen av dessa två mätmetoder kan ge nya insikter om regleringen av proteinuttryck genom signalvägar.
Introduction
Signalering via transduktion kaskader ofta kulminerar i uttrycket av proteiner. Karakteriseringen av detta uttryck profil är en viktig del i att förstå funktionen av biologiska banor. Identifieringen av det spektrum av uppreglerad proteiner och dynamiken av deras aktivering kan åstadkommas genom olika tekniker, såsom mikro-arrayer, Northern blöts eller Western blöts 1-3. Emellertid är dessa tekniker i genomsnitt svaret hos en hel population av celler. För att förstå den fina regleringen av uttrycket av proteiner, är det önskvärt att samla mätningar vid enkelcellnivå. Helst bör dessa mätningar också ge kvantitativa data som kan bli föremål för att utveckla matematiska modeller av den underliggande vägen.
Mikroskopi och flödescytometri är två tekniker, som är idealiska för att leverera sådana kvantitativa mätningar encelliga. Den endogena märkning av proteiner med ett fluorescerande protein kan be för att kvantifiera deras uttrycksnivå 4. Eftersom tillsatsen av ett stort fluorescerande grupp vid änden av proteinet kan göra det icke-funktionella, är det ofta mer önskvärt att generera specifika expressions reportrar baserade på en promotor för att driva expression av en fluorescerande konstrukt. Detta reporter protein är exogena till det mobilnät och därför inte påverka signal händelser som äger rum i cellen.
Både mikroskopi och flödescytometri har ofta används inom området jäst signalering. Som exempel; Colman-Lerner och medarbetare korrelerade, i enskilda celler, expressionen av parning specifika och konstitutivt uttryckta reportrar genom mikroskopi för att kvantifiera buller i jästparande signaltransduktion kaskad 5, Acar och kollegor använt flödescytometri för att studera reglerande nätverk kontrollera uttrycket av GAL generna 6. I en tidigare studie 7, har vi använt en combinatiden av dessa två tekniker för att studera uttrycket ut från den höga osmolaritet glycerol (HOG) bana i spirande jäst. Denna mitogen aktiverat proteinkinas (MAPK) vägen utlöses av hyper-osmotisk stress. Det resulterar i aktiveringen av MAPK Hog1 som translokeras till cellkärnan för att inducera en transkriptionsprogram som resulterar i expression av ca 300 gener. För att studera denna process har vi konstruerat en expressions reporter baserad på STL1 promotorn (en gen induceras specifikt som svar på Hog1 aktivitet 8) som driver uttrycket av en fyrdubbel Venus fluorescerande protein (p STL1-qV). Flödescytometri mätningar avslöjade närvaron av två populationer av celler på mellanspänningsnivå (0,1 M NaCl) med endast en del av befolkningen som uttrycker fluorescerande reporter. Vi använde mikroskopi för att ytterligare undersöka detta beteende och upptäckte att detta brus i proteinuttryck styrdes av inneboende faktorer 9. Vi could vidare konstatera att celler med en liknande nivå av Hog1 aktivitet skulle visa påfallande olika uttrycks utfall. Kombinationen av dessa två tekniker tillät oss att visa hur den långsamma ombyggnad stressresponsgener påverkade uttrycket utfallet på enskild cellnivå 7.
I detta dokument använder vi uttrycket av p STL1-qV reporter inducerad av hyper-osmotisk chock som ett exempel på en kvantifiering av proteinuttryck genom mikroskopi och flödescytometri. Samma stam utsattes för 0,2 M NaCl spänningen studerades med båda teknikerna. Detta ger oss möjlighet att lyfta fram några viktiga skillnader mellan dessa två mycket kompletterande tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi
Behandlingen av brunnen med ConA är ett viktigt steg för att säkerställa en korrekt avbildning av cellerna. Eftersom ConA har låg löslighet i PBS (5 mg / ml), gör det möjligt för filtreringsprocessen att avlägsna stora aggregat som är närvarande i den ofiltrerade lösning och interfererar med avbildning. Celler fäster relativt starkt till den behandlade ytan och tillsatsen av det inducerande lösningen bör inte störa lokaliseringen av cellerna, vilket möjliggör en ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Matthias Peter och hans grupp vid institutionen för biokemi vid ETH i Zürich, där dessa metoder har utvecklats. Detta arbete har fått stöd av den schweiziska National Science Foundation.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
