에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

Summary

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

Abstract

사용하여 시험 관내 모델에서 인간의 기본 상피 세포가 미생물 감염이나 흡입 제제의 맥락에서 호흡기 상피 세포의 주요 기능을 이해하는데 필수적이다. 병에 걸린 집단에서 얻은 세포의 직접 비교는 우리가 서로 다른 표현형을 특성화하고 상피 세포의 기능의 변화를 매개하는 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 인간 기관지 영역에서 상피 세포를 배양하는 것은 잘 설명 하였지만, 기관지 브러쉬 생검 획득과 관련된 인간 폐 조직 또는 침입의 가용성에 의해 제한된다. 비강 상피 세포가 훨씬 덜 침습적 피상적 인 코 부스러기 생검을 통해 얻은 및 과목은 유의 한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있습니다. 또한, 코 호흡 기계에 엔트리 포인트이고, 따라서 이러한 미생물 제제로서 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나, 오염 물질, 또는 알레르기.

간단히, 인간 지원자로부터 얻어진 비강 상피 세포를 코팅 조직 배양 플레이트 상에 전개 한 후 세포 배양 인서트 상에 전사된다. 포화 상태에 도달하면, 세포가 더 중요한 생리 학적 조건을 만들어 여러 주에 대해, 공기 – 액체 계면 (ALI) 배양 계속. ALI 배양 조건은 생산 섬모와 점액 양 세포와 인간의 비강 상피 세포와 유사한 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 차별화 된 상피 세포로 이어지는 정의 미디어를 사용합니다. 차별화 된 비강 상피 세포와 조직 문화 삽입은 연구 질문 (되는 약물 치료, 렌티 바이러스 벡터, 가스에 노출, 또는 미생물 제제와 감염 전달)에 따라 다양한 방법으로 조작 및 이르기까지 수많은 다른 엔드 포인트에 대해 분석 할 수 있습니다 세포 및 분자 경로, 기능 채널제스, 형태 등

차별화 된 인간의 비강 상피 세포의 체외 모델에서 크게 생체 내에서 비강 상피 세포를 모방하는의 Organotypic 실험 모델을 사용하여 새로운 중요한 연구 문제를 해결하기 위해 조사를 가능하게 할 것이다.

Introduction

기술의 목표

기도의 상피 세포 (내피)은 직접적 병원균, 알레르기 또는 대기 오염 물질로 흡입 환경 스트레스에 노출되는 최초의 사이트 중입니다. 내피는 구조적인 장벽보다 더 : 그들은 수용성 매개체 ^4-6 자신의 계면 ^7-9 리간드 / 수용체의 발현의 출시를 통해 호흡기 면역 반응 ^1-3을 시작하고 조절하는 스위치 역할을합니다. 불멸화 세포주가 시험 관내에서 내피 호흡을 연구 모델로서 사용될 수 있지만, 이들은 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 편광 섬모 점액 생산 세포로 구성된 이종 세포 집단으로 분화하는 데 실패한다. 생체 내에서 관찰 호흡기 상피의 중요한 특성을 다시 요약 차기도 EC에 사용할 수있다. 따라서, 우리의 목표는 비강되는 EC (NECs)를 이용하여 우리의 방법을 최적화 할 수 있었다 지원자로부터 얻어진. NECs은 생체 내에서 볼 수있는 비강 상피의 많은 기능을 모방 차별화 NECs의 세포 배양 모델을 산출, 체외에서 확장 배양된다.

이론적 해석

생체 내 상황을 흉내 낸 인간의 기본 내피와 체외 모델의 사용은 -이 연구에 설명 된대로 – 질병의 EC의 특정 차이기도 상피 세포와 관련된 생리 학적 매개 변수 또는 내피와 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하는 독특한 가능성을 제공합니다 이러한 수지상 세포 ^{10 개,} 자연 살해 세포 ⁽¹¹⁾ 또는 대 식세포. 기존의 여러 방법이 bronchoscopies 동안 브러시 생검을 통해 침습적으로 얻을, 또는 그렇지 않으면 폐기 폐 조직 ^12-17에서 할 수있는 기관지 내피를 사용합니다. 또한, 완전히 차별화 된 인간기도 상피 세포 배양을 얻기 위해 상용 소스는 MatTek, 애쉬 랜드, MA, 클론 틱스에서 (EpiAirway 모델이 존재수사관이 다른 기증자를 선택할 수 있습니다 론자, 바젤, 스위스, Epithelix 사스에서 MucilAir, 스위스 제네바)에서. 그러나, 제한된 시판 상피 세포, 또는 파라미터의 소정 세트의 제한된 풀 중에서, 시판 차 인간기도되는 EC 획득과 관련된 비용 및 폐기 폐 조직 또는 갓 얻어진 인간 기관지 생검 조직에 제한된 액세스는 많은 연구자 금지 완전히 차별화 된 인간의기도 내피에서 연구를 수행하십시오. 따라서, 우리는 1) 비 침습적으로 얻을 인간 NECs을 이용 2) 차별화 된 인간기도 상피 세포의 문화를 산출하는 프로토콜을 제공하고, 3) 기존의 조직 문화 인프라와 대부분의 실험실 설정에서 재현 할 것이다 기술을 개발하기 위해 밖으로 설정합니다.

기존 기술 / 모델에 비해 장점

신선한 NECs을 획득, 기관지 또는 작은기도의 EC에 비해 훨씬 적게 침략, 개성적의 때 심각한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있고, 표면 코 부스러기 생검 그렇지 않으면 연구 관련 bronchoscopies 필요하지 것이다 병에 걸린 집단에 실시 할 수 있습니다. NECs을 얻기 침습 피상적 크레이프 생검 조사가 수행되는 연구 목적에 따라 등 연령, 성별, 질병 상태, 등, 도너 사양에게 선험적으로 설정하는 것을 허용한다. 조사 연구를 설계 할 때 따라서, 연구자는 상업 벤더, 또는 디자인 침략 기관지 연구에서 고가의 차별화 된 세포 배양 모델을 구입, 임상 적으로 사용 가능한 조직 / 상피 표본에 의해 제한되지 않습니다. 또, NECs를 얻기 쉽게 관찰 결과의 통계적 유효성을 강화하는 다른 공여자로부터 세포에서 실험을 수행 할 수있는 능력을 증가시킨다. 마지막으로, 코 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나이다. 따라서,에서의 Organotypic를 생성비강 상피를 흉내 체외 배양 시스템은 쉽게 세포 배양 시스템을 사용하여 달성 될 수있는 바이러스 입자, 오염 물질, 알레르겐, 또는 가스의 흡입을 연구하는데 유용하다.

Protocol

1. 플라스틱 구조물을 준비 코트 플레이트 12 – 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL의 PureCol (1:100은 멸균 수로 희석)를 추가합니다. 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다, PureCol을 제거하고 세포가 플레이트에 추가하기 전에 HBSS의 권리와 린스 (아래 단계 3.1 참조). 2. 획득 및 인간 NECs의 전처리 생검 코 부스러기 생검 검경과 운영 이경에 9…

Representative Results

NECs는 여기에 설명 된 프로토콜은 생체 내 상황 (그림 1)를 나타내는 섬모와 비 섬모 세포로 구성되는 EC의 유형이 다른 층으로 다시 구분 다음 배양. 차별화 된 NECs 중 일부는 (AB / PAS, 그림 1B를 사용하여 파란색으로 염색 세포)를 생산하는 점액이다. 여기에 제시된 프로토콜 최적화 되더라도, 분화는 전체적인 세포 집단 (점액 생산 세포 : 섬모 세포 즉 상이한 …

Discussion

호흡의 EC는 외생 적 자극 ^{(20)로부터} 인체를 보호뿐만 아니라 수용성 매개체 또는 직접 수용체 리간드 세포 – 세포 상호 작용의 분비를 통해 시작하고 호흡기 면역 방어 반응 ^1-3을 조절하는 스위치 역할을하는 물리적 장벽뿐만 아니라를 제공합니다. 또한, 면역 반응의 EC의 역할을 연구하는 질병 개체군에서 내피 간의 전위차를 검사하거나, 내피에 외인성 스트레스의 효과를 연구?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips – ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
			Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)