Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.
Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), 3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. 6 mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları 1. Başlangıçta Naal ve ark. 1 tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir.
Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan 7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu 2 etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon 12 (ε 280 = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.
Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser 13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku 15 bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler 15 olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları 15 başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları.
Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve 17 için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI 17 toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre 18 içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri "çapraz bağlama" O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu 15 neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı 20'ye önce adımlar atlar hücre zarı 19 üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum 20 sinyal.
Degranülasyon histamin 6 yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, 1 dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri 21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta 21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu "Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. 1 tarafından geliştirilen ve bize 2 tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil 3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir.
Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları 23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS'nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz 25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM 24 kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda 27-29 ve nehir ve akarsu 30 saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. 27 TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri 31-37 emilir. Queckenberg ve ark. 37 mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk.
TCS insan alerjik deri hastalığı 7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma 38 bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri 2 için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. 2 TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. 39 ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi.
Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu 40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, 2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler 51 yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. 52 ve diğerleri 53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu 2 sonike göstermiştir. % 0.24 'den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation 54,55-örnekler toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri.
Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. 51 yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler 50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir.
Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS 2 çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı ile 280 nm 58 de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var.
Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.
2004 yılında, Naal ve ark. 1 degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. 1 denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz 59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onları…
The authors have nothing to disclose.
LMW ve RHK Biyomedikal Bilim ve Mühendislik (GSBSE) bir sources en Enstitüsü tarafından desteklenir; RHK de Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu tarafından desteklenmiştir. Ek finansman Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIH P20-GM103423), Maine Tarım ve Orman Experiment Station (Grant sayısı ME08004-10, Jag), Tide Merkezi (NSF Grant # 1.008.498) Rising Maine ADVANCE Üniversitesi tarafından sağlandı ve phrma temel (Jag) den Farmakoloji / Toksikoloji bir Araştırma Başlatan Grant. Biz Dr teşekkür ederim. Antijen ve hücreler David Holowka ve Barbara Baird. Biz Hina Hashmi, Alejandro Velez ve ekipman ve emirleri ile yardım için Andrew Abovian minnettarız. Bu Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu yayın sayısı 3311 olduğunu.
RBL-2H3 Cells |
ATCC |
CRL-2256 |
The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC |
Triclosan/Irgasan |
Sigma |
72779 CAS# 3380-34-5 |
Should be stored in a low humidity environment |
Trypsin |
Gibco |
25300-054 CAS# 3380-34-5 |
|
EMEM |
Lonza |
12-611F |
|
Fetal Bovine Serum |
Atlanta Biologicals |
S11150 |
|
Gentamycin Sulfate |
Lonza Biological Sciences |
17-518 |
|
Albumin, Bovine Serum |
Calbiochem |
12659 CAS# 9048-46-8 |
|
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution) |
Pierce |
28314 CAS# 9002-93-1 |
|
HEPES |
J.T Baker |
4153-01 CAS# 75277-39-3 |
|
Magnesium Chloride |
VWR |
BDH0244-500G CAS# 7791-18-6 |
|
D-(+)-Glucose |
Biomedicals |
152527 CAS# 50-99-7 |
|
Potassium Chloride Crystal |
J.T Baker |
3046-01 CAS# 7447-40-7 |
|
Calcium chloride dihyrdate |
Acros Organics |
207780010 CAS# 10035-04-8 |
|
Glycine |
Sigma |
G8898 CAS# 56-40-6 |
|
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU) |
EMD Biosciences |
474502-250MG CAS # 37067-30-4 |
Wrap in foil – is light-sensitive |
Anti-DNP Mouse IgE |
Sigma |
D8406 |
Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month. |
DNP-BSA |
Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University |
Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018 |
|
Calcium Ionophore A23187 |
Sigma |
C75-22-1mg |
Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully |
DMSO |
Sigma |
D2650 CAS# 67-68-5 |
|
Acetic Acid |
VWR |
BDH3094-2 CAS# 64-19-7 |
|
Anhydrous Sodium Carbonate |
Sigma |
222321 CAS# 497-19-8 |
|
Sodium Chloride |
Sigma |
71376 CAS# 7647-14-5 |
|
Hydrochloric Acid |
VWR |
BDH3026 CAS# 7647-01-0 |
|
Reference Buffer, pH 7 |
VWR |
BDH5046 |
|
Reference Buffer, pH 10 |
VWR |
BDH5072 |
|
Reference Buffer, pH 4 |
VWR |
BDH5018 |
|
pH electrode storage solution |
VWR |
14002-828 |
|
Equipment: | |||
Material Name |
Company |
Catalogue Number |
Comments (optional) |
DU 7500 Spectrophotometer |
Beckmann |
No longer sold |
|
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software |
BioTek |
Module S |
|
Hematocytometer |
Hausser Scientific |
3110 |
|
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate |
VWR |
97042-634 |
|
Centrifuge |
Eppendorf |
5430 |
|
Tissue culture water bath |
VWR |
Model# 89032-206 |
|
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood) |
The Baker Company |
Model# SG403A-HE |
|
Tissue culture incubator |
ThermoScientific |
Model# 3598 |
|
Pipetman |
VWR |
Range: P2-P1000 |
|
Balance |
Mettler Toledo |
Model# AG204 |
|
pH meter |
Symphony/VWR |
Model# SB70P |
|
Pipet-Aid |
Drummond Scientific |
4-000-100 |
|
Combitip dispenser |
Eppendorf |
4981 000.019 |
|
Recipes: | |||
Name |
Recipe |
Notes |
|
Acetate Buffer, pH 4.4 |
(1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml |
Sterile Filter into autoclaved glass bottle |
|
Substrate (4-MU) |
|
For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer |
|
Glycine Carbonate Buffer, pH 10 |
|
Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
Tyrodes (2 L), pH 7.4 |
|
Sterile filter into autoclaved glass bottle |
|
RBL Cell Media |
|
Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle |
|
Plastic material used: | |||
Material Name |
Company |
Catalogue Number |
Type of Plastic |
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack |
VWR |
53509-009 |
polypropylene |
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery |
VWR |
89003-420 |
polyethylene |
10 µl micro tip low binding sterile |
VWR |
14217-704 |
polypropylene |
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force |
VWR |
20170-038 |
polypropylene |
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR |
21008-178 |
polypropylene |
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps |
VWR |
21008-103 |
polypropylene |
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One |
690175 |
polystyrene |
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap |
Greiner Bio One |
658175 |
polystyrene |
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
607180 |
polystyrene |
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
710180 |
polystyrene |
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
606180 |
polystyrene |
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette |
Greiner Bio One |
760180 |
polystyrene |
1 cm cuvettes |
N/A |
N/A |
polystyrene |
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate |
Greiner Bio One |
655086 |
polystyrene |
Combitips |
Eppendorf |
022266501 |
Polypropylene/ polyethylene |