Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kwantitatief Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor de

Abstract

Het vasculaire endothelium speelt een integrale rol in de ontstekingsreactie. Tijdens de acute fase van ontsteking, zijn endotheelcellen (EC) geactiveerd door gastheer bemiddelaars of rechtstreeks door geconserveerde microbiële componenten of gastheer-afgeleide gevaar moleculen. Geactiveerde EC express cytokinen, chemokinen en adhesiemoleculen die mobiliseren, activeren en handhaven leukocyten op de plaats van infectie of letsel. Neutrofielen zijn de eerste leukocyten te komen, en zich aan het endotheel via diverse adhesie moleculen op de oppervlakken van beide cellen. De belangrijkste functies van neutrofielen zijn om direct te elimineren microbiële bedreigingen, de indienstneming van andere leukocyten te bevorderen door het vrijkomen van aanvullende factoren en initiëren wondheling. Daarom is hun werving en gehechtheid aan het endotheel is een cruciale stap in de initiatie van de ontstekingsreactie. In dit rapport beschrijven we een in vitro assay met neutrofieladhesiecalceïne AM-gelabelde primaire humane neutrofielen de omvang van microvasculaire endotheelcel activatie kwantificeren onder statische omstandigheden. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat dezelfde monsters gekwantificeerd d.m.v. fluorescentie spectrofotometrie ook direct worden gevisualiseerd middels fluorescentiemicroscopie voor een kwalitatieve beoordeling van neutrofiel binding.

Introduction

Aangezien het vasculaire endotheel in direct contact met het circulerende bloed wordt uniek gelegen om een ​​snelle ontstekingsreactie tijdens infectie of letsel leiden. Endotheelcellen (EC) express patroonherkenning receptoren die verschillende geconserveerde bacteriële bestanddelen gevaar moleculen herkennen en receptoren voor gastheer inflammatoire mediatoren zoals TNFa. Activering van deze receptoren induceert EC aan cytokinen (bijvoorbeeld IL-6, IL-8, CXCL1 en CCL2) afscheiden, en adhesiemoleculen (bijv. E / P-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) opreguleren hun celoppervlak 1 , 2. Deze moleculen allemaal om de gastheer van de infectieuze agentia wissen en initiëren weefselherstel 3,4 vergemakkelijken lokalisatie van leukocyten naar plaatsen van infectie en verwonding. De neutrofiel respons op infectie gaat een goed gecoördineerde wisselwerking tussen het vasculaire endotheel en de reagerende neutrofielen. Na activatie EC, IL-8 wordt afgescheiden en vormt een intravasculaire gradiënt op het endotheel die neutrofielen maakt om thuis op de plaats van infectie of letsel 5,6. E / P-selectines bemiddelen neutrofielen afvang en rollend door relatief zwakke associaties met glycomoleculen op de neutrofielen celoppervlak. Deze interacties met IL-8-binding aan zijn verwante receptor, vergemakkelijken de robuuste, integrine-gemedieerde hechting en eventuele arrestatie van neutrofielen op de endotheliale celoppervlak 7-10. Na arrestatie kan neutrofielen migreren uit de vasculatuur voor de locaties van infectie direct pathogene schimmels, produceren neutrofielen extracellulaire vallen om de verspreiding van ziektekiemen te voorkomen, bevordering van wondgenezing en laat andere factoren die rekruteren andere leukocyten zoals monocyten, macrofagen en dendritische cellen 11-17.

Beschreven in dit rapport is een in vitro methode om neutrofielen aanhankelijkheid kwantificeren om microvascular EC na activering door de gastheer inflammatoire mediator TNF. Deze test is bedoeld om de activering van EC en niet neutrofielen beoordelen. Primaire menselijke neutrofielen zijn eerst geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradiënt scheiding, en worden dan gelabeld met calceïne acetoxymethyl (AM). Esterases binnen de levende cellen hydrolyseren calceïne AM om de sterk fluorescerende calceïne molecuul met een excitatie van 492-495 nm en emissie van 513-516 nm 18. Het fluorescentie-gemerkte neutrofielen vervolgens geïncubeerd met EC monolagen en niet-hechtende neutrofielen worden vervolgens verwijderd. De fluorescentie van de resterende, gebonden neutrofielen wordt vervolgens gemeten met een fluorescentie spectrofotometer, en berekend als percentage van totaal neutrofielen fluorescentie ingang per putje. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat de gebonden calceïne gemerkte neutrofielen in spectrometrie direct worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie een meer kwalitatieve uitgelezen uit EG ac gevenzendvermogen. Aangezien deze assay wordt uitgevoerd onder statische omstandigheden, zal alleen de eerste gebeurtenissen die plaatsvinden in de neutrofiel adhesie cascade worden beoordeeld. Dit wordt bevestigd in dit verslag met E-selectine blokkerende antilichamen aan dat neutrofielen aanhankelijkheid aan TNF-behandelde menselijke long microvasculaire EC (HMVEC-Lung) monolagen wordt drastisch verminderd wanneer de interactie met E-selectine wordt verstoord zien.

Naast TNFa, hebben we met succes deze assay om de omvang van humane navelstreng EC (HUVEC) activering bepalen door Toll-like receptor 1/2 agonisten peptidoglycan-geassocieerde lipoproteïne (PAL), mureïne lipoproteïne (MLP) en Pam3Cys en HMVEC-Lung activering door Pam3Cys 19,20. Daarnaast hebben we met succes deze test met kinase remmers en na RNAi-gemedieerde knockdown van oppervlakte-en cytoplasmatische eiwitten in HMVEC-Lung, wat suggereert dat deze methodologie is compatibel met een verscheidenheid van biochemische en screening assays 20. Kortom, dit assay geeft een eenvoudig, reproduceerbaar, meer functionele manier te gebruiken om de mate van activering van EG ontstekingsmediatoren in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plating en onderhoud van microvasculaire endotheelcellen

  1. Ontdooien en groei van uw microvasculaire endotheelcellen volgens de fabrikant geleverd. In dit protocol werden de cellen gekweekt in EGM-2 MV media (Lonza), en het wordt aanbevolen dat alle experimenten worden uitgevoerd binnen twee weken na het ontdooien om elke wijziging te wijten aan passagenummer minimaliseren. Onze experimenten met HMVEC-Lung worden uitgevoerd tussen passages 4-9.
  2. Dag 1: Wanneer de cellen bereiken 80-90% confluentie, trypsinize en resuspendeer bij 120.000 cellen per ml. Plaat 36000 cellen (0,3 ml) per putje in 48-well, polystyreen weefselkweek plaat (s). Inclusief putjes van HMVEC die niet worden geïncubeerd met neutrofielen om een achtergrond fluorescentie aflezing. Tenzij met 48-well platen die speciaal voor fluorescentie-assays, afwisselende rijen of kolommen zal geen licht vervuiling van naburige putten minimaliseren. OPMERKING: Wells kan vooraf bekleed met poly-Lysine, collageen of fibronectine.
  3. Dag 2: Voeg verse media.
  4. Dag 3: Door fasecontrastmicroscopie, bevestigen de cellen gezond zijn (dwz "kinderkopjes" uiterlijk en kleine cel puin), en ze zijn 100% confluent (figuur 1). Als de cellen zijn niet 100% samenvloeiing, veranderen de media elke dag tot ze klaar zijn.
  5. Zodra de HMVEC monolagen klaar zijn voor de behandeling, was de cellen eenmaal met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en voeg 0,3 ml vers EGM-2 MV media of media met inflammatoire agonist aan de juiste putten. In dit protocol werden de HMVEC-Lung behandeld met TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) gedurende 3 uur omdat dit een goed beschreven activator van EC 21. OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat u de tijd van uw experiment, zodat uw geactiveerde HMVEC cellen (Stap 4.1) en calceïne AM gelabelde neutrofielen (Stap 3.5) zijn klaar om te gebruiken op hetzelfde moment. Het kost ons ongeveer 2,5 uur te isoleren en te labelen neutrophils.

2. Neutrofielen Isolatie behulp Polymorphprep

  1. Isoleer neutrofielen zoals hiervoor 22 beschreven, of met een kant en klare dichtheidsgradiënt oplossing polymorfonucleaire granulocyten isoleren uit volbloed. Gebruikmakend Polymorphprep volgens het protocol dat door Nuzzi, et al.. 2007 resulteert in opbrengsten van ongeveer 2-3 x 10 6 neutrofielen per ml volbloed 23. OPMERKING: Om te voorkomen dat overmatig erytrocyten lysis, een dextransedimentatie om rode bloedcellen te verwijderen kan worden uitgevoerd voorafgaand aan dichtheidsgradiëntcentrifugatie 24.
  2. Breng de Polymorphprep dichtheidsgradiënt oplossing voor RT.
  3. Verzamel 30 ml vol bloed van een gezonde menselijke vrijwilligers in aanwezigheid van een anti-stollingsmiddel zoals heparine, EDTA of citraat. Het bloed moet worden gebruikt binnen 2 uur, en bleef tussen 18-22 ° C.
  4. Laag 5 ml volledig bloed over 5 ml van de dichtheidsgradiënt oplossing in een 15 ml conische buis (
  5. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 30 min bij 18-22 ° C. Zorg ervoor dat u langzaam versnellen en neer de centrifuge (dwz zet de centrifuge rem), en de balans van de buizen goed om trillingen te voorkomen dat te helpen verminderen activatie van de neutrofielen en de vermenging van de lagen te voorkomen. Langere tijden centrifugeren of hoger centrifugaalkracht zal resulteren in de onderste laag leukocyten, neutrofielen die bevat om verder migreren naar de gepelleteerde rode bloedcellen.
  6. Zuig het plasma en leukocyten bovenste band met PBMC's tot de verontreiniging van de laag met neutrofielen (figuur 2B) te voorkomen.
  7. Gebruik een 1-2 ml serologische pipet om de onderste leukocyten laag met neutrofielen te verwijderen. Combineer de neutrofielen lagen in 30 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) in een 50 mlconische buis.
  8. Breng het volume tot 50 ml met PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en gecentrifugeerd bij 450 xg gedurende 10 min bij 18-22 ° C.

Opmerking: Stappen 2.9 en 2.10 zijn optioneel, maar sterk aanbevolen.

  1. Het supernatans aspireren. Resuspendeer de neutrofielen in 8 ml steriel water gedurende 30 seconden om rode bloedcellen te lyseren, onmiddellijk de celsuspensie toe te voegen aan 2 ml 5x PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en meng met de hand. NIET cellen geïncubeerd in water langer dan 30 sec sinds significante neutrofiel dood kan optreden.
  2. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C.
  3. Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en centrifugeer opnieuw bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C.
  4. Resuspendeer de neutrofielen in 10 ml RPMI-1640 (zonder fenolrood) en tel de levende cellen met behulp van de trypan blue werkwijze voor kleurstofuitsluiting. Vermijd langdurige celdichtheden groter dan 5 x 10 6 per ml aangezien dit kan leiden tot activatie van de neutrofielen.

3. Neutrofielen Labeling met Calcein AM

  1. 6 x 10 5 neutrofielen per putje van een 48-wells plaat.
  2. Na het tellen, de overdracht van de geresuspendeerde cellen een ml conische buis 50 en verdun de neutrofielen tot 2-4 x 10 6 cellen per ml met fenol rood-vrij RPMI-1640.
  3. Voeg calceïne AM stockoplossing aan 3 uM (dwz 2,98 ul van calceïne AM voorraad (1 mg / ml) per ml van de media) en meng goed door voorzichtig flicking de buis. Groter dan 5 uM calceïne AM zal resulteren in lekkage van de neutrofielen. Let op: Niet-fluorescerende calceïne AM is gesplitst in de cellen door endogene esterases aan de sterk fluorescerende molecule calceine (dwz dode cellen zullen niet fluoresceren) produceren.
  4. Bedek de buis met aluminiumfolie en incubeer fof 30 min bij 37 ° C in het donker. Opmerking: Langere incubatietijden kunnen tot meer calceïne bevrijd van neutrofielen in de loop van de adhesietest.
  5. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C, en was de neutrofielen 2x met 10 ml RPMI-1640 (zonder fenolrood, voorverwarmd tot 37 ° C). Na resuspenderen van de cellen voor de tweede maal spoelen, eerst langs de neutrofielen hoewel een 40 uM steriel filter om klonten te verwijderen en centrifugeer weer bij 450 g gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C.
  6. Resuspendeer de neutrofielen in RPMI 1640 (zonder fenolrood, voorverwarmd tot 37 ° C) en 2 x 10 6 neutrofielen per ml.

4. Neutrofiel Binding Assay

  1. Was de HMVEC monolagen 3x met 0,5 ml filter-gesteriliseerd (0,22 urn) RPMI 1640 (zonder fenolrood) met 3% BSA per well.
  2. Zuig het medium en voeg 6 x 10 5 calceïne-gelabelde neutrofielen (0,3 ml cel suspension), of 0,3 ml RPMI 1640 (zonder fenol rood) zonder neutrofielen, om de geschikte putjes van de 48-well plaat. Opmerking: Dit is het equivalent van 8 x 10 5 neutrofielen per cm 2.
  3. Incubeer gedurende 20 min in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  4. Totaal Neutrofiel Fluorescentie (PRE wasbeurt): Meet de fluorescentie-intensiteit van elk putje met een excitatie golflengte van 485 nm en een emissie golflengte van 520 nm (fluoresceïne filter set) in een Fluostar, of gelijkwaardig, spectrofotometer. Voer deze stap vlak voor de incubatie eindpunt Opmerking: In dit protocol werden calceïne excitatie en detectie van het uitgezonden licht uitgevoerd vanaf de bovenkant van de onbedekte putten, maar beide kunnen ook worden uitgevoerd vanaf de bodem van de putjes..
  5. Was de putjes die HMVEC monolayers en neutrofielen 5x met 0,5 ml per putje van PBS (w / Ca2 + en Mg2 +). Verwijder het medium en wassendoor het omkeren van de plaat, en zachtjes deppen op papieren zakdoekjes om de resterende vloeistof te verwijderen.
  6. Voeg rug 0,3 ml RPMI 1640 (zonder fenol rood) per well.
  7. Hechtende neutrofielen Fluorescentie (POST wasbeurt): Meet de fluorescentie-intensiteit van elk putje als in stap 4.4.
  8. Bepaal het percentage hechting en relatieve hechting per put:

Opmerking: In dit stadium, kunnen beelden van de calceïne-gemerkte neutrofielen worden verkregen door toepassing van een fluorescentie microscoop staat met standaard fluoresceïne filters. De afbeeldingen in figuur 4 werden verkregen op een Olympus IX51 omgekeerde microscoop uitgerust met een Retiga 2000R camera (Q Imaging) met behulp van Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om betrouwbare, reproduceerbare resultaten met neutrophil bindingstest verkrijgen, is het essentieel dat de gezondheid en de confluentie van de microvasculaire endotheelcellen optimaal op de dag van de assay, zoals geïllustreerd HMVEC-Lung in figuur 1. Daarnaast is het noodzakelijk dat lage passage aantal microvasculaire EC's worden gebruikt (dwz minder dan 9 passages), en bijgevolg, raden wij u aan alle experimenten binnen twee weken na het ontdooien. De gezondheid van de neutrofielen is tevens uiterst belangrijk, vooral omdat calceïne AM niet wordt gemetaboliseerd tot de fluorescent calceïne molecuul als de cellen bestaan ​​andere manier. We gebruiken de trypanblauwexclusie methode, en niet doorgaan met de test als een aanzienlijk deel van de cellen dood zijn (dwz in lood).

Er zijn verschillende manieren om neutrofielen te isoleren, met inbegrip dichtheidsgradiënt en antigen-based scheidingskolom methoden en gevendeze moeten volstaan ​​voor deze procedure. We kozen ervoor om de Polymorphprep pasklare dichtheidsgradiënt oplossing gebruik van Axis-Shield. Zoals te zien is in figuur 2, de PBMCs aanwezig in de bovenlaag, terwijl de neutrofielen in de onderste laag na centrifugatie. De PBMC laag wordt opgezogen, om contaminatie van de granulocyten op hun verwijdering te voorkomen. Het is belangrijk op te merken dat stap 2.9, waarin het water wordt toegevoegd om de resterende rode bloedcellen lyseren, is optioneel. Echter, terwijl het ideaal om alle vervuilende erytrocyten te verwijderen, is het essentieel dat de neutrofielen niet zitten in zuiver water voor meer dan de 30 seconden, waarna aanzienlijke dood kan optreden.

Tenslotte worden de neutrofielen geïncubeerd met calceïne AM gedurende 30 minuten, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in voorverwarmde (37 ° C) RPMI-1640 medium (zonder fenolrood). Het is belangrijk om media zonder fenolrood, die kunnen interfereren met de fluorescentie lezen. Het aantal neutrophils toegevoegd aan de putjes nogal willekeurig, mits de fluorescentie metingen pre-en post-wash binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer en de verschillen tussen de behandelingen die ofwel bevorderen of verhinderen neutrofiel hechting kan reproduceerbaar vastgesteld (zie hieronder). Wij vinden dat de fluorescentie OD 520nm is binnen het lineaire bereik bij 10.000 tot 1.000.000 gelabelde neutrofielen worden geanalyseerd (Figuur 3A). Interessant, vinden we dat het percentage hechting toeneemt naarmate meer neutrofielen toegevoegd HMVEC-Lung monolagen behandeld met TNFa [100 ng / ml] gedurende 3 uur (figuur 3B). Wij kozen de HMVEC-Lung en calceïne gemerkte neutrofielen samen geïncubeerd gedurende 20 min, omdat we dat het percentage hechting niet significant toe na dit tijdstip (gegevens niet getoond). Opmerkelijk, in deze test gebruikten we standaard duidelijk polystyreen 48-well platen en vonden dat het niveau van fluorescentie cross-over tussen metingen tHij putten niet meer bedragen dan 0,5% van de totale fluorescentie invoer (data niet getoond). Toch raden wij u aan 48-well platen met opzet gemaakt voor fluorescentiespectrofotometer lezingen voor meer gevoelige experimenten, indien beschikbaar, of op zijn minst, het ontwerpen van uw experiment om cross-over lezingen te minimaliseren (zie Stap 1.2).

Om aan te tonen dat het aantal neutrofielen toegevoegd aan de putjes nogal willekeurig zolang het aantal toegevoegde binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer, voerden wij een neutrofieladhesie assay met TNFa behandelde HMVEC-Lung in de afwezigheid of aanwezigheid van de p38 -MAPK remmer BIRB7906, met variërende inbreng hoeveelheden van neutrofielen (dwz 40000 / goed, 200000 / goed of 1,000,000 / goed) 25. p38-MAPK Eerder is aangetoond noodzakelijk voor E-selectine-expressie in humane TNFa-behandelde EC en de remming moet reduceren neutrofiel binding aan TNFa-geactiveerde HMVEC-Lung26. In feite is dit wat wij waarnemen (Figuur 3C). Hoewel we dat het percentage hechting toeneemt naarmate meer neutrofielen toegevoegd, en het percentage hechting kan verschillen tussen experimenten door verschillende factoren, zoals inter-donor variaties, de kwaliteit van de neutrofielen en de dichtheid van HMVEC bij confluentie, de relatieve hechting tussen omstandigheden relatief constant blijft elk onafhankelijk experiment, ongeacht het aantal neutrofielen toegevoegd (Figuur 3C en data niet getoond). Deze data illustreren ook waarom het beter om de hechting gegevens ten opzichte van een positieve controle voor inter-experimentele consistentie geven.

Om te illustreren hoe deze test werkt, hebben we een neutrofieladhesie assay met TNFa behandelde HMVEC-Lung vooraf geïncubeerd met ofwel controle-antilichaam of een E-selectine blokkerend antilichaam. E-selectine wordt uitgedrukt op de EG-oppervlak na behandeling met TNFa en vangt neutrophils van het vaatstelsel via elektrostatische interacties met glycomoleculen presenteren op de neutrofielen oppervlak 1,27. Zoals numeriek weergegeven in figuur 4A, grafisch weergegeven in figuur 4B en visueel in figuur 4C, de TNFa-behandelde HMVEC-Lung vooraf geïncubeerd met het E-selectine-antilichaam gebonden ~ 75% minder neutrofielen dan de TNFa-behandelde HMVEC-Lung pre-geïncubeerde met controle IgG. Dit suggereert E-selectine speelt een belangrijke rol bij het binden neutrofielen HMVEC-Lung in onze statische adhesietest.

Figuur 1
Figuur 1. Voorbeeld van een gezonde, confluerende HMVEC-Lung monolagen. Let op de "kinderkopjes" uitstraling en totale samenvloeiing van de monolagen. Beelden werden genomen op 4x en 10x vergroting op een Fisher Scientific Micromaster geïnverteerde digitale microscoop. Figuur 2
Figuur 2. Volbloed en Polymorphprep gelaagd centrifugeerden (A) en na centrifugeren afgescheiden (B). Merk op dat na centrifugeren, de PBMC's vormen een aparte bovenste band, terwijl de polymorfonucleaire granulocyten (neutrofielen) een afzonderlijke onderband.

Figuur 3
Figuur 3. De relatie tussen neutrofielen aantal en fluorescentie OD 520nm is lineair, het percentage adhesie van neutrofielen aan TNF-behandelde HMVEC-Lung neemt toe naarmate meer neutrofielen worden toegevoegd; p38-MAPK bevordert neutrofielen aanhankelijkheid aan TNF-geactiveerde HMVEC-Lung monolagen (A) Graph. beeltenis van de linear relatie tussen fluorescentie OD 520nm en neutrofielen aantallen meer dan twee ordes van grootte. Een R2-waarde van 0,996 duidt een lineair verband tussen het aantal neutrofielen en de fluorescentie OD 520nm bij 10.000 tot 1.000.000 neutrofielen geanalyseerd. (B) Grafische weergave van het percentage hechting bij variërende aantallen calceïne-gemerkte neutrofielen werd toegevoegd aan onbehandeld of TNFa-behandelde ( 100 ng / ml, 3. hr) HMVEC-Lung monolagen in 48-well platen (C) HMVEC-Lung monolagen werden vooraf geïncubeerd met de p38-MAPK remmer BIRB796 (10 mM) (Axon Medchem) of DMSO (controle) voor 1 uur voorafgaand aan TNFa (100 ng / ml) behandeling gedurende 3 uur terwijl de continue aanwezigheid van BIRB796 (10 mM). De relatieve hechting werd berekend in stap 4.8. De gegevens zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. GraphPad Prism ongepaarde t-test werd gebruikt voor statistische analyse (n = 3) (TNFa-behandelde versus TNFa-behandelde plus BIRB796). p-waarde ** <0,01; *** &# 60;. 0.001 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4
Figuur 4. E-selectine bevordert de hechting van neutrofielen aan TNFa-behandelde HMVEC-Lung. HMVEC-Lung werden behandeld met TNFa [100 ng / ml] gedurende 3 uur. Na wassen van de HMVEC-Lung met RPMI 1640 dat 3% BSA (stap 4.1), hetzij IgG van schapen [50 ug / ml] (5-001-A, R & D Systems) of E-selectine polyklonaal antilichaam (pAb) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) werden toegevoegd aan de geschikte putjes gedurende 20 minuten. The HMVEC-Lung monolagen werden vervolgens gewassen met RPMI weer-1640 vóór 6 x 10 5 neutrofielen per putje toegevoegd voor nog eens 20 minuten. (A) De berekeningen om het percentage en relatieve hechting bepalen getoond. Calceïnelichtemissie wordt gemeten bij OD 520 nm. Achtergrond OD 520nm gemiddelde afgeleid van HMVEC-Lung in afwezigheid van behandeling en TNFa neutrofielen. (B) Grafische weergave van relatieve percent hechting van calceïne-gemerkte neutrofielen onbehandeld of TNFa-behandelde HMVEC-Lung monolayers na pre-incubatie met of control IgG of E-selectine blokkeert pAb. De gegevens zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. GraphPad Prism ongepaarde t-test werd gebruikt voor statistische analyse (n = 3). Berekende p-waarde was <0,001. (C) Afbeeldingen van calceïne-gelabelde neutrofielen gebonden aan onbehandelde en TNF-behandelde HMVEC-Lung monolagen vooraf geïncubeerd met ofwel controle IgG of E-selectine pAb. Een voorbeeld putje met 6 x 10 5 neutrofielen voor het wassen met PBS wordt getoond (PRE wassen). Doorschijnend lichtmicroscopie beelden worden weergegeven in de rechterkolom, terwijl fluorescentie beelden van hetzelfde gebied van de referentie, met behulp van een fluoresceïne-filteringesteld, worden weergegeven in de linkerkolom. Beelden werden genomen op 10x vergroting op een Olympus IX51 omgekeerde microscoop uitgerust met een Retiga 2000R camera (Q Imaging). PRE wasbeurt = totale neutrofielen fluorescentie OD 520nm (Stap 4.4); POST wasbeurt = hechtende neutrofielen fluorescentie OD 520nm (Stap 4.7); PMN - polymorfonucleaire granulocyten; avg - gemiddelde; IgG - schapen IgG controle; E-sel/α-E-selectin - E-selectine blokkeert pAb. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stappen voor een succesvolle neutrofielen / microvasculaire endotheelcel adhesie test zijn: 1) het gebruik van lage passage nummer (<9), gezonde endotheelcellen, 2) handhaven van de geïsoleerde neutrofielen bij een lage dichtheid (dat wil zeggen <5 x 10 6 cellen / ml) en het gebruik ervan binnen twee uur van isolement, en 3) Fastidious wassen van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen en het gebruik van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen tijdig aan EG vervuiling en verlies van calceïne minimaliseren van de neutrofielen, respectievelijk .

We voegen 8 x 10 5 neutrofielen per cm2 weefselkweek goed oppervlak (bijvoorbeeld 600.000 neutrofielen per putje van een 48-well plaat). Wij vinden dat een invoer van 600.000 neutrofielen is binnen het lineaire bereik van onze spectrofotometer, en betrouwbaar reproduceert gegevens wanneer relatieve adherences worden gemeten. Echter, is een vergelijkbare afname in binding neutrofielen waargenomen in dep38-MAPK inhibitie assay (figuur 3C) bij 40.000, 200.000 of 1.000.000 neutrofielen per putje toegevoegd, wat suggereert dat minder dan 600.000 neutrofielen worden gebruikt.

De hierin beschreven protocol beoordeelt alleen de omvang van endotheliale activatie aangezien de neutrofielen zelf niet vooraf geactiveerd, of anderszins op enige wijze, wat uiteraard een optie als specifieke assay vereist. We zien dat de expressie van E-selectine op TNFa-behandelde HMVEC-Lung is belangrijk voor de bevestiging van de neutrofielen in deze assay, consistent met eerdere waarnemingen 27. De elektrostatische binding van E-selectine te glycomoleculen aanwezig op de neutrofielen oppervlak relatief zwak zijn, maar onder stromingscondities, zijn deze interacties gedacht aan de hoge-affiniteit integrine-gemedieerde attachments tussen neutrofielen en EC 1,7-10 induceren. Daarom is deze assay betere indicatie van de eerste stappen in ontsteking die are noodzakelijk neutrofielen uit het vaatstelsel vangen. Toch hebben we vastgesteld dat onze resultaten verkregen met TNFa in dit rapport waren zeer vergelijkbaar, zo niet identiek aan die verkregen met een flow module (gegevens niet getoond), waarin de resultaten van deze statische test fysiologisch belang en stelt voor een assay is bijzonder nuttig voor onderzoekers die geen toegang tot een stroomsysteem hebben.

Variaties van de beschreven test, met calceïne als detectie fluorofoor, werden eerst beschreven in 1993 28,29. Belangrijk is dat deze aanvankelijk gevonden dat calceïne geen invloed cellevensvatbaarheid en de minste invloed op de celfunctie in adhesie assays in vergelijking met andere fluoresceïne-afgeleide kleurstoffen 29,30. Er werd ook gemeld dat het aantal cellen is lineair met betrekking tot fluorescentie-intensiteit, in overeenstemming met wat we waarnemen (figuur 3A) 28. Eerste berichten ook benadrukt dat eenbelangrijk voordeel van fluorimetrische testen is dat ze niet nodig radiolabeling (bijv. 111 In of 51 Cr) van de gezuiverde leukocyten 31-33. De voordelen en de consistentie van het gebruik van calceïne AM-gelabelde cellen over radioactief gelabelde cellen werden grondig eerder 28,29,34 besproken. Hoewel we gebruiken calceïne AM om de neutrofielen in onze tests, diverse andere cel permeant kleurstoffen die esterase substraten zijn beschikbaar label. Bijvoorbeeld, Life Technologies verkoopt CellTrace calceïne rood-oranje (C34852), calceine violet (C34858) en calceïne blauw (C34853) die prikkelen / emitteren bij verschillende golflengten. De verschillende kleurstoffen hebben elk hun voordelen en nadelen. Bijvoorbeeld, de calceïne AM rood-oranje kleurstof aantal intrinsieke fluorescentie vóór hydrolyse 18.

We gebruiken deze methode om inflammatoire activatie van het endotheel bestuderen reactie op bacteriële en endogene factoren (bijvoorbeeld TNFa), en ewij gebruiken HMVECs verzameld van kadavers, die kan worden uitgebreid in voldoende hoeveelheid om de test te doen met de juiste controles en genoeg gerepliceerd naar statistische analyses uit te voeren. Denkbaar, kan deze test worden gebruikt als een instrument om endotheel-based ziekteprocessen die leukocyten binding aan het microvasculair endotheel betrokken bestuderen. Voorbeelden van aandoeningen die kunnen worden onderzocht door HMVECs van patiënten omvatten chronische obstructieve longziekte (COPD), sepsis, inflammatoire darmziekte, vasculitides, zoals de anti-neutrofiele cytoplasmatische autoantilichamen (ANCA)-geassocieerde vasculitis en hersenen vasculaire misvormingen 35-40 . Zo kan HMVECs ophalen mensen met vasculitis of sepsis postmortale of potentieel van patiënten met endotheliale based ziekteprocessen die een biopsie of chirurgische resectie van een orgaan, en hun binding aan neutrofielen beoordelen onder verschillende condities hebben ondergaan. Echter, deze test vereist voldoendehoeveelheden HMVECs tot confluente monolagen vormen, en dus HMVECs geëxpandeerd en gebruikt na meerdere passages. Dit proces van expansie kan leiden tot fenotypische veranderingen in de EC, dat zal moeten ontwerpen studies met primaire EC van patiënten met EC-gebaseerde ziekten rekening worden gehouden. Niettemin is de veelzijdigheid van deze test maakt het mogelijk om aan veel andere hechtende leukocyten en celtypes. In feite hebben deze test, of varianten daarvan, met succes gebruikt met andere endotheelcellen vormen, en primaire cellen en cellijnen zoals monocyten, THP-1, Jurkat, HL-60 en U937 28,31,41. Deze test heeft bewezen snel, gemakkelijk uit te voeren, reproduceerbare en zeer gevoelige, en is daarom een ​​nuttig middel om endotheelcelactivering detecteren van ontstekingsmediatoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie UCSF van Anesthesie en perioperatieve zorg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

Immunologie Cellular Biology Infectie Moleculaire Biologie Geneeskunde Biomedische Technologie Biofysica endotheel Vascular neutrofielen Ontsteking Ontsteking Mediators neutrofielen leukocytadhesie endotheliale cellen assay
Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter