Summary
中性粒细胞活化的内皮细胞在感染部位是坚持宿主的炎症反应的一个组成部分。本报告中所述的是中性粒细胞的结合测定法，它允许对
Abstract
血管内皮细胞在炎症反应中起一个不可分割的一部分。在炎症的急性期，被激活的内皮细胞（ECs）的主机介质，或直接由保守的微生物成分或宿主来源的危险分子。活化的内皮细胞表达细胞因子，趋化因子和粘附分子，调动，激活和留住白细胞感染或受伤在现场。嗜中性粒细胞是白细胞到达，和坚持的内皮细胞上存在两种细胞表面粘附分子通过各种。嗜中性粒细胞的主要功能是直接消除微生物的威胁，促进招聘其他白细胞通过释放其他因素，并启动修复创面。因此，他们的招聘和附件的内皮细胞，是启动的炎症反应中的关键一步。在这份报告中，我们描述了一个在体外中性粒细胞粘附实验使用钙黄绿素AM标记初级人类嗜中性粒细胞在静态条件下，定量微血管内皮细胞活化的程度。此方法具有附加的优点，荧光分光光度法定量测定同一样品，也可以直接用荧光显微镜定性评估的中性粒细胞结合更可视化。
Introduction
由于血管内皮细胞在循环血液直接接触，它是唯一位于启动一个快速的在感染或损伤的炎症反应。内皮细胞（EC）表示模式识别受体，可以识别各种保守的细菌成分和危险分子，以及宿主的炎症介质如肿瘤坏死因子受体。这些受体的激活诱导内皮细胞分泌的细胞因子（ 例如 IL-6，IL-8，CXCL1和CCL2），并上调粘附分子（ 例如 E / P-选择素，VCAM-1和ICAM-1）在其细胞表面1 ，2。所有这些分子促进本地化的感染和损伤部位的白细胞，中性粒细胞对感染的反应，以明确的传染性病原体的主机并发起组织修复3,4涉及协调良好的血管内皮细胞和响应之间的相互作用中性粒细胞。 EC激活后，IL-8分泌，形成血管内梯度上的内皮细胞，使中性粒细胞感染或受伤的5,6家中到现场。 E / P-选择素介导的中性粒细胞捕获和通过相对较弱协会与glycomolecules中性粒细胞表面滚动。这些相互作用，以及与IL-8其同源受体结合，促进强劲，中性粒细胞在内皮细胞表面7-10整合素介导的附件，并最终逮捕。被逮捕后，嗜中性粒细胞可以迁移出具体感染部位，直接消除病原体，产生中性粒细胞胞外的陷阱，以防止病原体的传播，促进伤口愈合，并释放出额外的因素，招募其他的白细胞，如单核细胞，巨噬细胞和树突状血管细胞11-17。
本报告中描述的是一种体外的方法来定量中性粒细胞的粘附，术后1血管性内皮细胞活化后由主机炎症介质TNFα。本试剂盒的目的是评估的激活的内皮细胞，而不是中性粒细胞。初级人类嗜中性粒细胞是首先使用密度梯度分离分离，然后标记的乙酰氧基甲基钙黄绿素（AM）。酯酶的活细胞内水解钙黄绿素AM的高荧光钙黄绿素分子的激发492-495 nm，发射513-516纳米18。荧光标记的嗜中性粒细胞与EC的单分子膜，然后孵育，其后除去非粘附的中性粒细胞。剩余的，结合的嗜中性粒细胞的荧光，然后使用荧光分光光度计测定，计算作为一百分比的总的嗜中性粒细胞的荧光每孔输入。这种方法有绑定的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞用于分光额外的好处是可以用荧光显微镜直接观察，给予了更多的定性读出EC交流tivation。由于此法是在静态条件下，只有非常初步的事件发生在中性粒细胞粘附级联评审会。这也证实在本报告中，使用E-选择素抗体阻断，表明中性粒细胞粘附的TNFα处理人肺微血管EC（HMVEC龙）单层与E-选择素的相互作用时，大大减少被打乱。
除了对TNFα，我们已经成功地使用这种检测人脐静脉EC（HUVEC）激活Toll样受体1/2激动剂肽相关脂蛋白（PAL），胞壁质脂蛋白（MLP）和Pam3Cys和程度来确定龙HMVEC激活由Pam3Cys 19,20。此外，我们还成功地使用这种检测激酶抑制剂和RNAi介导的表面和胞质蛋白在HMVEC龙击倒后，表明这种方法是兼容与各种生化和screenin克分析20。综上所述，这个实验提供了一个易于使用的，重现性好，功能更强大的方式来访问EC活化程度的炎症介质在体外 。
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Protocol
1。电镀和维护微血管内皮细胞
- 解冻和增加你的微血管内皮细胞，根据制造商提供的说明。在这个协议中，细胞生长在EGM-2 MV媒体（龙沙），并建议所有的实验进行两周内解冻，以尽量减少由于通道数量的任何变化。我们的实验与HMVEC龙进行4至9之间的通道。
- 第1天：当细胞达到80-90％汇合，胰蛋白酶消化，悬浮在120,000细胞每毫升。板36,000细胞（0.3毫升），每孔48孔，聚苯乙烯组织培养板（S）。包括HMVEC井， 不会与嗜中性粒细胞进行培养，以获得背景荧光读数。除非使用专门设计的荧光的检测方法，交替的行或列的48孔板，将最大限度地减少任何光线从邻近井的污染。注：井可以是预先涂有聚LYSINE，胶原蛋白或纤维连接蛋白。
- 第2天：加入新鲜的培养基。
- 第3天：相衬显微镜，确认细胞是健康的（ 即 “鹅卵石”外观和小细胞碎片），他们是100％的融合（ 图1）。如果细胞是不是100％融合，改变媒体的每一天，直到他们准备好了。
- 一旦HMVEC单层准备治疗，洗一次细胞与汉克的平衡盐溶液（HBSS），加0.3毫升新鲜EGM-2 MV的媒体或媒体到合适的井含炎症激动剂。在这个协议中的HMVEC龙治疗与TNFα[100毫微克/毫升（PeproTech公司，新泽西州）3小时，因为这是一个很好的描述激活ECS 21。注：建议您的时间让您的活化HMVEC细胞（步骤4.1）和钙黄绿素AM实验标记的嗜中性粒细胞（步骤3.5），同时准备使用。我们需要约2.5小时到隔离和标签neutroph的ILS。
2。使用Polymorphprep的中性粒细胞隔离
- 隔离如前所述22，中性粒细胞，或用一个现成的密度梯度溶液从全血中分离中性粒细胞。用人Polymorphprep协议由Nuzzi 等人 2007年业绩的收益率约为2-3×10 6中性粒细胞每毫升全血23。注：为了避免过多的红细胞裂解，葡聚糖沉淀去除红血细胞之前，可以进行密度梯度离心24。
- 带来Polymorphprep密度梯度溶液RT。
- 收集30毫升的全血中的存在下，从健康人志愿者的抗凝血剂如肝素，柠檬酸盐或乙二胺四乙酸。的血应该在2个小时之内使用，并保持在18-22℃。
- 层5毫升的全血在5毫升15毫升锥形管中的密度梯度溶液（图2A）。避免改变血液体积和密度梯度溶液，因为这可能会改变后续的离心条件。
- 离心450×g离心30分钟，在18-22℃。确保慢慢加快离心机（ 即关闭离心机制动），以及平衡管，以防止振动，以帮助减少嗜中性粒细胞的激活，并防止层的混合。停止离心时间或更高的离心力将导致在较低的白细胞层，其中包含嗜中性粒细胞，，进一步迁移下来，对颗粒的红血细胞。
- 吸出血浆和上部含白细胞频带的外周血单个核细胞层含有嗜中性粒细胞（ 图2B），以防止污染。
- 使用1-2毫升血清吸管，删除含有嗜中性粒细胞的白细胞较低层。结合嗜中性粒细胞层成30毫升的PBS（不含Ca 2 +和Mg 2 +）在50毫升锥形管。
- 使体积至50ml，用PBS（不含Ca 2 +和Mg 2 +），以450×g离心10分钟，在18-22℃。
注：2.9和2.10步是可选的，但强烈推荐。
- 吸出上清液。中性粒细胞在8毫升无菌水重悬，持续30秒，以裂解红血细胞，立即加入2ml的5倍的PBS（不含Ca 2 +和Mg 2 +），用手轻轻混匀。 请勿培养细胞中的细胞悬液，以水时间超过30秒，因为显着的中性粒细胞可发生死亡。
- 在250 XG离心5分钟，在18-22°C。
- 液洗涤细胞一次，用10毫升的PBS（不含Ca 2 +和Mg 2 +）和在250×g离心5分钟，在18-22℃下
- 重悬在10ml的RPMI-1640（不含酚红）的嗜中性粒细胞，并使用台盼蓝计数活细胞染色排除法。大于5×10 6个每毫升的细胞密度，避免长时间，因为这可能会导致嗜中性粒细胞的激活。
3。中性粒细胞贴标钙黄绿素AM
- 6×10 5个中性粒细胞的48孔板每孔使用。
- 计数后，转移到50毫升锥形管，将重新悬浮的细胞和嗜中性粒细胞稀释至2-4×10 6细胞每毫升用无酚红的RPMI-1640。
- 添加钙黄绿素AM到3微米（ 即 2.98微升钙黄绿素AM股票（1毫克/毫升），每毫升媒体）原液，轻弹管拌匀。大于5μM钙黄绿素AM将导致泄漏由嗜中性粒细胞。 注意：非荧光钙黄绿素AM被裂解的细胞内的内源性酯酶产生高荧光分子的钙黄绿素（ 即死亡的细胞，因此无法荧光）。
- 用铝箔和孵化FO量管R 30分钟，在37℃下在黑暗中。 注：较长的孵育时间可能导致更多的钙黄绿素从嗜中性粒细胞的粘附实验的过程中解放出来。
- 在450×g离心5分钟，在18-22℃下离心，洗涤用10毫升的RPMI-1640（不含酚红;预温至37℃）的嗜中性粒细胞2倍。第二次洗涤后，重悬细胞，首先通过嗜中性粒细胞，但40微米的无菌过滤器，以去除团块，然后一次以450×g离心5分钟，在18-22℃。
- 重悬中性粒细胞在RPMI 1640（不含酚红;预热至37℃）在2×10 6嗜中性粒细胞每毫升。
4。中性粒细胞结合分析
- 洗净HMVEC单分子膜，用含3％BSA以每孔0.5ml的过滤灭菌（0.22微米）的RPMI 1640（不含酚红）的3倍。
- 吸媒体，并添加6×10 5钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞（0.3 ml的细胞悬液），或0.3毫升的RPMI 1640（不含酚红）无中性粒细胞，在合适的孔48孔板注意：这是一个相当于8×10 5个每1cm 2的中性粒细胞。
- 孵育20分钟，在37℃，5％CO 2培养箱中 。
- 共有中性粒细胞的荧光（PRE洗涤）：测量各孔的荧光强度为485 nm的激发波长和发射波长为520nm（荧光集）滤波器在FLUOstar或等效，分光光度计。只执行该步骤之前，的孵化终点。 注意：在这个协议中，所发出的光的钙黄绿素的激发和检测进行从露天井的顶部，但是，两者也可以从孔的底部进行。
- 洗净的孔中HMVEC单层和的5倍的嗜中性粒细胞用0.5毫升每孔的PBS（瓦特/的Ca 2 +和Mg 2 +）。卸下介质和清洗由反相板，并轻轻拍打到纸巾上，除去残留的液体。
- 添加0.3毫升的RPMI 1640（不含酚红）每口井。
- 贴壁的中性粒细胞的荧光（柱洗）：在步骤4.4中，测量各孔的荧光强度。
- 确定的百分比的坚持和相对坚持每口井：
注意：在这个阶段，可以通过以下方式获得的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞的图像，通过使用荧光显微镜能够配备标准的荧光过滤器。 图4中的图像上得到了奥林巴斯IX51倒置显微镜配备一个的Retiga 2000R相机（Q成像）使用Q-捕捉PRO7软件（Q成像）。
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Representative Results
为了获得可靠的，可再现的结果，使用中性粒细胞的结合测定，它是必不可少的健康和微血管内皮细胞的汇合天的测定是最优的HMVEC隆在图1中，如图所示。此外，它必须用于低通道数微血管内皮细胞（ 即小于9代），因此，我们建议所有的实验进行两周内解冻。嗜中性粒细胞的健康也是非常重要的，特别是因为钙黄绿素AM将不被代谢，如果细胞以某种方式由荧光钙黄绿素分子。我们使用台盼蓝染色法，并没有一个显着比例的细胞进行检测，如果是死的（ 即染色）。
分离嗜中性粒细胞的方法有多种，包括密度梯度和基于抗原的柱的分离方法，以及任何这些应该足够了此过程。我们选择使用现成的Polymorphprep密度梯度溶液从轴盾。在图2中可以看出，在顶层中的外周血单个核细胞，而嗜中性粒细胞内，离心后的下层。外周血单个核细胞层被吸入粒细胞后，他们搬迁，以避免污染。重要的是要注意，步骤2.9，在其中加入水，以溶解任何其它的红血细胞，是可选的。然而，尽管它是理想的去除所有污染红细胞，关键是中性粒细胞在纯水中不坐超过30秒之后相当可发生死亡。
最后，嗜中性粒细胞孵育30分钟，洗涤后重悬于预热的（37℃）的RPMI-1640培养基（不含酚红）钙黄绿素AM。重要的是使用不含酚红，这可能会干扰荧光读数的媒体。的数量neutr加入到孔中的ophils是相当武断的，提供的荧光读数前和清洗后的分光光度计的线性范围内，以及治疗方法，促进或阻止中性粒细胞的粘附之间的差异可以是可重复地确定的（见下文）。我们发现，OD 520nm处的荧光标记的嗜中性粒细胞为10000〜1000000的线性范围内时进行了分析（ 图3A）。有趣的是，我们也发现，随着越来越多的中性粒细胞肿瘤坏死因子治疗的HMVEC龙单层％坚持[100毫微克/毫升] 3小时（ 图3B）。我们选择HMVEC肺癌和钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞一起孵育20分钟，因为我们发现，粘连的百分比不会显着增加后，该时间点（图中未示出）。值得注意的是，在本实验中，我们采用标准的，透明的聚苯乙烯48孔板，发现t之间的电平的荧光读数交叉的他井没有达到超过0.5％的总荧光输入（数据未示出）。尽管如此，我们建议使用48孔板特意荧光分光光度计读数更敏感的实验，如果有的话，或者最起码，实验设计，以尽量减少交叉读数（见第1.2步）。
为了证明加入到孔中的嗜中性粒细胞的数量是相当任意的，只要添加的数量是在分光光度计的线性范围之内，我们进行了TNFα处理的HMVEC肺癌中p38的存在或不存在的嗜中性粒细胞粘附试验MAPK抑制剂BIRB7906，使用不同的输入大量的嗜中性粒细胞（ 即 40,000 / 200,000 / 1,000,000 /孔）25。 P38-MAPK先前已被证明是必要的E-选择素的表达TNFα处理人类内皮细胞，因此减少其抑制中性粒细胞结合到TNFα激活HMVEC的龙26。事实上，这就是我们观察到（ 图3C）。虽然我们发现，随着添加更多的嗜中性粒细胞百分比遵守，％的坚持之间可能有所不同的实验中，由于各种因素，如给体间的变化，中性粒细胞的质量和密度在合流HMVEC，相对坚持条件之间保持相对恒定，在各独立的实验中无论添加的嗜中性粒细胞（ 图3C和数据未示出）的数量。这些数据还举例说明为什么它是最好显示的粘附数据相对于实验间的一致性的阳性对照。
为了充分说明这个实验是如何工作的，我们进行了中性粒细胞粘附实验与的TNFα处理HMVEC龙预孵育要么控制抗体或E-选择素阻断抗体。欧盟表面上用TNFa水平及捕获neutr的的治疗后E-选择素的表达ophils血管呈现通过静电相互作用glycomolecules的中性粒细胞表面1,27。数字显示在图4A，图4B和图4C中的视觉图形，TNFα处理的HMVEC隆绑定比TNFα处理的HMVEC隆预孵育〜75％的嗜中性粒细胞与E-选择素的抗体预孵育与对照IgG。这表明E-选择在我们的静态吸附试验到HMVEC龙圈养中性粒细胞中起着重要的作用。
图1。的健康，的汇合HMVEC龙单层示例注意“鹅卵石”外观和总汇合的单层。图像上飞世尔科技MICROMASTER数码倒置显微镜4X和10X的放大倍率。 
图2。全血和Polymorphprep分层离心前（A）和（B）的离心分离后注释的外周血单个核细胞，离心后，形成了一个独特的上频带，而多形核粒细胞（中性粒细胞）形成一个独特的低频。
图3。嗜中性粒细胞数和荧光外径为520nm之间的关系是线性的;％TNFα处理HMVEC龙随着更多的中性粒细胞中性粒细胞粘附添加P38-MAPK促进中性粒细胞的粘附到TNFα激活HMVEC的龙单层（A）走势图描绘线R关系之间的荧光外径为520nm和中性粒细胞数超过两个数量级。 （B）为0.996，R2值表示分析时为10000〜1000000的嗜中性粒细胞，嗜中性粒细胞数和OD 520nm的荧光之间的线性关系。％坚持的图形表示时，不同数量的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞加入到未经处理的或治疗的肿瘤坏死因子α（ 100毫微克/毫升，3小时）的HMVEC龙单层48孔板。（C）HMVEC龙单层预孵育与P38-MAPK抑制剂BIRB796（10毫米）（轴突MEDCHEM）或DMSO（对照组）前1小时，以肿瘤坏死因子（100毫微克/毫升）处理3小时，而在连续存在共BIRB796（10毫米）。在步骤4.8中，计算的相对坚持。数据表示为平均值±标准差。 GraphPad棱镜未配对t检验进行统计分析组（n = 3）（TNFα处理与TNFα处理过加BIRB796）。 p值** <0.01; ***＃60; 0.001。 点击这里查看大图 。
图4，E-选择素促进中性粒细胞粘附肿瘤坏死因子治疗HMVEC龙 HMVEC龙治疗与TNFα[100毫微克/毫升] 3小时。在洗涤HMVEC-龙与RPMI 1640含3％BSA（步骤4.1），无论是羊的IgG [50微克/毫升]（5-001-à; R＆D系统）或E-选择素多克隆抗体（PAB）[50毫克/ ML]（AF724 R＆D系统）增加了20分钟到相应的井。然后该HMVEC龙单层水洗多一次的RPMI-1640 6×10 5中性粒细胞均增加了一个额外的20分钟，每孔（A）的计算来确定％，相对坚持。钙黄绿素发光测量外径520纳米 。背景OD 520nm的平均TNFα治疗和中性粒细胞在没有来自从HMVEC龙（B）的图形表示相对％的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞粘附到未处理或处理TNFαHMVEC，龙单层预培养后，与任一控制IgG或E-选择素阻断PAB。数据表示为平均值±标准差。 GraphPad棱镜未配对t检验进行统计分析组（n = 3）。计算p值<0.001（C）势必与对照IgG或E-选择素多克隆预孵育的未处理和的TNFα处理HMVEC龙单层钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞的图像。示出一个例子，以及含有6×10 5的嗜中性粒细胞用PBS洗涤前（PRE洗涤）。半透明光显微镜图像显示在右侧列，而同一领域的参考的荧光图像，使用荧光过滤器设置，显示在左栏中。图像拍摄奥林巴斯IX51倒置显微镜配备一个的Retiga 2000R相机（Q成像）在10倍放大倍率。预洗=总中性粒细胞荧光外径为520nm（步骤4.4）; POST洗=中性粒细胞粘附荧光外径为520nm（步骤4.7），中性粒细胞-中性粒细胞;平均-平均抗体-羊IgG的控制;E-sel/α-E-selectin - E-选择素阻断多克隆点击这里查看大图 。
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Discussion
对于一个成功的嗜中性粒细胞/微血管内皮细胞粘附试验的最重要的步骤是：1）使用低传代次数（<9），健康的内皮细胞; 2）维护分离出的嗜中性粒细胞的低密度（ 即 <5×10 6个细胞钙黄绿素AM标记的嗜中性粒细胞/毫升），并利用他们的隔离在两小时内，3）苛养洗涤，并使用钙黄绿素AM标记的嗜中性粒细胞中及时，以尽量减少EC从嗜中性粒细胞的钙黄绿素的污染和损失。分别。
我们添加了8×10 5个中性粒细胞组织培养的每1cm 2的表面积（ 即 600000中性粒细胞的48孔板每孔）。我们发现，一个输入端600,000嗜中性粒细胞是我们的分光光度计的线性范围内，并可靠地再现数据时，相对粘附计量。然而，一个非常类似的减少，嗜中性粒细胞结合观察到的p38的MAPK的抑制测定法（ 图3C），每孔加入40,000，200,000或1,000,000中性粒细胞时，提示可以使用一个小于600000的中性粒细胞。
本文描述的协议，仅评估内皮激活的程度，因为本身并没有预先激活，或以任何方式处理，这当然是一种选择，如果你的特定的分析需要的中性粒细胞。我们发现，E-选择素的表达对肿瘤坏死因子治疗是非常重要的HMVEC龙在这个实验中的嗜中性粒细胞的附件，与以前观测27。 E-选择素，中性粒细胞表面上的glycomolecules静电结合相对较弱，但在流动条件下，这些相互作用被认为是诱发高亲和力的中性粒细胞和内皮细胞1,7-10之间的整合素介导的附件。因此，此法可能是表示在炎症的初始步骤，芳E必要捕捉到中性粒细胞从血管。尽管如此，我们已证实与TNFα在本报告中获得的结果是高度相似的，如果不相同，使用流量控制模块（数据未示出）获得的，表示静态吸附试验的结果，这是生理上相关的，并表明，该测定研究者没有访问的流程图系统是特别有用的。
变体所描述的测定，用钙黄绿素的作为检测荧光基团，首先描述在1993年28,29。更重要的是，这些最初的报告发现，钙黄绿素不影响细胞活力，细胞功能影响最小的附着力检测相比其他衍生荧光染料29,30。另据报道，细胞数量是线性的荧光强度，符合我们所观察（ 图3A）28。初步报告还强调，萤光检测法的主要优点是，他们不需要放射性标记（ 例如，111位或51点）的纯化白细胞31-33。放射性标记的细胞使用钙黄绿素AM标记细胞的优点和一致性已经彻底前面所讨论的28,29,34。虽然我们使用钙黄绿素AM标记中性粒细胞在我们的实验中，其他一些细胞透性染料酯酶基板。例如，Life Technologies公司销售钙黄绿素CellTrace红-橙色（C34852），钙黄绿紫（C34858）和钙黄绿素蓝（C34853），在不同波长的激发/发射。不同的染料每个人都有自己的优点和缺点。例如，钙黄绿素的红橙色AM染料具有一些固有的荧光，前水解18。
我们用这种方法来研究炎症激活的内皮细胞，细菌和内源性因子（如肿瘤坏死因子），和日我们用从尸体收集，可扩展HMVECs足够的数量做适当的控制与检测，并复制到足够进行统计分析。可以想象，该法也可以被用来作为一种工具来研究基于内皮细胞的疾病的过程，涉及到微血管内皮细胞的白细胞结合。可能会对研究使用HMVECs从患者的疾病，例如慢性阻塞性肺疾病（COPD），败血症，炎症性肠疾病，血管炎，如抗中性粒细胞细胞质抗体（ANCA）相关性血管炎，脑血管畸形35-40 。例如，可收集HMVECs从人类性血管炎或败血症宰后，或潜在的病人都发生了活检或手术切除的器官，和它们的结合，以评估在不同条件下的嗜中性粒细胞的内皮细胞基础的疾病的进程。但是，此法需要有足够的扩展，以形成融合单层HMVECs，从而HMVECs的数量时，多次传代后使用。这个过程中的膨胀可能会导致在内皮细胞中的表型变化，这将需要考虑在设计使用主从EC为基础的疾病的患者的内皮细胞的研究。然而，这个实验的多功能性使得它可以适应许多其他类型的细胞粘附和白细胞。事实上，这个实验中，或它的变体，已被成功地用于内皮细胞与其他类型的初级细胞和细胞系，如单核细胞，THP-1，Jurkat细胞，HL-60和U937 28,31,41。此法已被证明是经济快速，容易执行，重现性和高度敏感的，因此是一个非常有用的工具来检测内皮细胞激活炎症介质。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由加州大学旧金山分校的麻醉和围手术期护理部的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
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