Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

כמותי Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים המאפשרים

Abstract

האנדותל של כלי הדם ממלא חלק בלתי נפרד בתגובה הדלקתית. בשלב החריף של דלקת, תאי האנדותל (ECs) מופעלים על ידי מתווכים מארחים או ישירות על ידי רכיבים נשמרים חיידקים או מולקולות סכנת מארח הנגזרות. ציטוקינים הופעלו ECS Express, כמוקינים ומולקולות הדבקה שיתגייסו, להפעיל ולשמור על כדוריות דם לבנות באתר של זיהום או פציעה. הנויטרופילים הם לויקוציטים הראשון שהגיע, ולדבוק האנדותל באמצעות מגוון רחב של מולקולות הדבקה בהווה על פני השטח של שני התאים. תפקידיה העיקריים של נויטרופילים הם לחסל את החיידקים ישירות איומים, לקדם הגיוס של לויקוציטים אחר דרך שחרורו של גורמים נוספים, וליזום תיקון פצע. לכן, גיוסם וההתקשרות לאנדותל הוא שלב קריטי בייזום של התגובה הדלקתית. בדו"ח זה, אנו מתארים בassay הידבקות נויטרופילים מבחנה באמצעותcalcein AM-שכותרתו נויטרופילים אנושיים עיקריים לכמת את מידת הפעלת תא אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים. לשיטה זו יתרון הנוסף שאותם הדגימות נבדקות ועל ידי ספקטרופוטומטריה הקרינה יכולות גם להיות דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה איכותית יותר של כריכת נויטרופילים.

Introduction

מאז האנדותל של כלי הדם הוא במגע ישיר עם הדם במחזור, הוא ממוקם באופן ייחודי כדי ליזום תגובה דלקתית מהירה במהלך זיהום או פציעה. תאי האנדותל (ECs) הקולטנים דפוס הכרה מפורש שמזהים מגוון רחב של רכיבים נשמרים חיידקים ומולקולות סכנה, וקולטנים למארחות מתווכים דלקתיים כגון TNFα. הפעלה של קולטנים אלה גורמת להפריש ציטוקינים ECs (למשל IL-6, IL-8, CXCL1 וCCL2), וכדי upregulate מולקולות דבק (למשל E / P-selectin, VCAM-1 וICAM-1) בתא השטח שלהם 1 , 2. מולקולות אלה כל להקל על הלוקליזציה של לויקוציטים לאתרים של זיהום ופגיעה במטרה לנקות את המארח של חומרים מזהמים וליזום תיקון רקמות 3,4. תגובת נויטרופילים לזיהום כרוכה ביחסי גומלין מתואם היטב בין האנדותל של כלי הדם ולהגיב נויטרופילים. עם הפעלת EC, IL-8 מופרש ויוצרים שיפוע intravascular על האנדותל המאפשר לבית נויטרופילים לאתר של זיהום או פגיעה 5,6. לכידת נויטרופילים E / P-selectins לתווך ומתגלגל באמצעות עמותות חלשות יחסית עם glycomolecules על פני תא נויטרופילים. אינטראקציות אלה, יחד עם IL-8 נקשרים לרצפטורים מאותו המקור שלו, להקל על התקשרות האיתנה, integrin בתיווך וסופו של דבר מעצרו של נויטרופילים על פני התא האנדותל 7-10. לאחר מעצרו, נויטרופילים יכולים לנדוד אל מחוץ לכלי דם לאתרים הספציפיים של זיהום לחסל פתוגנים ישירות, ליצור מלכודות תאי נויטרופילים כדי למנוע ההתפשטות של פתוגנים, לקדם ריפוי פצע ולשחרר גורמים נוספים שמגייסים לויקוציטים אחר כגון מונוציטים, מקרופאגים ודנדריטים תאי 11-17.

שתוארה בדוח זה הוא שיטה במבחנה לכמת דבקות נויטרופילים לmicrovascular ECS לאחר הפעלה על ידי מארח המתווך הדלקתי TNFα. assay זה נועד להעריך את ההפעלה של ECS, ולא נויטרופילים. נויטרופילים אנושיים עיקריים הם ראשון מבודדים באמצעות הפרדת שיפוע צפיפות, ולאחר מכן, שכותרתו עם calcein acetoxymethyl (PM). Esterases בתוך התאים החי Hydrolyze calcein בבוקר ועד מולקולת calcein ניאון מאוד עם עירור של 492-495 ננומטר ופליטות של 513-516 ננומטר 18. את הנויטרופילים fluorescently שהכותרת מודגרת מכן עם monolayers EC, ונויטרופילים שאינם חסיד הם הוסרו לאחר מכן. הקרינה של נויטרופילים הנותרים, כבול לאחר מכן נמדד בעזרת ספקטרופוטומטר הקרינה, ומחושבת כאחוז מקלט הקרינה נויטרופילים המוחלט בכל טוב. לשיטה זו יתרון הנוסף שנויטרופילים הכפותים calcein שכותרתו משמשים בספקטרופוטומטריה ניתן ישירות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתת איכותי יותר לקרוא מתוך EC ACtivation. מאז assay זה מתבצע בתנאים סטטיים, רק את האירועים מאוד ראשוניים המתרחשים במפל הידבקות נויטרופילים ייבחנו. זה אושר בדוח זה באמצעות נוגדנים החוסמים דואר selectin להראות כי דבקות נויטרופילים לריאות אנושית TNFα שטופל כלי הדם EC (HMVEC-ריאות) monolayers מצטמצמת באופן דרסטי כשמופרת האינטראקציה עם E-selectin.

בנוסף לTNFα, השתמשו בהצלחה assay זה כדי לקבוע את מידת הפעלת EC וריד טבור האנושית (HUVEC) על ידי הקולטן חיוג כמו אגוניסטים 1/2 ליפופרוטאין peptidoglycan קשורה (PAL), ליפופרוטאין murein (MLP) וPam3Cys ו הפעלת HMVEC-ריאות על ידי Pam3Cys 19,20. בנוסף, השתמשנו בהצלחה assay זה במעכבי קינאז, ולאחר מציאה RNAi בתיווך של פני השטח וחלבוני cytoplasmic בHMVEC-ריאות, מה שמרמז כי מתודולוגיה זו תואמת עם מגוון רחב של יוכימי וscreening מבחני 20. לסיכום, assay זה מספק דרך קלה לשימוש לשחזור, יותר פונקציונלית, כדי לגשת למידה של הפעלת EC ידי מתווכים דלקתיים במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציפוי ותחזוקה של תאי אנדותל כלי הדם

  1. הפשירי ולגדל תאי אנדותל כלי הדם שלך בהתאם להוראות היצרנים סיפקה. בפרוטוקול זה, תאים גדלו בתקשורת MV EGM-2 (Lonza), ומומלץ כי כל הניסויים מבוצעים תוך שבועיים מהפשרה כדי למזער את כל וריאציה בשל מספר מעבר. הניסויים שלנו עם HMVEC-ריאה מבוצעים בין קטעים 4 עד 9.
  2. יום 1: כאשר תאים מגיעים 80-90% confluency, trypsinize וresuspend ב120,000 תאים למ"ל. צלחת 36,000 תאים (0.3 מ"ל) לכל טוב ל48 היטב, צלחת קלקר תרבית רקמה (ים). כולל בארות של HMVEC שלא יהיה מודגרות עם נויטרופילים על מנת לקבל קריאת הקרינה רקע. אלא אם כן משתמש בצלחות של 48 מתוכננות היטב במיוחד עבור מבחני הקרינה, שורות לסירוגין או עמודות תהיה למזער את זיהום אור מבארות שכנות. הערה: ולס יכול להיות מצופה מראש עם פולי-lysiנה, קולגן או פיברונקטין.
  3. יום 2: הוסף מדיה טריות.
  4. יום 3: על ידי מיקרוסקופ לעומת השלב, לאשר את התאים בריאים (כלומר הופעה "מרוצפת" ופסולת תא קטנה), והם מחוברות 100% (איור 1). אם התאים אינם 100% ומחוברות, לשנות את התקשורת בכל יום עד שהם מוכנים.
  5. ברגע שmonolayers HMVEC מוכנה לטיפול, לשטוף את תאי פעם עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ולהוסיף 0.3 מ"ל של תקשורת טרי EGM-2 MV או מדיה המכיל אגוניסט הדלקתי לבארות המתאימות. בפרוטוקול זה טופלו HMVEC-הריאות עם TNFα [100 ng / ml] (PeproTech, ניו ג'רזי) עבור 3 שעות שכן מדובר במפעיל תאר היטב של ECs 21. הערה: מומלץ שזמן הניסוי שלך, כך שהתאים שלך הופעל HMVEC (שלב 4.1) וCalcein AM נויטרופילים שכותרתו (שלב 3.5) יהיו מוכנים להשתמש בו בזמן. לוקח לנו כ 2.5 שעות לבודד ולתייג neutrophש"ח.

2. בידוד נויטרופילים באמצעות Polymorphprep

  1. לבודד נויטרופילים כפי שתואר קודם לכן 22, או עם פתרון צפיפות שיפוע מוכן לבודד גרנולוציטים polymorphonuclear מכל דם. העסקת Polymorphprep בעקבות הפרוטוקול על ידי Nuzzi, et al. 2007 תוצאות בתשואות של כ 2-3 x 10 6 נויטרופילים לכל מ"ל של דם מלא 23. הערה: כדי למנוע תמוגה הכדורית האדומה מוגזמת, שקיעת dextran להסיר תאי דם אדומים עשויה להתבצע לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות 24.
  2. להביא את פתרון שיפוע צפיפות Polymorphprep RT.
  3. אסוף 30 מ"ל של דם מלא מהתנדבות של אדם בריא בנוכחות נוגדת קרישה כגון הפרין, ציטרט או EDTA. הדם יש להשתמש תוך שעה 2, והמשיך בין 18-22 ° C.
  4. שכבה 5 מ"ל של דם מלא מעל 5 מ"ל של פתרון שיפוע הצפיפות בצינור חרוטי 15 מ"ל (
  5. צנטריפוגה ב XG 450 עבור 30 דקות ב 18-22 ° C. ודא כדי להאיץ לאט למעלה ולמטה צנטריפוגות (כלומר לכבות את בלם צנטריפוגה), ולאזן את הצינורות היטב כדי למנוע תנודות כדי לעזור להפחית את ההפעלה של נויטרופילים ולמנוע הערבוב של שכבות. פעמים צנטריפוגה ארוכות יותר או כוח הצנטריפוגלי גבוה יותר יגרמו לשכבת יקוציט התחתונה, המכילה נויטרופילים, כדי להעביר עוד יותר מטה לכיוון לתאי הדם האדום pelleted.
  6. לשאוב את הפלזמה ולהקת יקוציט עליונה המכילה PBMCs כדי למנוע הזיהום של השכבה המכילה נויטרופילים (איור 2).
  7. השתמש pipet סרולוגיות מיליליטר 1-2 כדי להסיר את השכבה התחתונה המכילה יקוציט נויטרופילים. לשלב את שכבות נויטרופילים לתוך 30 מ"ל של PBS (ללא Ca 2 + ו 2 + Mg) ב50 מ"לצינור חרוטי.
  8. תביא את הנפח של עד 50 מ"ל עם PBS (ללא Ca 2 + ו 2 + Mg) ו צנטריפוגות ב XG 450 עבור 10 דקות ב 18-22 ° C.

הערה: צעדים 2.9 ו 2.10 הם אופציונלי, אך מומלץ ביותר.

  1. לשאוב supernatant. Resuspend את הנויטרופילים ב8 מ"ל של מים סטריליים למשך 30 שניות לlyse תאי דם אדומים, מוסיף את ההשעיה התא באופן מיידי ל2 מ"ל של PBS 5x (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) ולערבב בעדינות ביד. אל דגירה תאים ב מים למשך זמן ארוך יותר מ -30 שניות מאז מות נויטרופילים משמעותיים יכול להתרחש.
  2. צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
  3. לשטוף את תאי פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) ו צנטריפוגות שוב ב 250 XG במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
  4. Resuspend את הנויטרופילים ב 10 מ"ל של RPMI-1640 (ללא פנול האדום) ולספור את תאי החיים באמצעות Blu trypanשיטת הדרה לצבוע דואר. הימנע מתקופות ממושכות של תאי צפיפות גדולה מ 5 x 10 6 למ"ל שכן דבר עלול לגרום להפעלה של נויטרופילים.

3. נויטרופילים תיוג עם Calcein בוקר

  1. 6 10 5 נויטרופילים x משמשים לכל גם צלחת 48 היטב.
  2. לאחר הספירה, להעביר את תאי resuspended לצינור חרוטי 50 מ"ל ולדלל את הנויטרופילים ל2-4 x 10 6 תאים לכל מ"ל עם פנול RPMI-1640 ללא אדום.
  3. הוסף calcein AM פתרון מניות עד 3 מיקרומטר (כלומר μl 2.98 בבוקר של calcein מניית (1 מ"ג / מ"ל) לכל מ"ל של תקשורת) ומערבבים היטב בעדינות על ידי מצליף את הצינורית. גדול מ 5 מיקרומטר AM calcein יגרום לדליפה מנויטרופילים. הערה: לא פלורסנט calcein בבוקר הוא ביקע בתוך התאים על ידי esterases אנדוגניים לייצר מולקולת calcein הניאון ביותר (תאים מתים כלומר לא לזרוח).
  4. לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום ודגירת Fאו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהערה הכהה:. פעמים דגירה ארוכות יותר עלולות לגרום ליותר calcein להיות משוחרר מנויטרופילים במהלך assay ההידבקות.
  5. צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 מעלות צלזיוס, ולשטוף את הנויטרופילים 2x עם 10 מ"ל של RPMI-1640 (ללא פנול אדום; מחוממת מראש ל -37 מעלות צלזיוס). לאחר resuspending התאים ללשטוף את השני, ראשון לעבור את הנויטרופילים למרות סינון סטרילי 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים ולאחר מכן פעם נוספת בצנטריפוגות XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
  6. Resuspend את הנויטרופילים בRPMI 1640 (ללא פנול אדום; מראש חימם עד 37 מעלות צלזיוס) בשעה 2 x 10 6 נויטרופילים למ"ל.

4. Assay מחייב נויטרופילים

  1. שטוף את monolayers HMVEC 3x עם 0.5 מ"ל של המסנן מעוקר RPMI (0.22 מיקרומטר) 1640 (ללא פנול אדום) המכיל 3% BSA בכל טוב.
  2. לשאוב את התקשורת ולהוסיף 6 x 10 5 נויטרופילים calcein שכותרתו (0.3 מ"ל של התא suspension מ"ל), או 0.3 של RPMI 1640 (ללא פנול האדום) ללא נויטרופילים, לבארות המתאימות צלחת הערה 48 היטב:. זו מקבילה של 8 10 5 נויטרופילים x לסנטימטר 2.
  3. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור.
  4. סה"כ נויטרופילים הקרינה (PRE לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד גם עם גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר (מערכת סינון והעמסת) בFLUOstar, או שווה ערך, ספקטרופוטומטר. לבצע שלב זה רק לקראת נקודת סיום הדגירה הערה: בפרוטוקול זה, עירור והגילוי של האור הנפלט calcein בוצעו מהחלק העליון של הבארות שנחשפו, עם זאת, הן יכולות גם להתבצע מהחלק התחתון של הבארות..
  5. שטוף את הבארות המכילות monolayers HMVEC ונויטרופילים 5x עם 0.5 מ"ל לכל טוב של PBS (w / Ca 2 + ו Mg 2 +). הסר את המדיה ושטיפותעל ידי היפוך לצלחת, וטופח בעדינות על מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל שנותר.
  6. הוסף חזרה 0.3 מ"ל של RPMI 1640 (ללא פנול אדום) בכל טוב.
  7. חסיד נויטרופילים הקרינה (POST לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד וגם בשלב 4.4.
  8. לקבוע את הדבקות והעמידה אחוזים ביחס לכל גם:

הערה: בשלב זה, ניתן לקבל תמונות של נויטרופילים calcein שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד ביכולת העמסת מסננים סטנדרטיים. את התמונות באיור 4 התקבלו במיקרוסקופ אולימפוס IX51 הפוך מצוידים Retiga 2000R מצלמה (ש הדמיה) באמצעות Q-Capture Pro7 תוכנה (Q הדמיה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת לקבל תוצאות אמינות, לשחזור באמצעות assay מחייב נויטרופילים, זה חיוני כי הבריאות וconfluency של תאי אנדותל כלי הדם הם אופטימלית ביום של assay, כפי שמודגם בHMVEC-ריאות באיור 1. בנוסף, זוהי חובתו של כלי הדם מספר המעבר הנמוך ECs משמש (כלומר פחות מ 9 קטעים), ובהתאם לכך, אנו ממליצים לבצע את כל הניסויים תוך שבועיים מההפשרה. בריאותם של הנויטרופילים גם היא בעל חשיבות עליונה, במיוחד מאז calcein בבוקר לא יהיה חילוף חומרים למולקולת calcein ניאון אם התאים מורכבים בצורה כלשהי. אנו משתמשים בשיטת הרחקת trypan הכחולה, ולא להמשיך עם assay אם חלק משמעותי של התאים מתים (כלומר מוכתם).

ישנן מספר דרכים לבודד את הנויטרופילים, כולל שיפוע צפיפות ושיטות הפרדה בעמודה המבוססות על אנטיגן, וכל אחדאלה צריכים להספיק להליך זה. אנחנו בחרנו להשתמש בפתרון שיפוע צפיפות המוכן Polymorphprep מציר-מגן. כפי שניתן לראות בתרשים 2, את PBMCs נמצא בשכבה העליונה, ואילו את הנויטרופילים נמצאים בשכבה התחתונה לאחר צנטריפוגה. שכבת PBMC היא aspirated על מנת למנוע זיהום של גרנולוציטים לאחר הסרתם. חשוב לציין כי שלב 2.9, שבו מים הוא הוסיף lyse כל תאי דם אדומים שנותרו, הוא אופציונלי. עם זאת, בזמן שהוא אידיאלי כדי להסיר את כל אריתרוציטים מזהמים, זה קריטי, כי את הנויטרופילים לא יושבים במים טהורים יותר מהשנייה 30 לאחר שמוות רב יכול להתרחש.

לבסוף, נויטרופילים מודגרת עם calcein AM למשך 30 דקות, ולשטוף בresuspended (37 ° C) מחוממים מראש RPMI-1640 תקשורת (ללא פנול אדום). חשוב להשתמש במדיה בלי פנול אדום, מה שיכול להפריע לקריאת הקרינה. מספר neutrophils הוסיף לבארות הוא שרירותי למדי, ובלבד שאת קריאות הקרינה מראש ולשטוף את הפוסט הן בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר, ואת ההבדלים בין הטיפולים כי גם לקדם או למנוע דבקות נויטרופילים יכולים להיות reproducibly הובררו (ראה להלן). אנו מוצאים כי הקרינה OD 520nm נמצא בטווח ליניארי כאשר 10,000 ל 1,000,000 נויטרופילים שכותרתו מנותחים (איור 3 א). מעניין לציין, כי אנו מוצאים גם שדבקות אחוזים מגדילה כמתווספים יותר נויטרופילים לmonolayers HMVEC-ריאות שטופלו בTNFa [100 ng / ml] עבור 3 שעות (איור 3). אנחנו בחרנו כדי לדגור נויטרופילים calcein שכותרת HMVEC-ריאות ויחד במשך 20 דקות, שכן אנו מוצאים כי אחוז ההידבקות אינו מגדיל באופן משמעותי לאחר נקודת זמן מסוימת (מידע לא מוצג) זה. ראוי לציין, בassay זה שנהגנו, קלקר ברור סטנדרטי צלחות 48 היטב ומצאתי כי רמת הקריאה צולב על הקרינה בין tהוא הבארות לא יעמוד על יותר מ -0.5% מקלט הקרינה הכולל (מידע לא מוצג). יחד עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בצלחות של 48 גם עשו בכוונה לקריאה ספקטרופוטומטר הקרינה לניסויים יותר רגישים, אם הוא זמין, או לכל הפחות, תכנון הניסוי שלך כדי למזער את קריאות צולבות מעלה (ראה שלב 1.2).

על מנת להוכיח כי במספר הנויטרופילים נוספו לבארות הוא כל עוד המספר נוסף הוא בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר שרירותי למדי, ביצענו assay הידבקות נויטרופילים עם HMVEC-TNFα ריאות שטופלו בהיעדר או הנוכחות של p38 MAPK-מעכב BIRB7906, תוך שימוש בכמויות משתנות קלט של נויטרופילים (כלומר 40,000 / היטב, 200,000 / טוב או 1,000,000 / טוב) 25. p38-MAPK בעבר הוכח שיהיה צורך לביטוי E-selectin בTNFα טופל האנושי ECS, ועיכוב שלה ולכן צריך להפחית מחייב נויטרופילים לריאות HMVEC-TNFα המופעל26. למעשה, זה מה שאנו רואים (איור 3 ג). אמנם אנו מוצאים כי דבקות אחוזים מגדילה כהם הוסיפו עוד נויטרופילים, ודבקות אחוזים עשויה להיות שונה בין ניסויים, בשל גורמים שונים, כגון וריאציות בין תורם, באיכות של נויטרופילים וצפיפות של HMVEC במפגש, הדבקות היחסית בין תנאים נשאר קבוע יחסית בכל ניסוי עצמאי ללא תלות במספר הנויטרופילים המוספים (איור 3 ג ומידע לא מוצגים). נתונים אלה גם מדגימים למה זה טוב יותר כדי להציג את נתוני הידבקות כמו ביחס לביקורת חיובית לעקביות בין ניסיונית.

כדי להמחיש באופן מלא כיצד assay זה עובד, ביצענו assay הידבקות נויטרופילים עם TNFα טופל HMVEC-ריאות מראש טופח גם עם נוגדן שליטה או נוגדן חסימת דואר selectin. E-selectin בא לידי ביטוי על פני השטח EC לאחר טיפול ובלוכד TNFa neutrophils מכלי הדם דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם glycomolecules מציג על פני השטח נויטרופילים 1,27. כפי שניתן לראות באיור 4 א הבחינה המספרית, באופן גרפי באיור 4B וחזותי באיור 4C, HMVEC-TNFα הריאות שטופלו-טופחה מראש עם נוגדן E-selectin חייב ~ נויטרופילים 75% פחות מTNFα טופל HMVEC-ריאות מראש מודגרות עם השליטה IgG. הדבר מצביע על דואר selectin ממלא תפקיד חשוב בקשירת נויטרופילים לריאות בHMVEC-assay ההידבקות סטטית שלנו.

איור 1
איור 1. דוגמה לmonolayers בריאה, מחוברות HMVEC-ריאות. שים לב להופעה "המרוצפת" וכולל confluency של monolayers. תמונות צולמו בהגדלה 4X ו10X על מיקרוסקופ הפוכה פישר סיינטיפיק Micromaster דיגיטלית. איור 2
איור 2. הדם וPolymorphprep כל שכבות לפני צנטריפוגה () ונפרדו לאחר צנטריפוגה (ב '). שימו לב שלאחר צנטריפוגה, PBMCs להקים להקה עליונה ברורה, ואילו גרנולוציטים polymorphonuclear (הנויטרופילים) להקים להקה תחתונה ברורה.

איור 3
איור 3. הקשר בין מספר נויטרופילים והקרינה OD 520nm הוא ליניארי; ההידבקות של נויטרופילים אחוזים לעליות HMVEC-TNFα ריאות שטופלו כמו יותר נויטרופילים מתווספות; p38-MAPK מקדם דבקות נויטרופילים לריאות monolayers HMVEC-TNFα המופעל () גרף. המתאר את Lineaמערכת יחסים בין הקרינה r OD 520nm ומספרי נויטרופילים מעל שני סדרי גודל. ערך R2 של 0.996 מציין קשר לינארי בין מספר נויטרופילים והקרינה OD 520nm כאשר 10,000 ל 1,000,000 נויטרופילים מנותחים. (ב) ייצוג גרפי של דבקות אחוזים, כאשר מספרים שונים של נויטרופילים calcein שכותרתו נוספו למטופל או שטופל TNFα ( 100 ng / mL;. Monolayers HMVEC-ריאות 3 שעות) בצלחות 48 היטב (ג) monolayers HMVEC-ריאות היו מראש הודגרו עם מעכב p38-MAPK BIRB796 (10 מ"מ) (אקסון Medchem) או DMSO (שליטה) עבור שעה 1 לפני TNFa (100 ng / ml) לטיפול בשעה 3 ואילו בנוכחות רציפה של BIRB796 (10 מ"מ). הדבקות היחסית חושבה כמו בשלב 4.8. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SD. GraphPad פריזמה מבחן t מזווג שימש לניתוח סטטיסטי (N = 3) (TNFα שטופל לעומת TNFα שטופל בתוספת BIRB796). P-ערך ** <0.01; *** &# 60;. 0.001 לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. דואר selectin מקדם את הדבקות של נויטרופילים לTNFa טופל HMVEC-ריאות. HMVEC-ריאות טופלו בTNFα [100 ng / ml] עבור 3 שעות. לאחר שטיפת HMVEC-הריאות עם RPMI 1640 המכיל 3% BSA (שלב 4.1), או הכבשים IgG [50 מיקרוגרם / מ"ל] (5-001-; מו"פ מערכות) או נוגדן polyclonal דואר selectin (PAB) [50 מ"ג / מ"ל] (AF724; מו"פ מערכות) נוספו לבארות המתאימות למשך 20 דקות. את monolayers HMVEC-הריאות אז נשטפו שוב עם RPMI-1640 נוספו לפני 6 x 10 5 נויטרופילים בכל טוב עבור 20 דקות נוספות. () החישובים כדי לקבוע אחוזים ודבקות היחסית מוצגים. Calceinפליטת אור נמדדת בננומטר OD 520. רקע OD 520nm הממוצע נגזרת מHMVEC-ריאות בהעדר הטיפול ונויטרופילים TNFα. (ב) ייצוג גרפי של דבקות אחוזים היחסית של נויטרופילים calcein שהכותרת לmonolayers HMVEC-ריאות שלא טופלה או טופל אחרי TNFα מראש דגירה עם או שליטה IgG או E-selectin חסימת PAB. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SD. GraphPad פריזמה מבחן t מזווג שימש לניתוח סטטיסטי (N = 3). מחושב P-ערך היה <0.001. (ג') תמונות של נויטרופילים calcein שהכותרת המאוגדים monolayers HMVEC-ריאות שלא טופלה וTNFα שטופלה מראש מודגרות גם עם שליטת IgG או PAB דואר selectin. דוגמה טובה המכילה 6 x 10 5 נויטרופילים לפני השטיפה עם PBS מוצגת (לשטוף PRE). תמונות מיקרוסקופ אור שקופות מוצגות בעמודה הימנית, ואילו תמונות הקרינה של אותו השדה של התייחסות, באמצעות מסנן העמסהנקבע, מוצגים בעמודה השמאלית. תמונות צולמו בהגדלה 10X במיקרוסקופ אולימפוס IX51 ההפוך מצוידים במצלמת 2000R Retiga (Q הדמיה). PRE לשטוף = סה"כ נויטרופילים הקרינה OD 520nm (שלב 4.4); POST לשטוף = חסיד נויטרופילים הקרינה OD 520nm (שלב 4.7); PMN - גרנולוציטים polymorphonuclear; AVG - ממוצע; IgG - כבשים IgG שליטה; E-sel/α-E-selectin - E-selectin חסימת PAB. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר לנויטרופילים מוצלחים / assay הידבקות תא אנדותל כלי הדם הם: 1) שימוש במספר נמוך מעבר (<9), תאי האנדותל בריאים: 2) שמירה על נויטרופילים הבודדים בצפיפות נמוכה (כלומר <5 x 10 6 תאים כביסה ו3) השקדנית של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein ולהשתמש של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein מבעוד מועד כדי למזער את זיהום EC ואובדן calcein מנויטרופילים, בהתאמה; / מ"ל) ולהשתמש בהם בתוך שעתיים של בידוד .

אנו מוסיפים 8 10 5 נויטרופילים x לסנטימטר 2 מתרבית הרקמה גם שטח פנים (600,000 נויטרופילים כלומר לכל טוב של צלחת 48 היטב). אנו מוצאים כי קלט של 600,000 נויטרופילים נמצא בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר שלנו, ובאופן אמין מתרבה הנתונים כאשר adherences היחסי נמדדים. עם זאת, ירידה בשיעור דומה מאוד בנויטרופילים מחייבים הוא ציין בassay עיכוב p38-MAPK (איור 3 ג) כאשר 40,000, 200,000 או 1,000,000 נויטרופילים מתווספים לכל טוב, מה שמרמז כי ניתן להשתמש בו פחות מ -600,000 נויטרופילים.

הפרוטוקול מתואר במסמך זה רק מעריך את היקף הפעלת אנדותל מאז נויטרופילים עצמם אינם מופעלים מראש, או שטופלו בכל דרך, וזה כמובן אופציה אם assay הספציפי שלך דורש את זה. אנו מראים כי את הביטוי של E-selectin שבטופל TNFa HMVEC-ריאות היא חשובה לחיבור של נויטרופילים בassay זה, עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות 27. מחייבים אלקטרוסטטי של E-selectin לglycomolecules הנוכחי על פני נויטרופילים הם חלשים יחסית, אבל בתנאי זרימה, אינטראקציות אלה חשבו לגרום את קבצים מצורפים integrin בתיווך גבוהה הזיקה בין נויטרופילים וECS 1,7-10. לכן, assay זה יכול להיות יותר מעיד על הצעדים הראשוניים בדלקת כי arדואר נחוץ כדי ללכוד נויטרופילים מכלי הדם. יחד עם זאת, יש לנו התוצאות שלנו וידאתי שהושגו עם TNFα בדוח זה היו דומים מאוד, אם לא זהה, לאלה שהושגו באמצעות מודול תזרים (מידע לא מוצג), המציינות את התוצאות של assay סטטית זה הם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ומצביע על כך שזה assay שימושי במיוחד לחוקרים שאין להם גישה למערכת זרימה.

וריאציות של assay תאר, באמצעות calcein כfluorophore זיהוי, תוארו לראשונה בשנת 1993 28,29. חשוב מכך, הדיווחים ראשוניים אלה מצאו כי calcein לא השפיע על כדאיות תא והייתה ההשפעה על תפקוד תא לפחות במבחני הידבקות בהשוואה לצבעים והעמסת הנגזרות 29,30 אחרים. כמו כן, דווח כי מספר התא הוא ליניארי ביחס לעוצמת ניאון, עולה בקנה אחד עם מה שאנו רואים (איור 3 א) 28. דיווחים ראשוניים גם הדגישו כייתרון עיקרי של מבחני fluorometric הוא שהם אינם דורשים radiolabeling (למשל 111 או 51 בCr) של כדוריות הדם לבנות 31-33 המטוהרים. את היתרונות והסדירויות של שימוש בתאי AM-שכותרתו Calcein על תאי radiolabeled כבר דנו ביסודיות בעבר 28,29,34. למרות שאנו משתמשים calcein AM לתייג את הנויטרופילים במבחנים שלנו, כמה צבעי permeant סלולריים אחרים, כי הם מצעי esterase זמינים. לדוגמה, חיים טכנולוגיות מוכרת CellTrace calcein אדום כתום (C34852), calcein סגול (C34858) וcalcein כחול (C34853) שמרגש / פולטים באורכי גל שונים. את הצבעים השונים לכל אחד יש יתרונות וחסרונות משלהם. לדוגמה, יש calcein אדום הכתום בבוקר לצבוע כמה הקרינה פנימית לפני הידרוליזה 18.

אנו משתמשים בשיטה זו כדי ללמוד הפעלה דלקתית של האנדותל בתגובה לגורמים חיידקיים ואנדוגני (כגון TNFa), והשלנו להשתמש HMVECs שנאסף מגוויות, אשר ניתן להרחבה בכמות מספקת כדי לעשות את assay עם בקרות נאותות ומספיק חזרות כדי לבצע ניתוחים סטטיסטיים. מתקבל על הדעת, assay זה יכול לשמש גם ככלי ללימוד תהליכי מחלה מבוסס האנדותל הכרוכים בכריכת יקוציט לאנדותל כלי הדם. דוגמאות להפרעות שהיו יכול להיות למדו באמצעות HMVECs מחולים כוללות מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אלח דם, מחלת מעי דלקתית, vasculitides, כגון נוגדן העצמי cytoplasmic נגד נויטרופילים (אנקה) הקשורים vasculitides, ומומים בכלי הדם במוח 35-40 . לדוגמה, יכול להיות שנאסף HMVECs מבני אדם עם vasculitides או אלח דם שלאחר מוות, או שעלול להיות מחולים עם תהליכי מחלה מבוסס אנדותל שעברו כריתה כירורגית של ביופסיה או אורגן, ומחייבם לנויטרופילים המוערכת בתנאים שונים. עם זאת, assay זה דורש מספיקכמויות של HMVECs כדי ליצור monolayers מחוברות, ובכך HMVECs מורחבות ושימוש לאחר קטעים מרובים. תהליך זה של התרחבות עשוי להביא לשינויים בפנוטיפי ECS, שהיית צריכים להילקח בחשבון בתכנון מחקרים באמצעות ECs העיקרי מחולים עם מחלות מבוססות EC. עם זאת, את הרבגוניות של assay זה מאפשרת לו להיות מותאם לסוגי תאים רבים חסיד ויקוציט אחרים. למעשה, assay זה, או גרסאות שלו, ששימש בהצלחה עם סוגי תאי האנדותל אחרים, ותאים ראשוניים וקווים סלולריים כגון מונוציטים, THP-1, Jurkat, HL-60 וU937 28,31,41. assay זה הוכיח להיות מהיר, קל לביצוע, לשחזור ורגיש מאוד, ולכן הוא כלי מאוד שימושי כדי לזהות הפעלת תא האנדותל ידי מתווכים דלקתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי משרד קליפורניה בסן פרנסיסקו של טיפוח הרדמה וPerioperative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

אימונולוגיה גיליון 78 ביולוגיה תאית זיהום ביולוגיה מולקולרית רפואה הנדסה ביו רפואית ביופיזיקה האנדותל כלי דם נויטרופילים דלקת מגשרים דלקת נויטרופילים הידבקות לויקוציטים תאי אנדותל assay
כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter