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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Quantitative Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet de

Abstract

L'endothélium vasculaire joue un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire. Pendant la phase aiguë de l'inflammation, les cellules endothéliales (EC) sont activés par des médiateurs d'accueil ou directement par des composants microbiens conservés ou molécules de danger dérivées de l'hôte. Activés CEs cytokines express, des chimiokines et de molécules d'adhésion qui mobilisent, activent et conservent leucocytes au site de l'infection ou de blessure. Les neutrophiles sont les premiers leucocytes à arriver, et adhèrent à l'endothélium à travers une variété de molécules d'adhésion présentes sur les surfaces des deux cellules. Les principales fonctions des neutrophiles sont d'éliminer directement les menaces microbiennes, de promouvoir le recrutement d'autres leucocytes à travers la libération de facteurs supplémentaires, et d'initier la cicatrisation des plaies. Par conséquent, leur recrutement et leur attachement à l'endothélium est une étape critique dans l'initiation de la réponse inflammatoire. Dans ce rapport, nous décrivons un test d'adhérence in vitro en utilisant des neutrophilescalcéine AM-étiqueté neutrophiles humains primaires pour quantifier le degré d'activation des cellules endothéliales microvasculaires, en conditions statiques. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les mêmes échantillons quantifiés par spectrophotométrie de fluorescence peuvent également être visualisés directement par microscopie de fluorescence pour une évaluation plus qualitative de la liaison des neutrophiles.

Introduction

Depuis l'endothélium vasculaire est en contact direct avec le sang circulant, il est situé de façon unique pour initier une réponse inflammatoire rapide lors de l'infection ou de blessure. Les cellules endothéliales (EC) expriment motif récepteurs de reconnaissance qui reconnaissent une variété de composants bactériens conservés et des molécules de danger, et les récepteurs pour les hôtes médiateurs inflammatoires telles que le TNFa. L'activation de ces récepteurs induit EC de sécréter des cytokines (par exemple IL-6, IL-8, CXCL1 et CCL2), et à réguler à la hausse des molécules d'adhésion (par exemple, E / P-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) à leur surface cellulaire 1 , 2. Ces molécules tous facilitent la localisation des leucocytes aux sites d'infection et les blessures afin d'effacer l'hôte des agents infectieux et de lancer la réparation des tissus 3,4. La réponse des neutrophiles à l'infection implique une interaction bien coordonnée entre l'endothélium vasculaire et la réponse neutrophiles. Lors de l'activation CE, IL-8 est sécrété et forme un gradient intra-vasculaire sur l'endothélium qui permet neutrophiles à l'accueil au site de l'infection ou de blessure 5,6. E / P-sélectine médiate neutrophiles capture et rouler à travers les associations relativement faibles avec glycomolecules sur la surface des cellules neutrophiles. Ces interactions, avec liaison de l'IL-8 et de ses récepteurs apparentés, facilitent le solide, l'attachement médiée par l'intégrine et arrêt éventuel de neutrophiles à la surface des cellules endothéliales 7-10. Après l'arrestation, les neutrophiles peuvent migrer hors de la vascularisation des sites spécifiques d'infection à éliminer directement les agents pathogènes, de générer des pièges extracellulaires neutrophiles pour prévenir la propagation d'agents pathogènes, de favoriser la guérison des plaies et libérer des facteurs supplémentaires qui recrutent d'autres leucocytes tels que les monocytes, macrophages et dendritiques cellules 11-17.

Décrite dans le présent rapport est une méthode in vitro pour quantifier l'adhésion des neutrophiles à microVasculaire ECS après activation par l'hôte médiateur inflammatoire TNF. Ce test est conçu pour évaluer l'activation des EC, et non des neutrophiles. Neutrophiles humains primaires sont d'abord isolés par séparation par gradient de densité, et sont ensuite marquées à la calcéine acétoxyméthylique (AM). Estérases l'intérieur des cellules en direct hydrolyze calcéine AM à la molécule de calcéine hautement fluorescent avec une excitation de 492-495 nm et une émission de 513-516 nm 18. Les neutrophiles marquées par fluorescence sont ensuite incubés avec des monocouches CE et neutrophiles non adhérentes sont ensuite éliminés. La fluorescence des autres, les neutrophiles lié est ensuite mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence, et calculé en pour cent de l'apport total par fluorescence neutrophiles bien. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les neutrophiles liés calcéine marqués utilisés en spectrophotométrie peuvent être directement visualisées par microscopie à fluorescence pour donner une plus qualitative lire des CE acvation. Depuis cet essai est effectué dans des conditions statiques, seuls les événements très initiales qui se produisent dans la cascade de l'adhésion des neutrophiles seront évalués. Ceci est confirmé dans ce rapport en utilisant des anticorps bloquants E-sélectine à montrer que l'adhésion des neutrophiles au TNFa humain poumon traité CE microvasculaire (HMVEC-Lung) monocouches est considérablement réduite lorsque l'interaction avec E-sélectine est perturbé.

En plus de TNF, nous avons utilisé avec succès ce test pour déterminer l'étendue de la veine activation humaine ombilical CE (HUVEC) par le récepteur Toll-like de 1/2 agonistes lipoprotéine associée à un peptidoglycane (PAL), murein lipoprotéine (MLP) et Pam3Cys et activation HMVEC-Lung par Pam3Cys 19,20. En outre, nous avons utilisé avec succès ce test avec les inhibiteurs de kinases et après knockdown ARNi médiée de surface et protéines cytoplasmiques dans HMVEC-Lung, ce qui suggère que cette méthode est compatible avec une variété de biochimie et screenindosages g 20. En résumé, ce test fournit une interface facile à utiliser, de façon reproductible, plus fonctionnel pour accéder à l'importance de l'activation CE par des médiateurs inflammatoires in vitro.

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Protocol

1. Placage et l'entretien des cellules endothéliales microvasculaires

  1. Décongeler et faire croître les cellules endothéliales microvasculaires selon les fabricants fournis instructions. Dans ce protocole, les cellules ont été cultivées dans EGM-2 médias MV (Lonza), et il est recommandé que toutes les expériences sont effectuées dans les deux semaines suivant la décongélation de minimiser toute variation due au nombre de passages. Nos expériences avec HMVEC-Lung sont effectués entre les passages 4 à 9.
  2. Jour 1: Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, trypsiniser et remettre à 120.000 cellules par ml. Plate 36.000 cellules (0,3 ml) par puits dans 48 puits, plaque de culture tissulaire en polystyrène (s). Inclure les puits de HMVEC qui ne sera pas mis à incuber avec des neutrophiles afin d'obtenir une lecture de fluorescence de fond. À moins d'utiliser des plaques à 48 puits spécialement conçues pour les essais par fluorescence, des lignes ou des colonnes en alternance permettra de minimiser toute contamination lumière des puits voisins. NOTE: Les puits peuvent être pré-enduit de poly-lysiNE, collagène ou fibronectine.
  3. Jour 2: Ajouter des milieux frais.
  4. Jour 3: En microscopie en contraste de phase, confirment les cellules sont en bonne santé (c. apparence "pavé" et peu de débris cellulaires), et ils sont 100% de confluence (Figure 1). Si les cellules ne sont pas 100% de confluence, changer les médias tous les jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts.
  5. Une fois les monocouches HMVEC sont prêts pour le traitement, laver les cellules une fois avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et ajouter 0,3 ml d'EGM-2 médias ou médias MV frais contenant agoniste inflammatoire dans les puits appropriés. Dans ce protocole, le HMVEC-pulmonaire ont été traités avec le TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) pendant 3 heures car il s'agit d'un activateur bien décrit des EC 21. NOTE: Il est recommandé de temps votre expérience afin que vos cellules HMVEC activés (étape 4.1) et calcéine AM neutrophiles marquées (Étape 3.5) sont prêts à utiliser en même temps. Il nous faut environ 2,5 heures pour isoler et étiqueter neutrophILS.

2. Isolement des neutrophiles en utilisant Polymorphprep

  1. Isoler les neutrophiles, comme décrit précédemment 22, ou avec une solution de gradient densité ready-made pour isoler les granulocytes neutrophiles dans le sang total. Employant Polymorphprep suivant le protocole par Nuzzi et.al. résultats 2007 des rendements d'environ 2-3 x 10 6 neutrophiles par ml de sang total 23. REMARQUE: Pour éviter la lyse des érythrocytes excessive, une sédimentation dextran pour éliminer les globules rouges peut être effectuée avant la centrifugation de gradient de densité 24.
  2. Porter la solution à gradient de densité Polymorphprep à RT.
  3. Recueillir 30 ml de sang total à partir d'un volontaire humain sain, en présence d'un anticoagulant tel que l'héparine, le citrate ou l'EDTA. Le sang doit être utilisé dans les 2 heures et maintenue entre 18-22 ° C.
  4. Couche 5 ml de sang total plus de 5 ml de la solution à gradient de densité dans un tube conique de 15 ml (Figure 2A). Éviter de modifier les volumes de sang et la solution de gradient de densité, car cela pourrait modifier les conditions de centrifugation ultérieures.
  5. Centrifuger à 450 g pendant 30 min à 18-22 ° C. Assurez-vous d'accélérer lentement de haut en bas de la centrifugeuse (c.-à désactiver le frein de la centrifugeuse), et d'équilibrer les tubes bien pour éviter les vibrations pour aider à réduire l'activation des neutrophiles et d'empêcher le mélange des couches. Temps de centrifugation ou la force centrifuge plus élevé se traduira par la couche leucocytaire inférieure, qui contient des neutrophiles, de migrer plus loin vers les globules rouges agglomérés.
  6. Aspirer le plasma et la bande de leucocytes supérieur contenant CMSP pour empêcher la contamination de la couche contenant les neutrophiles (figure 2B).
  7. Utiliser une pipette sérologique 1-2 ml pour enlever la couche de leucocytes polynucléaires neutrophiles inférieur contenant. Combiner les couches de neutrophiles dans 30 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) dans un 50 mltube conique.
  8. Porter le volume à 50 ml avec du PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 450 g pendant 10 min à 18-22 ° C.

Remarque: Les étapes 2.9 et 2.10 sont facultatives mais fortement recommandées.

  1. Aspirer le surnageant. Reprendre le neutrophiles dans 8 ml d'eau stérile pendant 30 secondes pour lyser les globules rouges, ajouter immédiatement la suspension de cellules à 2 ml de 5x PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et mélanger délicatement à la main. Ne pas incuber les cellules en l'eau pendant plus de 30 secondes depuis la mort de neutrophiles importante peut se produire.
  2. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  3. Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) et centrifuger à 250 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  4. Reprendre les neutrophiles dans 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol) et de compter les cellules vivantes en utilisant le bleu trypanteindre méthode d'exclusion. Éviter les périodes prolongées de fortes densités cellulaires supérieures à 5 x 10 6 par ml, car cela pourrait entraîner une activation des neutrophiles.

3. Neutrophiles étiquetage avec Calcein AM

  1. 6 x 10 5 cellules neutrophiles sont utilisés par puits d'une plaque à 48 puits.
  2. Après le dépouillement, transférer les cellules remises en suspension dans un tube conique de 50 ml et diluer les neutrophiles à 2-4 x 10 6 cellules par ml de rouge de phénol libre RPMI-1640.
  3. Ajouter calcéine AM solution stock à 3 pm (ie 2,98 ul de calcéine AM stock (1 mg / ml) par ml de milieu) et bien mélanger en tapotant doucement le tube. Plus de 5 uM AM calcéine va entraîner une fuite des neutrophiles. Remarque: non fluorescent calcéine AM est clivée dans les cellules par des estérases endogènes pour produire la molécule hautement fluorescent calcéine (ie les cellules mortes ne fluorescence).
  4. Couvrez le tube avec du papier d'aluminium et laisser incuber for 30 min à 37 ° C dans l'obscurité. Remarque: des temps d'incubation plus longue peut entraîner une plus calcéine être libérée des neutrophiles au cours de l'essai d'adhésion.
  5. Centrifugeuse à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C, et laver les neutrophiles 2x avec 10 ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C). Après remise en suspension des cellules pour le second lavage, d'abord passer les neutrophiles si un filtre stérile de 40 uM à éliminer les agrégats, puis centrifuger une fois de plus à 450 g pendant 5 min à 18-22 ° C.
  6. Reprendre les neutrophiles dans RPMI 1640 (sans rouge de phénol, préchauffé à 37 ° C) à 2 x 10 6 neutrophiles par ml.

4. Essai de liaison des neutrophiles

  1. Laver les monocouches HMVEC 3x avec 0,5 ml de stérilisée par filtration (0,22 um) RPMI 1640 (sans rouge de phénol) contenant 3% de BSA par puits.
  2. Aspirer les médias et ajouter 6 x 10 5 neutrophiles calcéine marqués (0,3 ml de suspension cellulaire), Soit 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) sans neutrophiles, les puits appropriés de la plaque de 48 puits. Note: Ceci est l'équivalent de 8 x 10 5 neutrophiles par cm 2.
  3. Incuber pendant 20 min à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  4. Nombre de neutrophiles Fluorescence (prélavage): Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits avec une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une longueur d'onde d'émission de 520 nm (jeu de filtres fluorescéine) dans un FLUOstar, ou équivalent, spectrophotomètre. Effectuez cette étape juste avant le point final d'incubation Note: Dans ce protocole, calcéine excitation et la détection de la lumière émise ont été réalisés depuis le sommet des puits découverts, mais les deux peuvent également être effectuées à partir du fond des puits..
  5. Laver les puits contenant des monocouches HMVEC et des neutrophiles 5x avec 0,5 ml par puits de PBS (w / Ca 2 + et Mg 2 +). Retirez le papier et les lavagesen inversant la plaque et tapoter délicatement sur du papier absorbant pour enlever le liquide restant.
  6. Rajouter 0,3 ml de RPMI 1640 (sans rouge de phénol) par puits.
  7. Adhérent neutrophiles Fluorescence (POST lavage): Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque puits comme dans l'étape 4.4.
  8. Déterminer le respect de pour cent et adhérence relative par puits:

Remarque: A ce stade, les images des neutrophiles calcéine-marqués peuvent être obtenus en utilisant un microscope capable fluorescence équipé de filtres fluorescéine standard. Les images de la figure 4 ont été obtenus sur un Olympus IX51 microscope inversé équipé d'une caméra 2000R Retiga (Q Imaging) en utilisant Q-Capture logiciel Pro7 (Q Imaging).

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Representative Results

Afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles en utilisant un test de liaison des neutrophiles, il est essentiel que la santé et la confluence des cellules endothéliales microvasculaires sont optimales le jour de l'essai, comme illustré avec HMVEC-Lung à la figure 1. En outre, il est impératif que nombre passage bas microvasculaire EC sont utilisés (soit moins de 9 passages), et en conséquence, nous conseillons d'effectuer toutes les expériences dans les deux semaines suivant la décongélation. La santé des neutrophiles est également de la plus haute importance, surtout depuis calcéine AM ne sera pas métabolisée à la molécule de calcéine fluorescente si les cellules sont composées d'une certaine manière. Nous utilisons la méthode d'exclusion au bleu trypan, et ne pas procéder au dosage si une proportion significative des cellules sont morts (soit teinté).

Il ya plusieurs façons d'isoler les neutrophiles, notamment gradient de densité et les méthodes de la colonne de séparation à base d'antigènes, et l'un desceux-ci devraient suffire pour cette procédure. Nous avons choisi d'utiliser la solution de gradient de densité ready-made Polymorphprep d'Axis-Shield. Comme on peut le voir sur la figure 2, les CMSP sont présents dans la couche supérieure, tandis que les neutrophiles sont dans la couche inférieure après centrifugation. La couche PBMC est aspiré afin d'éviter la contamination des granulocytes lors de leur enlèvement. Il est important de noter que l'étape 2.9, dans lequel l'eau est ajoutée à lyse des globules rouges restants, est facultatif. Cependant, alors il est idéal pour supprimer tous les érythrocytes contamination, il est essentiel que les neutrophiles ne siègent pas dans l'eau pure pendant plus de 30 secondes après que la mort considérable peut se produire.

Enfin, les neutrophiles sont incubés avec calcéine AM pendant 30 min, lavées et remises en suspension dans préchauffé (37 ° C) RPMI-1640 (sans rouge de phénol). Il est important d'utiliser les médias sans rouge de phénol, ce qui peut interférer avec la lecture de fluorescence. Le nombre de NEUTRophils ajoutés aux puits est plutôt arbitraire, à condition que les lectures de fluorescence pré-et post-lavage se situent dans la gamme linéaire du spectrophotomètre, et les différences entre les traitements qui favorisent ou empêchent l'adhésion des neutrophiles peut être reproductible constaté (voir ci-dessous). Nous constatons que la fluorescence OD 520nm est dans la plage linéaire lorsque 10.000 à 1.000.000 neutrophiles marquées sont analysées (figure 3A). Fait intéressant, nous constatons également que le respect pour cent augmente avec le nombre de neutrophiles sont ajoutés aux monocouches HMVEC-pulmonaires traitées avec TNFa [100 ng / ml] pendant 3 heures (figure 3B). Nous avons choisi d'incuber la HMVEC-Lung et neutrophiles calcéine-étiquetés ensemble pendant 20 minutes, car nous constatons que le pourcentage d'adhérence n'augmente pas de façon significative après ce point dans le temps (données non présentées). Fait à noter, dans ce test, nous avons utilisé standard, polystyrène transparent des plaques à 48 puits et constaté que le niveau de fluorescence lectures cross-over entre til puits ne représente pas plus de 0,5% de l'apport fluorescence totale (données non présentées). Néanmoins, nous vous recommandons d'utiliser des plaques à 48 puits à dessein faites pour des lectures de spectrophotomètre de fluorescence pour des expériences les plus sensibles, le cas échéant, ou à tout le moins, la conception de votre expérience de minimiser cross-over lectures (voir l'étape 1.2).

Pour démontrer que le nombre de neutrophiles ajoutés au puits est plutôt arbitraire, tant que le nombre ajoutée est comprise dans la plage linéaire du spectrophotomètre, nous avons effectué un test d'adhésion des neutrophiles avec TNF-traité HMVEC-pulmonaire en l'absence ou la présence de la p38 inhibiteur de la MAPK BIRB7906, en utilisant des quantités variables d'entrée de neutrophiles (par exemple 40.000 / puits, 200.000 / 1.000.000 ou bien / bien) 25. p38 MAPK-a été montré précédemment d'être nécessaire à l'expression E-sélectine dans le TNFa traité EC humaine, et son inhibition devrait donc réduire la liaison des neutrophiles au TNF-activated HMVEC-Lung26. En fait, c'est ce que nous observons (figure 3C). Même si nous constatons que le pour cent adhésion augmente avec le nombre de neutrophiles sont ajoutés, et le respect pour cent peut différer entre les expériences, en raison de divers facteurs tels que les variations inter-bailleurs, la qualité des neutrophiles et la densité de HMVEC à confluence, l'adhérence relative entre les conditions reste relativement constant dans chaque expérience indépendante quel que soit le nombre de neutrophiles ajoutée (figure 3C et données non présentées). Ces données illustrent également pourquoi il est préférable d'afficher les données d'adhérence que par rapport à un contrôle positif pour la cohérence inter-expérimentale.

Afin d'illustrer pleinement la façon dont fonctionne ce test, nous avons effectué un test d'adhésion des neutrophiles avec TNF-traité HMVEC-pulmonaire pré-incubées avec des anticorps soit de contrôle ou un anticorps bloquant E-sélectine. E-sélectine est exprimée sur la surface après le traitement avec CE TNFa et capture NEUTRophils de la vascularisation via des interactions électrostatiques avec glycomolecules présents à la surface des neutrophiles 1,27. Comme le montre numériquement la figure 4A, graphiquement sur ​​la figure 4B et visuellement à la figure 4C, le HMVEC-Lung TNF-traité pré-incubée avec l'anticorps E-sélectine liée ~ 75% de moins que le TNF neutrophiles traité HMVEC-pulmonaire pré-incubé avec commande IgG. Ceci suggère E-sélectine joue un rôle important dans tethering neutrophiles à HMVEC-Lung dans notre analyse de l'adhérence statique.

Figure 1
Figure 1. Exemple de santé, confluentes monocouches HMVEC-poumon. Notez l'apparition de "pavés" et totale confluence des monocouches. Les images ont été prises à un grossissement de 4x et 10x sur un Fisher Scientific Micromaster microscope numérique inversé. Figure 2
Figure 2. Le sang total et Polymorphprep couches avant centrifugation (A) et se sont séparés après centrifugation (B). Notez qu'après centrifugation, les CMSP forment une bande supérieure distincte, alors que les granulocytes polynucléaires neutrophiles () forment une bande inférieure distinct.

Figure 3
Figure 3. La relation entre le nombre de neutrophiles et de fluorescence OD 520nm est linéaire; l'adhérence pour cent des polynucléaires neutrophiles au TNFa traités augmente HMVEC-poumon plus neutrophiles sont ajoutés; p38 MAPK favorise l'adhésion des neutrophiles à des monocouches HMVEC-Lung TNF-activées (A) Graph. représentant la linearelation entre r fluorescence OD 520nm et numéros de neutrophiles plus de deux ordres de grandeur. Une valeur R2 de 0,996 indique une relation linéaire entre le nombre de neutrophiles et de fluorescence OD 520nm lorsque 10.000 à 1.000.000 neutrophiles sont analysés. (B) Représentation graphique de la pour cent adhérence quand un nombre variable de neutrophiles calcéine-marqués ont été ajoutés au traité ou TNF-traité ( 100 ng / ml;. 3 h) monocouches HMVEC-pulmonaires dans des plaques à 48 puits (C) monocouches HMVEC-pulmonaires ont été pré-incubées avec l'inhibiteur p38 MAPK BIRB796 (10 mm) (Axon Medchem) ou du DMSO (témoin) pour 1 h avant de TNFa (100 ng / ml) traitement pendant 3 heures tout en la présence continue de BIRB796 (10 mm). L'adhérence relative a été calculée comme dans l'étape 4.8. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. GraphPad Prism test t apparié a été utilisé pour l'analyse statistique (n = 3) (TNF-traitée contre TNF-traitée ainsi BIRB796). valeur p ** <0,01; *** &# 60;. 0,001 Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. Sélectine E favorise l'adhésion des neutrophiles à TNFa-traitée HMVEC-Lung. HMVEC-pulmonaire ont été traités avec le TNFa [100 ng / ml] pendant 3 heures. Après avoir lavé le HMVEC-Lung avec RPMI 1640 contenant 3% de BSA (étape 4.1), soit IgG de mouton [50 pg / ml] (5-001-A; systèmes de R & D) ou des anticorps polyclonaux E-sélectine (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) ont été ajoutés dans les puits appropriés pour 20 min. Les monocouches HMVEC-pulmonaires ont été ensuite lavées une fois de plus avec du RPMI-1640 avant 6 x 10 5 neutrophiles ont été ajoutés par puits pendant 20 minutes supplémentaires. (A) Les calculs pour déterminer le pour cent et adhérence relative sont affichés. Calceinémission de lumière est mesurée à DO 520 nm. Contexte OD 520nm moyenne est dérivée de HMVEC-pulmonaire en l'absence de traitement TNFa et neutrophiles. (B) Représentation graphique de l'adhérence relative pour cent de neutrophiles calcéine marqués sur des monocouches HMVEC-pulmonaires non traitées ou TNF-traitée après une pré-incubation avec soit le contrôle IgG ou E-sélectine bloquant CAP. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. GraphPad Prism test t apparié a été utilisé pour l'analyse statistique (n = 3). Calculé valeur de p était <0,001. (C) Images de neutrophiles calcéine-marquées liées à des monocouches HMVEC-pulmonaires non traitées et TNF-traités en pré-incubées avec soit IgG contrôle ou E-sélectine CAP. Un exemple bien contenant 6 x 10 5 neutrophiles avant le lavage avec du PBS est affichée (prélavage). Images de microscopie optique translucides sont affichés dans la colonne de droite, tandis que les images de fluorescence du même domaine de référence, en utilisant un filtre fluorescéineréglé, sont indiqués dans la colonne de gauche. Les images ont été prises à un grossissement de 10X sur un Olympus IX51 microscope inversé équipé d'une caméra 2000R Retiga (Q Imaging). PRE lavage = Total des neutrophiles fluorescence OD 520nm (étape 4.4); POST lavage = adhérent neutrophiles fluorescence OD 520nm (étape 4.7); PMN - granulocytes neutrophiles; moyenne - moyenne; IgG - contrôle IgG de mouton; E-sel/α-E-selectin - E-sélectine bloquant CAP. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Les étapes les plus importantes pour un neutrophile succès / test d'adhérence des cellules endothéliales microvasculaires sont les suivants: 1) Utilisation de faible nombre de passage (<9), les cellules endothéliales saines; 2) le maintien des neutrophiles isolés à dire <5 x 10 6 cellules de faible densité ( / ml) et de les utiliser dans les deux heures d'isolement, et 3) le lavage fastidieuse des neutrophiles calcéine AM-étiquetés et utiliser des neutrophiles calcéine AM-étiquetés en temps opportun pour minimiser la contamination CE et la perte de calcéine des neutrophiles, respectivement .

Nous ajoutons 8 x 10 5 neutrophiles par cm 2 de culture de tissus et de la région de surface (c. 600.000 neutrophiles par puits d'une plaque de 48 puits). Nous constatons que l'entrée de 600.000 neutrophiles est dans la plage linéaire de notre spectrophotomètre, et reproduit de manière fiable des données lorsque les adhésions relatives sont mesurées. Toutefois, une diminution très similaire à la liaison des neutrophiles est observée dans latest d'inhibition de p38 MAPK-(figure 3C) lorsque 40.000, 200.000 ou 1.000.000 neutrophiles sont ajoutés par puits, ce qui suggère que moins de 600.000 neutrophiles peuvent être utilisées.

Le protocole décrit ici seulement d'évaluer l'ampleur de l'activation endothéliale depuis les neutrophiles eux-mêmes ne sont pas pré-activée, ou aucun traitement, ce qui est bien sûr une option si votre dosage particulier l'exige. Nous montrons que l'expression de E-sélectine sur TNFa-traitée HMVEC-Lung est important pour la fixation des neutrophiles dans cette analyse, en accord avec les observations antérieures 27. La liaison électrostatique de E-sélectine à glycomolecules présents à la surface des neutrophiles sont relativement faibles, mais dans des conditions de flux, ces interactions sont pensés pour induire de haute affinité pièces jointes intégrine-médiation entre les neutrophiles et les CEs 1,7-10. Par conséquent, ce test peut être plus représentatifs des premières étapes de l'inflammation qui are nécessaire pour capturer des neutrophiles de la vascularisation. Néanmoins, nous nous sommes assurés que nos résultats obtenus avec le TNFa dans ce rapport étaient très similaires, sinon identiques, à celles obtenues en utilisant un module de flux (données non présentées), indiquant les résultats de cet essai statique sont physiologiquement pertinente et suggère que ce test est particulièrement utile pour les chercheurs qui n'ont pas accès à un système d'écoulement.

Variations de l'essai décrit, à l'aide calcéine comme fluorophore de détection, ont été décrites en 1993 28,29. Fait important, ces rapports initiaux constaté que calcéine n'affectait pas la viabilité cellulaire et a eu le moins d'effet sur ​​la fonction des cellules dans des tests d'adhérence par rapport à d'autres colorants fluorescéine dérivés de 29,30. Il a également été rapporté que le nombre de cellules est linéaire par rapport à l'intensité de fluorescence, conforme à ce que nous observons (figure 3A) 28. Rapports initiaux ont également souligné qu'unegrand avantage de tests fluorimétriques est qu'ils ne nécessitent pas de marquage radioactif (par exemple 111 ou 51 en Cr) des leucocytes purifiés 31-33. Les avantages et les consistances de l'utilisation de cellules calcéine AM marqués sur les cellules radiomarquées ont été soigneusement discuté précédemment 28,29,34. Bien que nous utilisions AM calcéine d'étiqueter les neutrophiles dans nos tests, plusieurs autres colorants perméants cellulaires qui sont des substrats d'estérase sont disponibles. Par exemple, Life Technologies vend CellTrace calcéine rouge-orange (C34852), calcéine violet (C34858) et bleu calcéine (C34853) qui excitent / émettent à différentes longueurs d'onde. Les différents colorants ont chacun leurs avantages et leurs inconvénients. Par exemple, le colorant rouge-orange AM calcéine a une certaine fluorescence intrinsèque avant l'hydrolyse 18.

Nous utilisons cette méthode pour étudier l'activation inflammatoire de l'endothélium en réponse à des facteurs endogènes et bactériennes (telles que TNFa) et enous utilisons HMVEC recueillies sur des cadavres, qui peut être étendue en quantité suffisante pour faire l'essai avec des contrôles appropriés et répétitions suffisant pour effectuer des analyses statistiques. En théorie, ce test pourrait également être utilisé comme un outil pour étudier les processus de la maladie endothéliale à base qui impliquent la liaison des leucocytes sur l'endothélium microvasculaire. Des exemples de troubles qui pourraient être étudiés en utilisant HMVEC de patients comprennent la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la septicémie, une maladie inflammatoire de l'intestin, vascularites, comme l'auto-anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles (ANCA) vascularites associées, et des malformations vasculaires cérébrales 35-40 . Par exemple, HMVEC pourraient être collectées à partir de l'homme avec vascularites ou un sepsis post-mortem, ou potentiellement des patients atteints de processus pathologiques basés endothéliales qui ont subi une résection chirurgicale ou biopsie d'un organe, et leur liaison aux neutrophiles évalués dans des conditions différentes. Cependant, cette analyse doit être suffisammentquantités de HMVEC pour former des monocouches confluentes et donc HMVEC sont développées et utilisées après de multiples passages. Ce processus d'expansion peut conduire à des changements phénotypiques dans la SCE, qui devraient être pris en compte dans la conception des études reposant sur ECS primaire chez des patients atteints de maladies CE basés. Néanmoins, la polyvalence de cet essai lui permet d'être adapté à de nombreux autres types de cellules adhérentes et des leucocytes. En fait, cet essai, ou des variantes de celle-ci, ont été utilisés avec succès avec d'autres types de cellules endothéliales et les cellules primaires et des lignées cellulaires comme les monocytes, THP-1, Jurkat, HL-60 et U937 28,31,41. Cet essai s'est avéré être rapide, facile à réaliser, reproductible et très sensible, et est donc un outil très utile pour détecter l'activation des cellules endothéliales par des médiateurs inflammatoires.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le ministère de l'UCSF des soins d'anesthésie et de soins périopératoires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

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Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

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