Summary
Neutrofil anslutning till aktiverat endotel vid ställen för infektion är en integrerad del av värdens inflammatoriska svar. Beskrivs i denna rapport är en neutrofil bindningsanalys som möjliggör
Abstract
Den vaskulära endotelet spelar en integrerad del i det inflammatoriska svaret. Under den akuta fasen av inflammation, är endotelceller (EC) aktiveras av värdens medlare eller direkt av konserverade mikrobiella komponenter eller värdhärledda molekyler fara. Aktiverat ECS uttryckliga cytokiner, kemokiner och adhesionsmolekyler som mobiliserar, aktivera och behålla leukocyter vid platsen för infektion eller skada. Neutrofiler är de första leukocyter att komma fram, och hålla sig till endotelet genom olika adhesionsmolekyler närvarande på ytorna av båda cellerna. De viktigaste funktionerna i neutrofiler är att direkt eliminera mikrobiella hot, främja rekrytering av andra leukocyter genom frisättning av ytterligare faktorer, och initiera sårläkning. Därför är deras rekrytering och fastsättning till endotelet ett kritiskt steg vid initieringen av det inflammatoriska svaret. I denna rapport beskriver vi en in vitro neutrofiladhesion analysen medkalcein AM-märkta primära humana neutrofiler för att kvantifiera omfattningen av mikrokärlendotelcell aktivering under statiska förhållanden. Denna metod har den ytterligare fördelen att samma prover kvantifierades genom fluorescens spektrofotometri också kan visualiseras direkt med användning av fluorescensmikroskopi för en mer kvalitativ bedömning av neutrofil bindning.
Introduction
Eftersom det vaskulära endotelet är i direkt kontakt med det cirkulerande blodet, är den unikt beläget för att initiera en snabb inflammatoriskt svar under infektion eller skada. Endotelceller (EC) uttryckliga mönster receptorer erkännande som känner igen en mängd bevarade bakteriella komponenter och molekyler fara, och receptorer för värdens inflammatoriska mediatorer, såsom TNF. Aktivering av dessa receptorer leder EC att utsöndra cytokiner (t.ex. IL-6, IL-8, CXCL1 och CCL2), och att uppreglera adhesionsmolekyler (t ex E / P-selektin, VCAM-1 och ICAM-1) vid sin cellyta en , 2. Dessa molekyler underlättar alla lokaliseringen av leukocyter till ställen för infektion och skada för att rensa värden av smittämnen och initiera vävnadsreparation 3,4. Neutrofilsvaret till infektion innebär en väl samordnad samspelet mellan det vaskulära endotelet och svara neutrofiler. Vid EG-aktivering, IL-8 utsöndras och bildar en intravaskulär gradient på endotel som tillåter neutrofiler till hem till platsen av infektion eller skada 5,6. E / P-selektiner medlar neutrofila fånga och rulla genom relativt svaga samband med glycomolecules på neutrofila cellytan. Dessa interaktioner, tillsammans med IL-8-bindning till dess besläktade receptorer, underlätta robusta, integrin-medierad fastsättning och eventuell häktning av neutrofiler på endotelceller ytan 7-10. Efter gripandet kan neutrofiler migrera ut ur kärlen till de specifika smitthärdarna att direkt eliminera patogener, generera neutrofila extracellulära fällor för att förhindra spridning av patogener, främja sårläkning och släpper ytterligare faktorer som rekryterar andra leukocyter såsom monocyter, makrofager och dendritiska celler 11-17.
Beskrivs i denna rapport är en in vitro-metod för att kvantifiera neutrofil vidhäftning till microvascular ECS efter aktivering av värdens inflammatoriska medlare TNFa. Denna analys är avsedd att bedöma aktivering av ECS och inte neutrofiler. Primära humana neutrofiler är först isoleras med separation densitetsgradient, och märks sedan med kalcein acetoximetyl (AM). Esteraser inom levande celler hydrolyserar calcein AM till den mycket fluorescerande kalcein molekyl med en excitation av 492 till 495 nm och emission av 513-516 nm 18. De fluorescensmärkta neutrofiler inkuberas sedan med EG monoskikt, och icke vidhäftande neutrofiler avlägsnas därefter. Fluorescensen hos de återstående, bundna neutrofiler mäts sedan med användning av en fluorescensspektrofotometer, och beräknas som en procent av den totala neutrofil fluorescens inmatning per brunn. Denna metod har den ytterligare fördelen att de bundna calcein-märkta neutrofiler används i spektrofotometri direkt kan visualiseras med fluorescens mikroskopi för att ge en mer kvalitativ utläses av EG acmotivation. Eftersom denna analys utförs under statiska förhållanden, kommer bara de allra första händelser som inträffar i neutrofiladhesion kaskad bedömas. Detta bekräftas i denna rapport med hjälp av E-selektin blockerande antikroppar för att visa att neutrofila vidhäftning till TNF-behandlad human lunga mikrovaskulära EC (HMVEC-Lung) monolager minskar drastiskt när interaktionen med E-selektin störs.
Förutom TNFa, har vi använt framgångsrikt denna analys för att fastställa omfattningen av mänsklig navelven EG (HUVEC) aktivering genom den Toll-like receptor halv agonister peptidoglykan-associerat lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) och Pam3Cys och HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys 19,20. Dessutom använde vi framgångsrikt denna analys med kinaseinhibitors och efter RNAi-medierad knockdown av ytan och cytoplasmaproteiner i HMVEC-Lung, vilket tyder på att denna metod är förenlig med en rad biokemiska och screening analyser 20. Sammanfattningsvis ger denna analys en lättanvänd, reproducerbar, mer funktionellt sätt att komma åt omfattningen av EG aktivering av inflammatoriska mediatorer in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Plätering och underhåll av mikrovaskulära endotelceller
- Tina och odla dina mikrovaskulära endotelceller enligt tillverkarna medföljande instruktionerna. I detta protokoll odlades celler i EGM-2 MV media (Lonza), och det rekommenderas att alla experiment utförs inom två veckor efter upptining för att minimera eventuell variation som beror på passagenummer. Våra experiment med HMVEC-Lung utförs mellan kanalerna 4 till 9.
- Dag 1: När cellerna når 80-90% konfluens, trypsinize och slamma på 120.000 celler per ml. Plate 36 tusen celler (0,3 ml) per brunn i 48-brunnars, polystyren vävnadsodlingsplatta (er). Inkludera brunnar i HMVEC som inte kommer att inkuberas med neutrofiler i syfte att erhålla en avläsning bakgrundsfluorescens. Om du inte använder 48-brunnars plattor som är särskilt utformade för fluorescensanalyser, alternerande rader eller kolumner kommer att minimera alla ljus förorening från närliggande brunnar. OBS: Brunnar kan vara pre-belagd med poly-LysiNE, kollagen eller fibronektin.
- Dag 2: Lägg färskt medium.
- Dag 3: Med faskontrastmikroskopi, bekräftar att cellerna är friska (dvs. "kullersten" utseende och lite cellsönderfall), och de är 100% sammanflytande (Figur 1). Om cellerna inte är 100% sammanflytande, ändra media varje dag tills de är redo.
- När väl de HMVEC monoskikt är redo för behandling, tvätta cellerna en gång med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och tillsätt 0,3 ml av färska EGM-2 MV material eller material innehållande inflammatorisk agonist till de lämpliga brunnarna. I detta protokoll den HMVEC-Lung behandlades med TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) under 3 timmar eftersom detta är en väl beskrivna aktivator av EC 21. OBS: Vi rekommenderar att du tid experimentet så att dina aktiverade HMVEC celler (steg 4,1) och Calcein AM märkta neutrofiler (Steg 3.5) är redo att använda samtidigt. Det tar oss ca 2,5 timmar att isolera och märka neutrophils.
2. Neutrofil Isolering hjälp Polymorphprep
- Isolera neutrofiler såsom tidigare beskrivits 22, eller med en färdig densitetsgradient lösningen för att isolera polymorfonukleära granulocyter från helblod. Använda Polymorphprep efter protokollet från Nuzzi, et al. 2007 resulterar i utbyten av ca 2-3 x 10 6 neutrofiler per ml helblod 23. OBS: För att undvika överdriven erytrocytlysering, en dextransedimentering att avlägsna röda blodkroppar kan utföras före densitetsgradientcentrifugering 24.
- Ta Polymorphprep lösningen densitetsgradienten till RT.
- Samla 30 ml helblod från en frisk frivillig försöksperson i närvaro av en antikoagulant såsom heparin, citrat eller EDTA. Blodet bör användas inom 2 timmar, och hölls mellan 18-22 ° C.
- Skikt 5 ml helblod över 5 ml av densitetsgradientlösningen i ett 15 ml koniskt rör (
- Centrifugera vid 450 x g under 30 min vid 18-22 ° C. Se till att långsamt påskynda och ned centrifugen (dvs. stänga av centrifugen broms), och balansera rören väl för att förhindra vibrationer för att minska aktivering av neutrofiler och förhindra blandning av skikten. Längre centrifugering gånger eller högre centrifugalkraft kommer att resultera i lägre leukocyt skiktet, som innehåller neutrofiler, att migrera längre ner mot till de pelleterade röda blodkroppar.
- Sug plasma och övre leukocyt band innehållande PBMC för att förebygga förorening av skiktet innehåller neutrofiler (Figur 2B).
- Använd en 1-2 ml serologisk pipett för att ta bort den nedre leukocyt lagret innehåller neutrofiler. Kombinera de neutrofila skikten till 30 ml PBS (utan Ca 2 + och Mg 2 +) i en 50 mlkoniska rör.
- Bringa volymen upp till 50 ml med PBS (utan Ca 2 + och Mg 2 +) och centrifugera vid 450 xg under 10 minuter vid 18-22 ° C.
Notera: Steg 2.9 och 2.10 är valfri men rekommenderas starkt.
- Aspirera supematanten. Resuspendera neutrofiler i 8 ml sterilt vatten under 30 sekunder för att lysera röda blodkroppar tillsätts omedelbart cellsuspensionen till 2 ml 5x PBS (utan Ca 2 + och Mg 2 +) och blanda försiktigt för hand. INTE inkubera celler i vatten längre än 30 sekunder eftersom betydande neutrofila döden kan inträffa.
- Centrifugera vid 250 xg under 5 minuter vid 18-22 ° C.
- Tvätta cellerna en gång med 10 ml PBS (utan Ca 2 + och Mg 2 +) och centrifugera igen vid 250 xg under 5 minuter vid 18-22 ° C.
- Resuspendera neutrofiler i 10 ml RPMI-1640 (utan fenolrött) och räkna levande celler med användning av trypan blue färgexklusion metoden. Undvik långa perioder av celldensiteter större än 5 x 10 6 per ml eftersom detta kan resultera i aktivering av neutrofilerna.
Tre. Neutrofil Märkning med Calcein AM
- 6 x 10 5 neutrofiler användes per brunn i en 48-brunnar.
- Efter räkning, överföra de återsuspenderade celler till ett 50 ml koniskt rör och späd neutrofilerna till 2-4 x 10 6 celler per ml med fenolrött-fri RPMI-1640.
- Lägg kalcein AM stamlösning till 3 iM (dvs. 2,98 pl av kalcein AM lager (1 mg / ml) per ml medium) och blanda väl genom att försiktigt ställa röret. Större än 5 pm AM calcein kommer att resultera i läckage från neutrofiler Anmärkning:. Icke-fluorescerande kalcein AM klyvs i cellerna genom endogena esteraser att producera höggradigt fluorescerande molekyl kalcein (dvs. döda celler kommer inte fluorescerar).
- Täck röret med aluminiumfolie och inkubera feller 30 min vid 37 ° C i mörker Anm:. Längre inkubationstider kan resultera i mer kalcein som befriades från den neutrofiler under loppet av vidhäftningen analysen.
- Centrifugera vid 450 xg under 5 minuter vid 18 till 22 ° C, och tvätta neutrofilerna 2x med 10 ml RPMI-1640 (utan fenolrött, förvärmda till 37 ° C). Efter återsuspendering av cellerna under den andra tvätten, först passera neutrofilerna även om en 40 pM sterilt filter för att avlägsna klumpar och centrifugera sedan en gång till vid 450 xg under 5 minuter vid 18-22 ° C.
- Resuspendera neutrofiler i RPMI 1640 (utan fenolrött, förvärmas till 37 ° C) vid 2 x 10 6 neutrofiler per ml.
4. Neutrofil bindningsanalys
- Tvätta HMVEC monoskikten 3x med 0,5 ml filtersteriliserad-(0,22 pm) RPMI 1640 (utan fenolrött) innehållande 3% BSA per brunn.
- Aspirera media och tillsätt 6 x 10 5 kalcein-märkta neutrofiler (0,3 ml cell suspension), eller 0,3 ml RPMI 1640 (utan fenolrött) utan neutrofiler, till lämpliga brunnar i 48-brunnar Obs. Detta är motsvarigheten till 8 x 10 5 neutrofiler per cm 2.
- Inkubera i 20 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Totalt Neutrophil Fluorescens (Förtvätt): Mät fluorescensintensiteten av varje brunn med en excitationsvåglängd av 485 nm och en emissionsvåglängd av 520 nm (fluorescein filter set) i en FLUOstar, eller motsvarande, spektrofotometer. Utför detta steg strax före inkubation slutpunkt Anmärkning: I detta protokoll var kalcein excitation och detektion av det emitterade ljuset utförs från toppen av de otäckta brunnar, men kan båda också utföras från botten av brunnarna..
- Tvätta brunnarna innehållande HMVEC monolager och neutrofiler 5x med 0,5 ml per brunn av PBS (w / Ca 2 + och Mg 2 +). Ta bort materialet och tvättargenom att vända plattan, och klappa försiktigt på hushållspapper för att avlägsna kvarvarande vätska.
- Lägg tillbaka 0,3 ml RPMI 1640 (utan fenolrött) per brunn.
- Vidhäftande Neutrofil Fluorescens (POST tvätt): Mät fluorescensintensitet för varje brunn som i steg 4.4.
- Bestäm procent följsamhet och relativa följsamhet per brunn:
OBS: I detta skede, kan bilder av kalcein-märkta neutrofiler erhållas genom användning av en fluorescens kapabel mikroskop utrustat med standard fluorescein filter. Bilderna i figur 4 erhölls på en Olympus IX51 inverterat mikroskop utrustat med en Retiga 2000R kamera (Q Imaging) använder Q-Capture Pro7 programvara (Q Imaging).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att erhålla tillförlitliga, reproducerbara resultat med en neutrofil bindningsanalys, är det viktigt att hälso-och confluency av mikrovaskulära endotelceller är optimala dagen för analysen, som illustreras med HMVEC-Lung i figur 1. Dessutom är det absolut nödvändigt att lågt passagetal mikrovaskulära EC används (dvs. mindre än 9 stycken), och därför rekommenderar vi att utföra alla experiment inom två veckor efter upptining. Hälsan hos neutrofiler är också av yttersta vikt, särskilt eftersom kalcein AM inte kommer att metaboliseras till fluorescerande kalcein molekyl om cellerna består på något sätt. Vi använder trypanblått exklusionsmetoden, och inte fortsätta med analysen om en stor del av cellerna är döda (dvs. färgade).
Det finns flera sätt att isolera neutrofiler, inklusive densitetsgradient och antigen-baserade kolumn separationsmetoder, och någon avdessa bör räcka för detta förfarande. Vi valde att använda Polymorphprep färdig lösning densitetsgradient från Axis-Shield. Såsom kan ses i fig 2, de PBMC är närvarande i det övre skiktet, medan neutrofilerna är inom det lägre skiktet efter centrifugering. PBMC skiktet aspireras för att undvika kontamination av granulocyter vid deras avlägsnande. Det är viktigt att notera att steg 2.9, i vilken vatten tillsättes för att lysera eventuella kvarvarande röda blodkroppar, är valfri. Men medan det är perfekt att ta bort alla förorenande erytrocyter, är det viktigt att de neutrofiler inte sitta i rent vatten för mer än 30 sekunder, varefter betydande döden kan inträffa.
Slutligen är de neutrofiler inkuberas med kalcein AM i 30 min, tvättades och återsuspenderades i förvärmda (37 ° C) RPMI-1640-medium (utan fenolrött). Det är viktigt att använda medier utan fenol rött, vilket kan störa fluorescensavläsning. Antalet neutrophils sattes till brunnarna är ganska godtyckligt, förutsatt att fluorescensavläsningarna pre-och post-wash ligger inom det linjära området hos spektrofotometern, och skillnaderna mellan behandlingar som antingen främjar eller förhindra neutrofil vidhäftning kan vara reproducerbart fastställas (se nedan). Vi finner att fluorescens OD 520nm ligger inom det linjära området när 10.000 till 1.000.000 märkta neutrofiler analyseras (figur 3A). Intressant, vi också finna att den procentuella vidhäftningen ökar när fler neutrofiler läggs till HMVEC-Lung monolagren behandlade med TNFa [100 ng / ml] under 3 timmar (Figur 3B). Vi valde att inkubera HMVEC-Lung och kalcein-märkta neutrofiler tillsammans för 20 minuter, eftersom vi tycker att andelen vidhäftningen inte avsevärt ökar efter denna tidpunkt (data visas ej). Av notera, i denna analys använde vi standard, klar polystyren 48-brunnars plattor och fann att nivån av fluorescens cross-over avläsningar mellan tHan brunnar inte uppgå till mer än 0,5% av den totala fluorescens ingång (data visas ej). Ändå rekommenderar vi att du använder 48-brunnars plattor medvetet gjorda för fluorescensspektrofotometer avläsningar för mer känsliga experiment, om sådana finns, eller åtminstone, att utforma experimentet minimera spridning över avläsningar (se steg 1.2).
För att visa att antalet neutrofiler till brunnarna är ganska godtyckligt så länge antalet tillsätts är inom det linjära intervallet av spektrofotometern, utförde vi en neutrofiladhesion analys med TNFa-behandlade HMVEC-Lung i frånvaro eller närvaro av p38 -MAPK hämmare BIRB7906, med varierande input mängder neutrofiler (dvs 40.000 / brunn, 200.000 / brunn eller 1.000.000 / brunn) 25. p38-MAPK har tidigare visat sig vara nödvändigt för e-selektinexpression i TNF-behandlade humana EC, och dess hämning bör därför minska neutrofila bindning till TNF-aktiverade HMVEC-Lung26. I själva verket är detta vad vi observerar (figur 3C). Även om vi tycker att den procentuella vidhäftningen ökar när fler neutrofiler tillsätts, och den procentuella vidhäftningen kan skilja mellan experiment, på grund av olika faktorer såsom inter-givare variationer, kvaliteten på de neutrofiler och tätheten av HMVEC vid sammanflödet, den relativa följsamhet mellan villkor förblir relativt konstant i varje oberoende experiment oavsett antalet av neutrofiler tillsatta (Figur 3C och data ej visade). Dessa uppgifter exemplifierar också varför det är bättre att visa vidhäftning data som i förhållande till en positiv kontroll för inter-experimentella konsistens.
För att till fullo belysa hur denna analys fungerar, utförde vi en neutrofiladhesion analys med TNF-behandlade HMVEC-Lung förinkuberad med antingen kontroll-antikropp eller en E-selektin blockerande antikropp. E-selektin uttrycks på EG ytan efter behandling med TNFa och fångar neutrophils från kärlsystemet via elektrostatiska interaktioner med glycomolecules närvarande på neutrofila ytan 1,27. Såsom visas numeriskt i figur 4A, grafiskt i figur 4B och visuellt i figur 4C, den TNFa-behandlade HMVEC-Lung förinkuberades med E-selektin antikropp bunden ~ 75% färre neutrofiler än den TNFa-behandlade HMVEC-Lung förinkuberades med kontroll-IgG. Detta tyder på E-selektin spelar en viktig roll för att tjudra neutrofiler till HMVEC-Lung i vår statisk adhesionsanalys.
Figur 1. Exempel på friska, sammanflytande HMVEC-Lung monolager. Notera "kullersten" utseende och total confluency av monoskikten. Bilder togs vid 4X och 10X förstoring på en Fisher Scientific Micromaster inverterad digital mikroskop. 
Figur 2. Helblod och Polymorphprep skiktades före centrifugering (A) och separerades efter centrifugering (B). Notera att efter centrifugering, PBMC bilda en distinkt övre bandet, medan polymorfonukleära granulocyter (neutrofiler) bildar en tydlig undre bandet.
Figur 3. Förhållandet mellan neutrofila nummer och fluorescens OD 520nm är linjär, den procentuella vidhäftningen av neutrofiler till TNF-behandlade HMVEC-Lung ökar när fler neutrofiler tillsätts, p38-MAPK främjar neutrofila vidhäftning till TNF-aktiverade HMVEC-Lung monolager (A) Graph. skildrar linear relationen mellan fluorescens OD 520nm och neutrofila siffror över två storleksordningar. En R2 värde på 0,996 indikerar ett linjärt förhållande mellan neutrofil antal och fluorescens OD 520nm när 10 tusen till miljoner neutrofiler analyseras. (B) Grafisk representation av den procentuella vidhäftningen när varierande antal kalcein-märkta neutrofiler sattes till obehandlade eller TNFa-behandlat ( 100 ng / ml, 3. hr) HMVEC-Lung monoskikt i 48-brunnars plattor (C) HMVEC-Lung monoskikt förinkuberades med p38-MAPK-inhibitor BIRB796 (10 mM) (Axon medchem) eller DMSO (kontroll) för 1 h före TNFa (100 ng / ml) behandling under 3 timmar medan i den kontinuerliga närvaron av BIRB796 (10 mM). Den relativa vidhäftningen beräknades som i steg 4.8. Data uttrycks som medelvärde ± SD. GraphPad Prism oparade t-test användes för statistisk analys (n = 3) (TNF-behandlade vs TNF-behandlade plus BIRB796). p-värde ** <0,01; *** &# 60;. 0,001 Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. E-selektin främjar vidhäftningen av neutrofiler till TNFa-behandlad HMVEC-Lung. HMVEC-Lung behandlades med TNFa [100 ng / ml] under 3 timmar. Efter tvättning av HMVEC-Lung med RPMI 1640 innehållande 3% BSA (steg 4.1), antingen får-IgG [50 ^ g / ml] (5-001-A, R & D Systems) eller E-selektin polyklonal antikropp (pAb) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) sattes till de lämpliga brunnarna för 20 min. De HMVEC-Lung monoskikten tvättades sedan ytterligare en gång med RPMI-1640 före 6 x 10 5 neutrofiler tillsattes per brunn under ytterligare 20 min. (A) De beräkningar för att bestämma procent och relativ vidhäftning visas. Calceinljusemission mäts vid OD 520 nm. Bakgrund OD 520nm genomsnitt är härledd från HMVEC-Lung i frånvaro av TNFa behandling och neutrofiler. (B) Grafisk representation av relativ procent vidhäftning av kalcein-märkta neutrofiler till obehandlade eller TNFa-behandlade HMVEC-Lung monoskikt efter förinkubation med antingen kontroll IgG eller E-selektin blockerande pAb. Data uttrycks som medelvärde ± SD. GraphPad Prism oparade t-test användes för statistisk analys (n = 3). Beräknat p-värde var <0,001. (C) Bilder från kalcein-märkta neutrofiler bundna till obehandlade och TNF-behandlade HMVEC-Lung monoskikt förinkuberades med antingen kontroll-IgG eller E-selektin pAb. Ett exempel brunn innehållande 6 x 10 5 neutrofiler före tvättning med PBS visas (förtvätt). Genomskinliga ljusmikroskop bilderna visas i den högra kolumnen, medan fluorescens bilder av samma område av referens, med hjälp av en fluorescein filterinställd, visas i den vänstra kolumnen. Bilder togs vid 10x förstoring på en Olympus IX51 inverterat mikroskop utrustat med en Retiga 2000R kamera (Q Imaging). Förtvätt = total neutrofila fluorescens OD 520nm (Steg 4.4); POST tvätta = vidhäftande neutrofila fluorescens OD 520nm (Steg 4.7), PMN - polymorfonukleära granulocyter, avg - genomsnittet, IgG - får IgG-kontroll; E-sel/α-E-selectin - E-selektin blockerar pAb. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för en lyckad neutrofiler / mikrokärlendotelcell adhesionsanalys är: 1) Användning av låg passage nummer (<9), friska endotelceller, 2) upprätthålla de isolerade neutrofiler vid en låg densitet (dvs. <5 x 10 6 celler / ml) och använder dem inom två timmar av isolering, och 3) Fastidious tvättning av Calcein AM-märkta neutrofiler och användning av Calcein AM-märkta neutrofiler i god tid för att minimera EG kontaminering och förlust av kalcein från neutrofiler, respektive .
Vi lägger 8 x 10 5 neutrofiler per cm 2 av vävnadsodling väl yta (dvs 600.000 neutrofiler per brunn i en 48-brunnar). Vi finner att en ingång på 600.000 neutrofiler ligger inom det linjära intervallet för vår spektrofotometer och tillförlitligt återger data när relativa adherenser mäts. Emellertid är ett mycket liknande minskning i neutrofil bindning observerades ip38-MAPK inhiberingsanalys (figur 3C) när 40.000, 200.000 eller 1.000.000 neutrofiler tillsätts per brunn, vilket tyder på att mindre än 600.000 neutrofiler kan användas.
Protokollet som beskrivs häri endast bedömer omfattningen av endotelceller aktivering eftersom neutrofiler själva inte är föraktiverade, eller behandlas på något sätt, vilket naturligtvis är ett alternativ om din analys kräver det. Vi visar att uttrycket av E-selektin på TNFa-behandlad HMVEC-Lung är viktigt för fastsättningen av neutrofiler i denna analys, vilket överensstämmer med tidigare iakttagelser 27. Den elektrostatiska bindningen av E-selektin till glycomolecules närvarande på den neutrofila ytan är relativt svaga, men under flödesförhållanden, är dessa interaktioner tros inducera hög affinitet integrin-medierade bilagor mellan neutrofiler och ECS 1,7-10. Därför kan denna analys vara mer vägledande för de första stegen i inflammation som are nödvändigt att fånga neutrofiler från kärlsystemet. Icke desto mindre har vi verifierat att våra resultat som erhållits med TNFa i denna rapport var mycket liknande, om inte identiska med, som erhålles med hjälp av ett flöde modul (data visas ej), vilket indikerar resultaten av denna statisk analys är fysiologiskt relevant och föreslår att denna analys är särskilt användbar för forskare som inte har tillgång till ett flödessystem.
Variationer av den beskrivna analysen, med kalcein som upptäckt fluorofor, beskrevs först 1993 28,29. Viktigare, dessa första rapporter funnit att kalcein inte påverkar cellernas livskraft och hade minst effekt på cellernas funktion i vidhäftningsanalyser jämfört med andra fluorescein-härledda färgämnen 29,30. Det rapporterades också att antalet celler är linjär med avseende på fluorescerande intensitet, överensstämmer med vad vi observerar (Figur 3A) 28. Initiala rapporter också visat att enstor fördel med fluorometrisk analys är att de inte kräver radiomärkning (t.ex. 111 I eller 51 Cr) av de renade leukocyter 31-33. Fördelarna och konsistenser att använda Calcein AM-märkta celler över radiomärkta celler har grundligt diskuterats tidigare 28,29,34. Även om vi använder calcein AM att märka neutrofiler i våra analyser, flera andra cellen genomträngande färgämnen som är esterase substrat finns tillgängliga. Till exempel säljer Life Technologies CellTrace kalcein röd-orange (C34852), kalcein violett (C34858) och kalcein blå (C34853) som hetsar / emitterar vid olika våglängder. De olika färgerna har alla sina fördelar och nackdelar. Till exempel, har kalcein rödorange AM färgämne några inneboende fluorescens före hydrolys 18.
Vi använder denna metod för att studera inflammatoriska aktivering av endotel som svar på bakterie-och endogena faktorer (såsom TNFa), och thoss använda HMVECs samlats in från kadaver, som kan utökas i tillräcklig mängd för att göra analysen med ordentliga kontroller och nog replikerar att utföra statistiska analyser. Möjligen kan denna analys också användas som ett verktyg för att studera endotel-baserade sjukdomsprocesser som involverar leukocyt bindning till mikrovaskulära endotelet. Exempel på sjukdomar som kan studeras med hjälp HMVECs från patienter inkluderar kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), sepsis, inflammatorisk tarmsjukdom, vaskuliter, såsom anti-neutrofila cytoplasma autoantikroppar (ANCA)-associerade vaskuliter, och hjärnan kärlmissbildningar 35-40 . Till exempel skulle HMVECs samlas in från människor med vaskulit eller sepsis efter slakt, eller potentiellt från patienter med endotelceller baserade sjukdomsprocesser som har genomgått en biopsi eller kirurgisk resektion av ett organ, och deras bindning till neutrofiler bedömas under olika förhållanden. Dock kräver denna analys är tillräckligkvantiteter av HMVECs att bilda sammanflytande monoskikt, och därmed HMVECs expanderas och används efter flera passager. Denna process av expansion kan leda till fenotypiska förändringar i ECS som skulle behöva beaktas vid utformningen av studier med primär EC från patienter med EC-baserade sjukdomar. Ändå tillåter mångsidigheten hos denna analys att den kan anpassas till många andra adherenta och leukocyt celltyper. I själva verket har denna analys, eller varianter av den, med framgång använts med andra endotelceller typer, och primära celler och cellinjer såsom monocyter, THP-1, Jurkat, HL-60 och U937 28,31,41. Denna analys har visat sig vara snabb, lätt att utföra, reproducerbara och mycket känsliga, och är därför ett mycket användbart verktyg för att upptäcka endotelcellsaktivering av inflammatoriska mediatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av UCSF Institutionen för anestesi och perioperativ vård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
