Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nicel Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda açıklanan

Abstract

Vasküler endotel inflamatuvar yanıt olarak ayrılmaz bir rol oynar. Inflamasyon akut aşamasında, endotel hücreleri (EC) ana bilgisayar arabulucular veya doğrudan korunmuş mikrobiyal bileşenler veya ana-türetilmiş tehlike moleküller tarafından aktive edilir. Aktif EC ifade sitokinler, harekete kemokin ve adezyon molekülleri, enfeksiyon veya yaralanma yerinde lökosit etkinleştirmek ve korumak. Nötrofiller gelmesi ilk lökosit vardır ve her ikisi de hücrelerin yüzeyleri üzerinde mevcut yapışma molekülleri çeşitli yoluyla endotele bağlı. Nötrofil ana fonksiyonları doğrudan, mikrobiyal tehditleri ortadan kaldırmak ek faktörler serbest bırakılması yoluyla diğer lökositlerin teşvik ve yara tamir başlatmak için vardır. Bu nedenle, endotel onların işe alma ve eki inflamatuar yanıtın başlamasında önemli bir adımdır. Bu yazıda kullanarak in vitro nötrofil yapışma deneyi tarifCalcein statik şartlar altında mikrovasküler endotelyal hücre aktivasyonu ölçüde miktarını belirlemek için, birincil insan nötrofil AM-etiketli. Bu yöntem, floresan spektrofotometre ile ölçülmüştür aynı numuneleri, aynı zamanda doğrudan nötrofil bağlanmasının daha niteliksel değerlendirmesi için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi edilebilir ek bir avantaja sahiptir.

Introduction

Vasküler endotel dolaşan kan ile doğrudan temas halinde olduğu için, bu benzersiz enfeksiyon veya yaralanma sırasında hızlı bir inflamatuvar yanıt başlatmak için yer almaktadır. Endotel hücreleri (EC) korunmuş bakteriyel bileşenleri ve tehlike moleküllerin çeşitli tanımak ifade örüntü tanıma reseptörleri ve bu TNF gibi ev sahibi yangı için reseptörleri. Bu reseptörlerin aktivasyonu EC sitokinler (örn., IL-6, IL-8, CXCL1 ve CCL2) salgılamaya ve hücrenin yüzeyinde 1 yapışma molekülleri (örneğin, E / P-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) upregüle indükler , 2. Bu moleküller tüm bulaşıcı ajanların ev sahibi açık ve doku onarımı 3,4 başlatmak için enfeksiyon ve yaralanma sitelere lökositlerin lokalizasyonu kolaylaştırmak. Enfeksiyona nötrofil yanıtı vasküler endotel ve yanıt arasında iyi koordine etkileşim içerir nötrofil. EM aktivasyonu üzerine, IL-8 salgılanan ve enfeksiyon veya yaralanma 5,6 siteye ev için nötrofil sağlar endotel üzerindeki bir damar içi degrade oluşturur. E / P-selektinler aracılık nötrofil yakalama ve nötrofil hücre yüzeyinde glycomolecules ile nispeten zayıf dernekleri aracılığıyla haddeleme. Bu etkileşimler, bununla aynı soydan gelen reseptörlere IL-8, bağlayıcı ile birlikte, sağlam, integrin-aracılı bağlanma ve endotel hücre yüzeyi 7-10 nötrofil nihai durması kolaylaştırır. Tutuklanmasından sonra, nötrofil doğrudan, patojenlerin ortadan kaldırmak patojenlerin yayılmasını önlemek için nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturmak, yaraların iyileşmesini sağlar ve bu monositler, makrofajlar ve dendritik gibi diğer lökosit işe ek faktörler serbest bırakmak için enfeksiyon belirli sitelere damar dışına geçirebilirsiniz hücreleri 11-17.

Microv için nötrofil bağlılık ölçmek için bir in vitro bir yöntemdir Bu raporda açıklananascular TNF ev sahibi inflamatuar arabulucu tarafından aktif hale ECS. Bu deney, EC aktivasyonu, ve nötrofil değerlendirmek için tasarlanmıştır. Birincil insan nötrofil ilk yoğunluk gradiyenti ayırma kullanılarak izole, ve sonra Calcein asetoksimetil (AM) ile etiketlenir. Canlı hücreler hidrolize Calcein içinde esteraz 492-495 nm ve 513-516 nm 18 emisyon bir uyarma ile yüksek floresan Calcein molekülüne var. Floresan etiketli nötrofil sonra EM mono tabakaları ile inkübe edilir ve yapışkan olmayan nötrofil sonradan kaldırılır. Geriye kalan, bağlı nötrofil floresan sonra bir floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür ve oyuk başına toplam nötrofil floresan girişi bir yüzdesi olarak hesaplanır. Bu yöntem spektrofotometre kullanılan bağlı Calcein-etiketli nötrofil doğrudan AB ac okumak daha nitel vermek için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi olabilir ek bir avantaja sahiptirtivasyon. Bu testte statik şartlar altında gerçekleştirilir, çünkü nötrofil yapışma kaskad ortaya yalnızca çok ilk olayların değerlendirilecektir. Bu TNF ile tedavi edilen insan akciğer mikrovasküler EC (HMVEC-Akciğer) bu nötrofil bağlılık E-selektin ile etkileşim bozulur zaman mono tabakaları büyük ölçüde azalır göstermek için E-selektin engelleme antikorlar kullanarak bu raporda teyit edilir.

TNF ek olarak, başarıyla Toll-benzeri reseptör 1/2 agonistleri peptidoglikan ile ilişkili lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) ve Pam3Cys ve insan umbilikal ven EC (HUVEC) aktivasyon boyutunu belirlemek için bu testte kullanmış Pam3Cys 19,20 ile HMVEC-Akciğer aktivasyonu. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde bu metodoloji bir çeşitliliği ile uyumlu olduğunu düşündürmektedir, kinaz inhibitörleri ile ve HMVEC-Akciğer yüzeyi ve sitoplazmik proteinlerin RNAi aracılı demonte sonra bu testte kullanılabilir ve biyokimyasal screening deneyleri 20. Özetle, bu testte in vitro yangı tarafından EC aktivasyon ölçüde erişmek için, tekrarlanabilir, daha işlevsel şekilde kullanmak için kolay sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kaplama ve Mikrovasküler Endotel Hücreleri Bakımı

  1. Çözülme ve üreticilerine göre mikrovasküler endotel hücreleri büyümek talimatları verilir. Bu protokol, hücreler EGM-2 PD ortamı (Lonza) açığa çıkaran yetiştirildi ve tüm deneyler pasaj sayısı nedeniyle herhangi bir varyasyonu en aza indirmek için çözülme iki hafta içinde yapılması tavsiye edilir. HMVEC-Akciğer ile deneyler 4 ile 9 pasajlar arasında yapılmaktadır.
  2. 1. Gün: hücreleri% 80-90 confluency ulaştığınızda, trypsinize ve ml başına 120.000 hücre tekrar süspansiyon. 48-çukurlu, polistiren doku kültürü plakası (ler) içine Plaka oyuk başına 36,000 hücre (0.3 ml) eklenmiştir. Bir eşiğe okuma elde etmek amacıyla, nötrofiller ile inkübe olmayacak HMVEC kuyu içerir. Özellikle floresan testleri, alternatif satır veya sütun için tasarlanmış 48-iyi plakaları kullanarak sürece komşu kuyulardan herhangi bir ışık kirliliği en aza indirecektir. NOT: Wells poli-LYSI önceden kaplanmış olabilirKD, kolajen ya da fibronektin.
  3. 2. Gün: taze medya ekleyin.
  4. 3. Gün: faz kontrast mikroskobu olarak, hücreler (yani "arnavut" görünüm ve küçük hücre artıkları) sağlıklı onaylayın, ve% 100 konfluent (Şekil 1). Hücrelerin% 100 konfluent değilseniz onlar hazır olana kadar, her gün medya değiştirin.
  5. HMVEC mono tabakaları tedavisi için hazır olduğunda, Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile bir kere hücreleri yıkama ve uygun kuyulara inflamatuar agonist içeren taze bir EGM-2 PD ortam ya da ortamın 0.3 ml ilave edilir. Bu protokolde HMVEC-Akciğer TNFa ile muamele edildi, 3 saat boyunca [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey), bu EC 21 arasında iyi tanımlanmış bir aktivatör olduğu. NOT: Bu aktive HMVEC hücreleri (Adım 4.1) ve Calcein etiketli nötrofil (Adım 3.5) AM böylece zaman denemenizi aynı anda kullanıma hazır önerilir. Bu neutroph izole ve etiketlemek için bize yaklaşık 2.5 saat sürerils.

2. Polymorphprep kullanarak Nötrofil İzolasyon

  1. Daha önce 22 açıklandığı gibi nötrofil izole, ya da tam kandan polimorfonükleer granülositler izole etmek için hazır bir yoğunluk gradiyenti çözüm. Nuzzi ve arkadaşları tarafından protokolü takip Polymorphprep kullanılması. Tüm kan 23 ml'si başına yaklaşık 2-3 x 10 6 nötrofil verimi 2007 sonuçlanır. Not: kırmızı kan hücreleri çıkarmak için aşırı eritrosit lizis, bir dekstran sedimantasyonu önlemek için, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye 24 önce gerçekleştirilebilir.
  2. Oda sıcaklığına kadar Polymorphprep yoğunluk gradyanı çözüm getirmiştir.
  3. Varlığında sağlıklı gönüllü insan tüm kan 30 ml arasında bir heparin, sitrat veya EDTA gibi anti-koagülan. Kan, 2 saat içinde kullanıldı, ve 18-22 ° C arasında tutulmalıdır
  4. 15 ml konik bir tüp içinde yoğunluk gradyanı çözeltisi (5 ml 'den fazla bir tam kan Katman 5 mi
  5. 18-22, 30 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin ° C Yavaş yavaş hızlandırmak ve aşağı santrifüj (yani santrifüj fren kapatın) ve nötrofil aktivasyonu azaltmak ve katmanları karıştırma önlemek için titreşimleri önlemek için de tüpler dengelemek için emin olun. Daha uzun santrifüj kez veya daha fazla santrifüj kuvveti pelet kırmızı kan hücrelerine karşı daha aşağı geçirmek için, nötrofil lökosit içeren alt tabaka ile sonuçlanacaktır.
  6. Nötrofiller (Şekil 2B) içeren katman kirlenmesini önlemek için PBMC içeren plazma ve üst bant lökosit aspire.
  7. Nötrofil içeren alt lökosit katmanı kaldırmak için bir 1-2 ml serolojik pipet kullanın. PBS, 30 ml içine nötrofil tabakalar birleştirildi, 50 ml (Ca kalmadan 2 + ve Mg2 +)konik tüp.
  8. PBS ile 50 ml (Ca 2 olmadan + ve Mg 2 +) 18-22 10 dakika 450 xg ve santrifüj ° C için ses getirmek

Not: Adım 2.9 ve 2.10 isteğe bağlıdır ama tavsiye.

  1. Süpernatant aspire. Kırmızı kan hücreleri lyse 30 saniye boyunca steril su 8 ml nötrofil süspanse edin, hemen 5x 2 ml PBS (Ca 2 olmadan + ve Mg 2 +) ve hafifçe elle karıştırın. Hücreleri inkübe ETMEYİN için hücre süspansiyonu ekleyin daha uzun 30 saniye için su önemli nötrofil ölüm meydana gelebilir çünkü.
  2. 18-22 5 dakika boyunca 250 x g santrifüj ° C
  3. 10 ml PBS (Ca2 + olmadan ve Mg2 +) ve 18-22 az 5 dakika boyunca 250 x g'de tekrar santrifüj ° C ile bir kez yıkama hücreleri
  4. RPMI-1640, 10 ml nötrofil süspanse (fenol kırmızısı olmadan) ve tripan blu kullanılarak canlı hücre sayımıE boyasıyla çıkarma metoduna. Bu da nötrofillerin aktivasyonunun neden olabileceği için, ml başına 5 x 10 6 daha büyük hücre yoğunlukları, uzun süreler kaçının.

3. Calcein AM ile nötrofil Etiketleme

  1. 6 x 10 5 nötrofiller, 48-kuyulu plakanın oyuk başına kullanılır.
  2. Hesapladıktan sonra, 50 ml konik bir tüp süspanse hücreleri aktarmak ve 2-4 fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ile, ml başına 6 x 10 hücreler, nötrofiller seyreltin.
  3. Calcein 3 mcM (Calcein AM stok yani 2.98 ul (1 mg / ml) ml başına medya) için stok solüsyonu AM ekleyin ve yavaşça tüp hafifçe vurarak iyice karıştırın. 5'inden fazlasını mcM Calcein nötrofil sızıntı neden olacaktır AM Not:. Olmayan floresan Calcein AM son derece floresan molekül Calcein (yani ölü hücreleri floresan olmaz) üretmek için endojen esterazlarla hücre içinde parçalanır.
  4. Alüminyum folyo ile tüp kapağı ve f inkübeveya 37 ° C'de 30 dakika karanlıkta Not C:. uzun inkübasyon süreleri yapışma deneyi boyunca nötrofillerden serbest bırakılır daha kalsein ile sonuçlanabilir.
  5. 18-22 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve RPMI-1640 içinde 10 ml (fenol kırmızısı olmaksızın, 37 önceden ısıtılmış ° C) 2x nötrofil yıkayın. 40 uM steril filtre 18-22 de kümeleri kaldırmak ve daha sonra 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile bir kez daha da ikinci yıkama için yeniden süspansiyona sonra ilk olarak nötrofiller geçmek ° C
  6. , Ml başına 2 x 10 6 nötrofil de.; (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış fenol kırmızısı olmadan) RPMI 1640 içerisinde yeniden süspanse nötrofil

4. Nötrofil Bağlama Deneyi

  1. Filtre ile sterilize edilmiş (0.22 um) RPMI 1640 içinde 0.5 ml (fenol kırmızısı olmadan) oyuk başına% 3 BSA içeren 3x HMVEC mono tabakalar yıkayın.
  2. Medya aspire ve 6 x 10 5 Calcein-etiketli nötrofil (hücre suspensio 0.3 ml. 48-kaynak plaka Not uygun kuyulara nötrofil olmaksızın RPMI 1640 K) ya da 0.3 ml (fenol kırmızısı olmadan): Bu cm2 başına 8 x 10 5 nötrofillerin eşdeğerdir.
  3. 37 ° C 20 dakika,% 5 CO 2 inkübatör inkübe edin.
  4. Toplam Nötrofil Floresan (PRE yıkama): 485 nm dalgaboyu ve FLUOstar veya eşdeğer, spektrofotometrede 520 nm (floresein filtre seti) bir emisyon dalga boyu her kuyunun floresan ölçün. . Hemen önce inkübasyon son noktaya Bu adım yapın: Bu protokol, kalsein uyarılma ve yayılan ışık algılama ortaya kuyu üst yapıldı, ancak her ikisi de iki kuyu altından gerçekleştirilebilir.
  5. PBS içinde çukur başına 0.5 ml 'si ile 5x HMVEC mono tabakaları ve nötrofiller içeren kuyu yıkayın (w / Ca2 + ve Mg2 +). Medya ve yıkar çıkarınters plaka ile ve kağıt havlu üzerine hafifçe okşamaya kalan sıvı kaldırmak için.
  6. Geri de başına RPMI 1640 0.3 ml (fenol kırmızısı olmadan) ekleyin.
  7. Yapışık Nötrofil Floresans (POST yıkama): Aşama 4.4 'de hem de her bir floresan yoğunluğu ölçün.
  8. Yüzde bağlılık ve iyi başına göreceli bağlılık belirleyin:

Not: Bu aşamada, kalsein etiketli nötrofil görüntüler standart fluorescein filtre ile donatılmış bir floresan sahip mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. Şekil 4'teki görüntü Pro7 yazılımı (Imaging S) Q-Yakalama kullanarak Retiga 2000R kamera (S Görüntüleme) ile donatılmış bir Olympus IX51 ters mikroskop ile elde edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

, Nötrofil bağlanma tahlili kullanılarak güvenilir, tekrar üretilebilir sonuçlar elde etmek amacıyla, Şekil 1 'de HMVEC-Akciğer ile gösterildiği gibi sağlık ve mikrovasküler endotel hücreleri konfluent, deney gününde uygun olması esastır. Buna ek olarak, düşük geçit sayısı mikrovasküler EC (az 9 geçitler gibi) kullanılmaktadır zorunludur, ve buna göre, biz çözülme iki hafta içinde tüm deneyler tavsiye ederiz. Nötrofil sağlık hücreleri bir biçimde oluşmaktadır halinde Calcein AM floresan kalsein moleküle metabolize edilmez, özellikle de büyük önem taşımaktadır. Biz tripan mavi dışlama yöntemini kullanın ve hücrelerin önemli bir bölümü (yani lekeli) ölü olup olmadığını tahlil ile devam etmeyin.

Orada yoğunluk gradyan ve antijen tabanlı sütun ayırma yöntemleri de dahil olmak üzere nötrofil izole etmek için çeşitli yollar vardır ve herhangi birBunlar, bu işlem için yeterlidir. Biz Eksen-Shield kupasında Polymorphprep hazır yoğunluk gradiyenti çözüm kullanmayı seçti. Şekil 2'de de görülebileceği gibi, nötrofil santrifüj sonra alt tabaka içinde iken, PBMC, üst tabaka içinde mevcut bulunmaktadır. Hücre katmanı onların kaldırılması üzerine granülosit kirlenmesini önlemek için aspire edilir. Su kalan kırmızı kan hücreleri eritmek için ilave edildiği adım 2.9, isteğe bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Tüm kirlenmesine neden eritrositler kaldırmak için idealdir Ancak, bu nötrofiller önemli ölüm meydana gelebilir sonra 30 saniye fazla saf suda oturmak değil önemlidir.

Son olarak, nötrofiller kalsein önceden ısıtılmış (37 ° C) içeren RPMI-1640 ortamı (fenol kırmızısı olmadan) ile yıkandı ve yeniden süspansiyon haline getirildi, 30 dakika boyunca AM ile inkübe edilir. Bu floresan okuma engelleyebilir fenol kırmızısı olmadan medya kullanmak önemlidir. Nötr sayısıophils oyuklara ilave floresans okumaları pre-ve post-yıkama spektrofotometre lineer aralığında olduğu sürece, yerine keyfidir ve ya nötrofil yapışma teşvik etmek ya da önlemek tedaviler arasındaki farklar (bkz. aşağıda) tekrarlanabilir şekilde tespit edilebilir. Biz 10.000 1.000.000 etiketli nötrofil (Şekil 3A) incelendiğinde floresan OD 520 nm doğrusal aralığında olduğunu bulmak. İlginç bir şekilde, aynı zamanda, daha nötrofiller, TNFa ile muamele HMVEC-Akciğer mono tabakaları eklenir olarak yüzde yapışma artar bulmak [100 ng / ml], 3 saat (Şekil 3B) için. Biz yapışma yüzdesi önemli ölçüde bu zaman noktasında (veriler gösterilmemiştir) sonra artmaz bulmak beri, 20 dakika birlikte HMVEC-Akciğer ve Calcein-etiketli nötrofil inkübe seçti. Not, bu deneyde biz standart, açık polistiren 48 oyuklu plakalar kullanılır ve bulunan bu t floresans çapraz okuma seviyesinio kuyu toplam floresan giriş (veriler gösterilmemiştir) fazla% 0.5 tutarında vermedi. Bununla birlikte varsa, biz, daha hassas deneyler için floresan spektrofotometre okumaları için bilerek yapılan 48-iyi plakaları kullanmanızı öneririz, ya da en azından, deneme tasarımı (Adım 1.2) çapraz okuma en aza indirmek için.

Oyuklara ilave nötrofil sayısının çok uzun ilave numara spektrofotometre doğrusal aralığı içinde olduğu gibi oldukça keyfi olduğunu göstermek için, P38'in mevcudiyetinde ya da yokluğunda TNFa ile tedavi edilen HMVEC-akciğer, nötrofil yapışma deneyi gerçekleştirilir nötrofil değişen giriş miktarda (yani 40.000 / iyi, 200.000 / iyi ya da 1.000.000 / da) 25 kullanılarak-MAPK inhibitörü BIRB7906,. , p38-MAPK önceden TNFa ile tedavi edilen insan EC E-selektin ekspresyon için gerekli olduğu gösterilmiştir, ve bu nedenle TNFa inhibisyonu ile aktive HMVEC-Akciğer nötrofil bağlayıcı azaltmalı26. Aslında, bu biz (Şekil 3C) gözlemlemek budur. Daha nötrofil eklendikçe, yüzde yapışma artar ve yüzde yapışma bu tür bir iç-verici çeşitleri, izdiham nötrofillerin kalitesi ve HMVEC yoğunluğu, bağıl yapışma özelliği gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak, deneyler arasında farklılıklar olabilir bulmak da koşullar arasında bağımsız olarak (Şekil 3C ve veri gösterilmemiştir) ilave nötrofil sayısının her biri bağımsız bir deneyde ise nispeten sabit kalmaktadır. Bu arası deneysel tutarlılık için bir pozitif kontrol göre olarak yapışma verileri görüntülemek için daha iyidir neden bu veriler de örnek.

Tam olarak bu tahlil nasıl çalıştığını göstermek için, biz, nötrofil yapışma tahlili gerçekleştirilebilir TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer ön kuluçkaya kontrol antikoru ya da bir e-selektin antikoru ile ya da bloke. E-selektin, TNFa ve yakalar nötr ile tedavi sonrası AT yüzeyinde ifade edilirglycomolecules ile elektrostatik etkileşim ile yataktan ophils nötrofil yüzeyinde 1,27 üzerinde mevcut. Şekil 4B ve görsel olarak Şekil 4C 'de grafik, Şekil 4A'da gösterilen sayısal olarak, TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer önceden inkübe göre ~% 75 daha az nötrofil bağlı E-selektin antikoru ile önceden inkübe kontrolü IgG ile. Bu E-selektin eden statik yapışma deneyinde HMVEC-Akciğer nötrofil bağlama önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Sağlıklı, birleşik HMVEC-Akciğer mono tabakaları örneği. "Arnavut" görünüm ve mono tabakaları confluency toplam unutmayın. Görüntüler bir Fisher Scientific Micromaster ters dijital mikroskop 4X ve 10X büyütmede alınmıştır. Şekil 2,
Şekil 2. Tam kan ve Polymorphprep santrifüj önce kaplanmış (A) ve (B), santrifüj işleminden sonra ayrıldı. Not polimorfonükleer granülositler (nötrofiller) ayrı bir alt grup oluştururlar süre santrifüj sonra, PBMC, ayrı bir üst grup oluştururlar.

Şekil 3,
Şekil 3,. Nötrofil sayısı ve floresan OD 520 nm arasındaki ilişki doğrusaldır; daha nötrofil olarak TNF-tedavi HMVEC-Akciğer artar nötrofil yüzde yapışma eklenir; p38-MAPK TNF-aktif HMVEC-Akciğer mono tabakaları için nötrofil bağlılık teşvik (A) Grafik. linea tasviriki mertebe üzerinde floresan OD 520 nm ve nötrofil sayısı arasında r ilişkisi. 0,996 arasında bir R2 değeri 10,000 ile 1,000,000 nötrofil analiz edilir nötrofil sayısı ve floresan OD 520 nm arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösterir. Kalsein etiketli nötrofil değişen sayıda ilave edildi bağlılık oranında (B) grafiksel gösterimi edilmediği ya da TNFa ile tedavi edilen ( 100 ng / ml;. 48 gözlü levhalar içinde, 3 saat) HMVEC-Akciğer tek tabaka (C) HMVEC-Akciğer mono tabakaları için, p38-MAPK inhibitörü BIRB796 (10 mM) ile (Axon Medchem) ya da DMSO (kontrol) ile önceden inkübe edildi TNFa, önce 1 saat (100 ng / ml), 3 saat boyunca muamele BIRB796 (10 mm) arasında sürekli varlığında ise. Göreli yapışma adım 4.8 olarak hesaplandı. Veri ortalama ± SD olarak ifade edilir. GraphPad Prism eşleştirilmemiş t-testi istatistiksel analizi (n = 3) (TNFa ile tedavi edilen genel artı BIRB796 TNFa ile muamele edilmiş) dönüştürülmesi için kullanılmıştır. p-değeri ** <0.01; *** &# 60;. 0.001 büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4,. E-selektin, nötrofil yapışma teşvik TNFa tedavi HMVEC-Akciğer. HMVEC-Akciğer TNFa ile muamele edilmiştir [100 ng / ml], 3 saat boyunca. % 3 BSA (adım 4.1), ya da koyun IgG, [50 ug / ml] ihtiva eden RPMI 1640 HMVEC-Akciğer yıkama işleminden sonra (5-001-A, R & D Systems) veya E-selektin poliklonal antikoru (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) 20 dakika boyunca, uygun oyuklara ilave edildi. 6 x 10 5 nötrofil ek bir 20 dakika boyunca oyuk başına ilave edilmesinden önce HMVEC-Akciğer mono tabakalar daha sonra bir kez daha RPMI-1640 ile yıkandı. (A) ve yüzde göreli yapışma belirlemek için hesaplamaları gösterilmektedir. Calceinışık emisyonu OD 520 nm de ölçülür. Arka Plan OD 520 nm ortalama TNFa işleme ve nötrofillerin yokluğunda HMVEC-Akciğer türetilmiştir. (B) işlenmemiş ya da TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer mono tabakalara kalsein etiketli nötrofil görece yüzde yapışma grafiksel gösterimi ön inkübasyondan sonra ya kontrol ile IgG veya E-selektin pAb engelleme. Veri ortalama ± SD olarak ifade edilir. GraphPad Prism eşleştirilmemiş t-testi istatistiksel analizi (n = 3) dönüştürülmesi için kullanılmıştır. Hesaplanan p-değeri <0.001 idi. (C), tedavi edilmemiş ve TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer mono tabakaları kontrol IgG ya da, E-selektin pAb ile ya da ön-kuluçkaya bağlı kalsein etiketli nötrofillerin görüntüler. PBS ile yıkanmasından önce 6 x 10 5 nötrofil içeren bir örnek (PRE yıkama) gösterilmiştir. Referans aynı alanda floresan görüntüleri, bir floresein filtre kullanırken saydam ışık mikroskobu görüntüleri, sağ sütunda gösterilmiştirset, sol sütununda gösterilmiştir. Görüntüler bir Retiga 2000R kamera (Q Görüntüleme) ile donatılmış bir Olympus IX51 ters mikroskop 10X büyütmede alınmıştır. ÖN yıkama = toplam nötrofil floresan OD 520 nm (Adım 4.4); POST yıkama = yapışık nötrofil floresan OD 520 nm (Adım 4.7); PMN - polimorfonükleer granülositler, ort - ortalama, IgG - koyun IgG kontrolü; E-sel/α-E-selectin - E-selektin pAb engelleme. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Başarılı bir nötrofil / mikrovasküler endotelyal hücre yapışma deneyi için en kritik adımlar şunlardır: 1) düşük geçiş sayısı (<9), sağlıklı endotel hücreleri kullanarak, bir düşük yoğunluklu (yani <5 x 10 6 hücre izole edilmiş nötrofiller bakımı 2) / ml) ve izolasyon iki saat içinde bunları kullanarak, sırasıyla, ve 3) titiz Kalsein-etiketli nötrofillerin yıkama ve nötrofillerden kalsein EC kirlenme ve kaybını en aza indirmek için bir zamanında Kalsein-etiketli nötrofil kullanımı, .

Bu doku kültürü cm2 başına 8 x 10 5 nötrofil iyi bir yüzey alanı (yani, 600,000 nötrofiller kuyu başına, 48 kuyulu plakanın) ekleyin. Biz 600.000 nötrofil bir giriş bizim spektrofotometre doğrusal aralığında olduğunu bulmak ve göreceli yapışık ölçülen zaman güvenilir bir veri üretir. Bununla birlikte, nötrofil bağlayıcı çok benzer bir azalma gözlenmektedir40,000, 200,000 veya 1,000,000 de nötrofil başına eklenir, p38-MAPK önleme deneyi (Şekil 3C), 600.000 'den daha az nötrofil kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Protokol burada anlatılan sadece kendilerini önceden aktif, ya da tabii ki sizin test gerektiriyorsa bir seçenek herhangi bir şekilde, kabul edilmediği nötrofil yana endotel aktivasyon ölçüde değerlendirir. Biz HMVEC-Akciğer önceki gözlemlerle 27 ile uyumlu olarak, bu tahlilde, nötrofillerin bağlanma için önemli olan E-selektin ifadesini TNFa tedavi olduğunu göstermektedir. Nötrofil yüzeyinde bulunan glycomolecules E-selektin elektrostatik bağlayıcı nispeten zayıf, ancak akış koşulları altında, bu etkileşimlerin nötrofiller ve EC 1,7-10 arasında yüksek afiniteli integrin aracılı ekleri neden olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, bu tahlil inflamasyon ilk adımda daha fazla göstergesi olabilir aryataktan nötrofil yakalamak için gerekli e. Yine de, fizyolojik olarak uygun olan, bu raporda TNFa ile elde ettiğimiz sonuçlar, bu statik test sonuçlarını gösteren bir akış modülünün (veriler gösterilmemiştir) kullanılarak elde olanlar, çok benzer değilse, özdeş olduğunu doğruladı ve göstermektedir ki bu testte Bir akış sistemine erişimi olmayan araştırmacılar için özellikle yararlıdır.

Algılama fluorofor olarak kalsein ile tarif edilen analizde varyasyonları, ilk kez 1993 28,29 'de tarif edilmiştir. Önemlisi, bu ilk raporları Calcein hücre canlılığı etkilemedi bulundu ve diğer floresan kökenli boyalar 29,30 göre yapışma testleri hücre fonksiyonu üzerinde en az etkisi vardı. Ayrıca hücre sayısı biz (Şekil 3A) 28 gözlemlemek ne ile tutarlı, floresan yoğunluğu ile ilgili doğrusal olduğu bildirildi. İlk raporlar da vurgulanan birflorometrik testlerin büyük avantajı saf lökosit 31-33 arasında (Cr olarak veya 51 örneğin 111) etiketlenmesi gerek kalmamasıdır. Radyoaktif hücreleri üzerinde Calcein AM-etiketli hücreleri kullanmanın avantajları ve tutarlılıkları iyice daha önce 28,29,34 tartışılmıştır. Kullandığımız rağmen Calcein bizim tayinlerde nötrofil, esteraz substratlardır mevcuttur birçok hücre permeant boyalar etiket var. Örneğin, Life Technologies CellTrace Calcein kırmızı-turuncu (C34852), Calcein mor (C34858) ve heyecan / çeşitli dalga boylarında yaydıkları Calcein mavi (C34853) satıyor. Farklı boyalar her biri avantaj ve dezavantajları vardır. Örneğin, kırmızı-turuncu kalsein AM boyası hidrolizi 18 öncesinde bazı içsel floresan sahiptir.

Biz, bakteriyel ve endojen faktörler (örneğin TNFa gibi) tepki olarak endotel inflamatuar aktivite incelemek için, bu yöntemi kullanarak ve incibize uygun kontrolleri ile tahlil yapmak için yeterli miktarda genişletilebilir kadavra, toplanan HMVECs kullanımı ve yeterli istatistiksel analizler gerçekleştirmek için çoğaltır. Muhtemelen, bu testte de mikrovasküler endotel lökosit bağlama içeren endotelyal tabanlı bir hastalık süreçleri incelemek için bir araç olarak kullanılabilir. Hastaların HMVECs kullanılarak incelenebilir olabilir bozuklukların örnekleri, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sepsis, iltihaplı bağırsak hastalığı, vaskülitler, örneğin, anti-nötrofil sitoplazmik antikor (ANCA) ile ilişkili vaskülitler olarak, beyin damarsal bozukluklar dahil 35-40 . Örneğin, HMVECs vaskülitler veya sepsis ölüm sonrası, ya da potansiyel bir biyopsi veya cerrahi bir organ rezeksiyonu ve farklı koşullar altında değerlendirilen nötrofil kendi bağlayıcı geçirmiş endotel tabanlı hastalık süreçleri ile hastalardan alınan insanlarda toplanan olabilir. Bununla birlikte, bu testte yeterli gerektirirkonfluent tek tabaka oluşturmak için HMVECs ve böylece HMVECs miktarda genişletilmiş ve birden fazla geçit sonra kullanılır. Genişleme süreci EC-tabanlı hastalığı olan hastalardan alınan primer EC kullanarak çalışmalar tasarımında dikkate alınması gerekir EC de fenotipik değişikliklere yol açabilir. Bununla birlikte, bu testin çok yönlü bir çok diğer yapışık ve lökosit hücre tiplerine adapte edilmesini sağlar. Aslında, bu testte, ya da bunun türevleri, başarılı bir şekilde diğer endotel hücreleri türleri ile kullanılabilir, ve bu monositler, THP-1, Jurkat, HL-60, 28,31,41 ve U937 gibi birincil hücreler ve hücre kuşakları. Edilmiştir Bu test hızlı, gerçekleştirmek kolay tekrarlanabilir ve son derece hassas olduğu kanıtlanmıştır ve bu nedenle yangı tarafından endotel hücre aktivasyonu tespit etmek için çok yararlı bir araçtır oldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Anestezi ve Perioperatif Bakım ucsf Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

İmmünoloji Sayı 78 Hücresel Biyoloji Enfeksiyon Moleküler Biyoloji Tıp Biyomedikal Mühendisliği Biyofizik Endotel Vasküler Nötrofiller Enflamasyon İnflamasyon Aracılar Nötrofil Lökosit Adezyon endotel hücreleri tahlil
Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter