Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten

Published: February 16, 2014 doi: 10.3791/50685
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Summary

Fag-display är en kraftfull teknik för att fånga proteiner eller proteinkomponenter som interagerar med en immobiliserad molekyl av intresse. När ett beslut om vilken typ av fag cDNA-bibliotek för att skapa och skärmen har gjorts, det protokoll som beskrivs här tillåter effektiv affinitet val som leder till identifiering av interactmedlemmar.

Abstract

Med användning av rekombinant-fag som en byggnadsställning för att presentera olika proteindelarna som kodas av en riktat klonat cDNA-bibliotek till immobiliserade betes molekyler är ett effektivt sätt att upptäcka interaktioner. Tekniken har i stor utsträckning använts för att upptäcka protein-proteininteraktioner, men betet molekyl att utmanas behöver inte vara begränsad till proteiner. Protokollet presenteras här har optimerats för att möjliggöra ett blygsamt antal beten som ska screenas i replikat för att maximera identifiera oberoende kloner som uppvisar samma protein. Detta tillåter större förtroende för att interagerande proteiner identifieras är legitima interagerande av betet molekylen. Övervakning av fag-titer efter varje affinitet urvalsomgång ger information om hur affinitets valet fortskrider samt om effekten av negativa kontroller. Ett sätt att titrering fag, och hur och vad man ska förbereda sig i god tid för att denna process att utvecklas så effektivt sommöjligt, presenteras. Attribut för amplikoner som hämtas efter isolering av oberoende plack är markerade som kan användas för att fastställa hur väl affinitetsselektion har framskridit. Felsökning tekniker för att minimera falska positiva eller att kringgå envist återhämtat fag förklaras. Medel för att minska viral kontamination blossa upp diskuteras.

Introduction

Varför använda fag-display och affinitet val i stället för de otaliga andra tekniker som finns för att upptäcka och utreda protein interaktioner med andra molekyler? Fag display kan göra anspråk på några unika fördelar jämfört med andra metoder för att detektera protein-ligand interaktioner 1-3 bland annat följande:

Mycket bred repertoar av bete molekyler

Den främsta orsaken är den mångfald av molekyler som kan fungera som bete i affinitetsselektering 4. Faguppvisning är ett mycket kraftfullt medel för isolering av proteinfragment som växelverkar med andra proteiner, nukleotider, kolhydrater, etc. 5 I huvudsak, om en polymer / molekyl kan fästas till ett återhämtningsbart stöd, kan screenas med avseende på affinitet med fag visade proteinerna. Dessutom kan bete molekyl nås för att bestämma om det bibehåller biologisk aktivitet vid immobilisering 6, om villkoren för att rHÄRLEDA / eliminera dess aktivitet är effektiva 6 eller, för att införa post-translationella modifieringar av betet före affinitetsselektion.

Fag motstånd mot yttre faktorer

En andra anledning till att använda fag display, är att det är möjligt att en del beten kan kräva miljöbelastning (värme, höga osmolytiska koncentrationer, specifika kofaktorer, osv.) För att fånga deras interagerande proteiner, eller fag visade proteinerna kan behöva något sätt förändras före affinitetsselektion. Den primära faktorn som studeras är interaktionen mellan bete och protein, inte villkoret som tillåter interaktion förekomma eller om den är letal för testorganismen. T7-fagen är speciellt väl lämpad för sådana studier eftersom det kan motstå hårda experimentella betingelser både intakta och livskraftiga (t.ex. den publicerade termiska maximum för T7 viabilitet är ~ 60 ° C 7). Som ett exempel på förändra fag visade proproteiner, vid prövningen av Arabidopsis thaliana frö proteomen för proteinsubstrat av reparationsenzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), det virus som används i dessa studier hade varit "äldre" i en vecka, före varje affinitet urvalsomgången, för att uppmuntra införande av isoaspartate (isoAsp) rester hos känsliga proteiner 6 vilket inte är möjligt i organismer som kan känna igen och reparera / metabolisera sådana avvikelser.

Metaboliskt inert

Dessutom fag är oftast resistenta mot metabola gifter och störande små molekyler som skulle, åtminstone, resulterar i pleiotropa effekter på metaboliskt aktiva testorganismer. Efter de stringenstvättar är giftet bort innan en stor mängd bakterier införs för infektion så giftet späds till ett intervall oskadliga för bakterier eller efterföljande fag-replikation. Samtidigt undersöker proteinmålen i PIMT reparationenzym, S-adenosylmetionin (AdoMet) användes för att aktivera mikro titer-platt väl immobiliserat enzym för att medge målprotein fånga samtidigt förlita sig på S-adenosyl Homocystein (AdoHcy) för att inaktivera enzymet och ge en användbar negativ kontroll fixera vetskapen om att viruset inte skulle påverkas negativt genom att antingen AdoMet eller AdoHcy 6. Dessutom, medlemmar i vissa Late Embryogenesis Abundant (LEA) proteinfamiljer, som undersöktes i denna laboration, är kända för att förändra sin form i närvaro av tillsatser såsom sackaros 8 att de kan uppnå så höga koncentrationer som 200 mM i sojabönfrön vid punkten fysiologisk mognad 9. Viruset förväntas inte påverkas av tillsats av 200 mM sackaros i varje affinitet urvalsomgång, eventuellt behövs för vissa LEA-client proteininteraktioner, vilket inte är fallet för självständigt livskraftiga testorganismer 10.

Denna labb har fokuserat på discoverinG-protein-proteininteraktioner i mogna, torkade eller groende frön som ligger bakom mekanismen för lagrade proteomet skydd under uttorkning 11 eller reparation av komponenter i den lagrade proteome som är känsliga för isoAsp bildning när fröet har insupit 6. Således, produktion och rening av rekombinanta proteiner som krävs som bete i ett aktivt tillstånd, och se till att de förblir så, före och efter att de är immobiliserade, men ofta svårt, är en av hörnstenarna i vårt arbete. Eftersom varje rekombinant proteinproduktion scenario är olika, optimerar förutsättningarna för rekombinant proteinproduktion kommer inte att behandlas här. Användarna uppmanas att försöka, om möjligt, för att avgöra om det immobiliserade proteinet är fortfarande funktionellt (t.ex. om det är ett enzym, göra en enzymanalys i mikrotiterplattbrunnar). Detta kommer att ge viss tillförsikt att betet är biologiskt aktiva och därför att alla upptäckta interaktionernågot mer benägna att ha biologisk relevans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En grafisk återgivning av det förfarande som beskrivs nedan (figur 1) belyser de två primära komponenter för affinitetsselektering med en faguppvisningsbibliotek: A) en fag display cDNA-bibliotek sannolikt att koda proteiner med affinitet för bete och, B) en renad rekombinant bete protein. Produktion av bete (rekombinant protein) har i stor utsträckning undersökts och litteratur som beskriver bästa praxis för att säkra löslig, aktiv rekombinant protein från E. coli 12-13, eukaryota jäst 14, insekts 15-16, växt 17-18, eller däggdjurs 19-20 celler i överflöd.

I följande protokoll, taggade ett hexahistidyl rekombinant protein har använts som bete. Detta medger kontroll av att betesproteiner förblir i brunnarna efter inkubation över natten och tvättningssteg.

1. ELISA för rekombinant protein retention i mikrotiterplattbrunnar

  1. Markera enmikrotiterplatta med permanent bläck och utse vilka brunnar kommer att innehålla vilka proteinkoncentrationer. Gör detta i tre upprepningar av brunnar. Inkludera 3 replikationer av en koncentration serie negativ kontroll (icke-hexahistidyl-märkt protein, BSA fungerar bra som denna säkerhetsprövning).
  2. Tvätta plattan mycket med vatten och avlägsna vatten genom smällde plattan upp och ner på 4 lager papper handduk mellan tvättar.
  3. Immobilisera, under de tre första brunnarna, i 100 | il av Tris, pH 7,5 (eller buffert av val) den högsta koncentrationen av det rekombinanta proteinet (10 pg / ml). Lägg till de nästa tre brunnar det rekombinanta proteinet vid (1,0 | ig / ml), etc, ned till 1,0 ng / ml. Gör samma sak med BSA koncentration serien.
  4. Täck rätter med plastfolie och låt stå över natten vid 4 ° C.
  5. Nästa morgon, ta bort protein genom smällde plattan upp och ner på 4-5 lager hushållspapper.
  6. Tvätta brunnarna 5x med 200 ^ 1x TBS varje gång, lämnar bufferteni brunnarna för ~ 1 min vardera gången och avlägsnande av bufferttvättlösningen genom smack plattan upp och ned på pappershanddukar efter varje tvätt.
  7. Blockera ELISA-plattan på en rotationsskak med användning av 200 | il 5% (vikt / volym) BSA eller 200 | il 5% (vikt / volym) blockeringsreagens i TBS vid rumstemperatur under 2 h (eller sitter stilla över natten vid 4 ° C om bekvämt ) insvept i plastfolie.
  8. Avlägsna överskotts blockerande lösningen genom smällde plattan upp och ner på hushållspapper. Tvätta 4x 1 min varje gång med 200 pl 1x TBS, ta bort tvättlösningen genom smällde plattan upp och ner.
  9. Späd penta-HIS primär antikropp 1/2, 000 i blockerande buffert och levererar 100 l till varje brunn. Inkubera 1-2 h vid rumstemperatur med plattan stationärt.
  10. Ta bort den primära antikroppen genom smällde plattan upp och ner på hushållspapper. Tvätta 4x 1 min varje gång med 200 pl 1x TBST. Ta bort varje tvätt genom smällde plattan upp och ner.
  11. Späd den sekundära antikroppen(Get-anti-mus-alkaliskt fosfatas-konjugat), i blockeringsbuffert och inkubera 100 | il i varje brunn under 1 h vid rumstemperatur med plattan stationärt.
  12. Ta bort den sekundära antikroppen genom smällde plattan upp och ner på hushållspapper. Tvätta 4x 1 min varje gång med 200 pl 1x TBST. Ta bort varje tvätt genom smällde plattan upp och ner.
  13. Placera 200 l av para-nitrofenylfosfat (pNPP) substratlösning i varje brunn. Underlaget är en solid vid -20 ° C så gör alikvoter och hämta erforderligt antal portioner som behövs för detektering ur frysen i god tid så att den är helt upptinad av detta stadium.
  14. Vid 30 min stoppas reaktionen genom tillsats av 50 | il 3 M NaOH till varje brunn.
  15. Läs av absorbansen vid 405 nm direkt på ELISA-plattläsare.

OBS: Om det rekombinanta proteinet av intresse inte fästa sig till brunnarna, är det möjligt att ändra the komposition / pH av bufferten avsevärt (karbonatbuffert pH 10,0) eller lägga kaotroper (urea) att försöka hjälpa proteinvidhäftnings till mikrotiterplattbrunnar. Emellertid återinförande att det rekombinanta proteinet: 1) förblir bundet till mikrotiterplattan änkorna under villkoren för affinitetsselektion, och 2) bibehåller sin biologiska aktivitet efter avlägsnande av det höga pH / kaotrop rekommenderas.

2. Växande bakterievärd (BLT5403) för bestämning av antikroppnivå

  1. Autoklav (figur 2A) tio 250 ml Erlenmeyer-kolvar och tre odlingsrör. Gör LB vätska och LB-agar för att hälla fast medieplattorna. Cool LB-agar till 50 ° C och tillsätt ampicillin till 100 ug / ml före aseptiskt hälla i Petri-skålar i en flödeshuven (Figur 2B).
  2. Också i en flödeshuven (Figur 2B) strimma en LB, 100 | ig / ml ampicillin (LB AMP100) agarplatta för enstaka kolonier av BLT5403 från lager som hålls i 15% (vol / vol)glycerol vid -80 ° C (figur 2C). Placera plattan upp och ner vid 37 ° C över natten i en inkubator för tillväxt (figur 2D).
  3. På morgonen ympa 50 ml LB-AMP100 i en 250 ml Erlenmeyer-kolv med en enda koloni plockas från plattan. Inkubera vid 37 ° C, 200 varv per minut i en horisontell skakanordning (figurerna 2E och 2F), och använda en spektrofotometer för att övervaka celltäthet på OD600 = 0,5 till 0,6 (Fig. 2H).
  4. Häll cellerna in i ett 50 ml Falcon-rör eller liknande, och hålls vid 4 ° C fram till användning (fig 2G). Cellerna kommer vanligtvis förbli livskraftig för ~ 1 vecka.
  5. Gör 500 ml LB, placera den i en förbryllad Fernbach kolv och autoklav det. När den är steril, placera kolven vid 4 ° C (figur 2G) eller rumstemperatur tills natten av "DAG ETT" nedan.

OBS: Värd bakteriecellerBLT5403, som uttrycker en plasmidburen källa av T7 nativa kapsidprotein utan vilken T7-mid-och låg-kopierings vektorer inte kan replikera med framgång, är extremt känsliga för viruset. Det är absolut nödvändigt för att undvika kontaminering. Föroreningar kommer så småningom att ske vid vilken tidpunkt alla ytor i kontakt med virus / infekterade bakterier måste torkas med 70% (v / v) etanol eller skrubbas med hjälp av rengöringsmedel (figur 2I). Om detta är ineffektivt, erfordras en grundlig dekontaminering av alla ytor som tål Envirocide (figur 2J). Starta BLT5403 celler från frysen lager varje ny runda av affinitets val för att minska förorening av beståndet i 4 ° C, och säkerställa livskraftiga celler som används i protokollet. Filterbarriär pipettspetsar är viktiga.

3. Affinitetsselektion

DAG ETT

  1. Markera en mikrotiterplatta med permanent bläck och utse vilka brunnar kommer att innehålla vilken protEins / ändringar. (På grund av föroreningsfrågor, är plattorna aldrig återanvändas). Utför detta i 3 replikationer av brunnar för varje protein och behandling.
  2. Tvätta plattan mycket med vatten och avlägsna vatten genom smällde plattan upp och ner på 4 lager papper handduk mellan tvättar. Immobilisera, i 100 | il av Tris, pH 7,5 (eller buffert av val) det rekombinanta proteinet (10 ug / ml) i sex brunnar, eller BSA (10 | ag / ml) i tre brunnar, för totalt nio brunnar för första omgången av affinitets val. Täck skålen med plastfolie och låt stå över natten vid 4 ° C (figur 2G).
  3. Se till att det finns 9 x 250 ml E-kolvar (se 2.1 ovan) rengjorda, autoklaverad, och märkta på lämpligt sätt (kodning med färgad tejp fungerar bra, figur 2F).
  4. Beräkna volymen av faglysat som ska användas för varje brunn baserat på titern av det bibliotek som används och antalet fag som skall screenas.
  5. Se till att fräscha BLT5403 cellerna är redo att användaför titrering denna samhörighet urvalsomgång i morgon (Figur 3A).
  6. Säkerställ tillräcklig 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-bas, pH 7,6) och 1 x TTBS (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20) är tillgängliga för att utföra 10 x 200 pl tvättningar för det antal brunnar som används . Dessutom preinkubera den TTBS vid affinitets val av temperatur. Se till att en säkerhetskopia, förseglad, 50 ml Falcon rör av 1x TTBS existerar vid affinitets val av temperatur med tillräcklig 1x TTBS.
  7. Förbered tre behandlingar x 3 upprepningar x 3 tre exemplar av 1,5 ml Eppendorf-rör (27 totalt) med 990 l av LB 100 AMP vardera och etikett på lämpligt sätt (t.ex. 10 -2). Dessa är för de infekterade bakterierna hämtade från de mikrotiterplattbrunnar morgon. Märk spädning på en sida av röret (10 -2) och en stigande antal på den andra sidan ("1"). För varje Eppendorf-rör, även märka en borosilikatglas rör och en LB 100 AMP platta. I detta way, är plattorna och borosilikatglas provrör numrerade 1, 2, 3, 4, 5, osv. att göra titrering gå fortare. Efteråt det enkla numret kan matchas till utspädning och behandling på Eppendorf-rör (t.ex. # 12 röret var den tredje tre exemplar av den första replikeringen av BSA-kontroll för utspädning 10 -5). Store Eppendorfrör och LB 100 AMP-plattor över natten vid 4 ° C (figurerna 2G och 3B).

Till exempel: Start märkning 1,5 ml Eppendorf-rör för tre 10 -2 utspädningar av fag från BSA replikering man samt 1, 2 och 3 (tre tredubbla läsningar av fag-titer för replikering en), och sedan markera borosilikatglas provrör 1, 2 och 3 i vilket de infekterade bakterierna kommer att blandas med icke-infekterade bakterier och toppagaros innan den hälldes på LB-100 AMP-agarplattor (Figur 3C).

  1. För serie dilutions, etikett Eppendorf-rör och, till var, lägga 900 l av LB 100 AMP. När de initiala utspädningar (10 -2) av infekterade bakterier görs för varje protein / behandling, replikering, och tre exemplar, i morgon kommer de att blandas väl och 100 ^ tas från dem och lagt till lämplig Eppendorf-rör innehållande 900 pl LB 100 AMP för 10 -3 utspädning (rör 4, 5 och 6 för replikering en BSA-kontroll). Dessa kommer att blandas väl i sin tur och de 10 -3 späd kommer att användas för att göra de 10 -4 spädningar (7, 8, 9). Använd de 10 -4 utspädning för de 10 -5 spädningar (10, 11, 12), osv. att få titern för den första av de tre BSA replikationer (brunnar).
  2. Samma sak kommer att ske för BSA replikering två (väl 2), BSA replikering tre (och 3), de tre upprepningar av det förgiftade betet, och slutligen de tre upprepningar av betet brunnarna. I slutet bör det finnas slangar märkta from 1-135 (135 är den sista tre exemplar av den sista replikering av betet vid maximal utspädning om 10 -6). Förvara dessa Eppendorf-rör över natten vid 4 ° C (figur 3C visar Eppendorf och borsilikat rör för alla utspädningar av triplikat i tre replikat (de tre brunnar) av BSA.
  3. Start 2 eller 3 odlingsrör av BLT5403 celler (plockade från enstaka kolonier från en nyligen strimmig natten LB AMP100 plattan, från steg 2.2 ovan) som växer i inkubation shaker (figur 2E och 2F) som en övernattning kultur. Till 500 ml LB (punkt 2.5 ovan), tillsätt ampicillin till 100 pg / ml och placera Fernbach kolven i klämman i skakinkubator så det kommer att vara vid 37 ° C och luftades följande morgon (Figur 2F).

OBS: Omgång tre och fyra kan kräva ungefärliga utspädningar av så mycket som 10 -10 volym phage till volym till LB AMP100.

DAG TVÅ

  1. Nästa morgon, placera autoklaveras, tomma 9 x 250 ml Erlenmeyer-kolvar (en för varje mikrotiterplatta brunn) i klämmorna i inkubering skakapparat. Ympa 500 ml LB 100 AMP med 500 l från en av de övernatt kulturer av BLT5403 celler började igår kväll (se steg 3.8 ovan), återförslut och börjar det växa (37 ° C, 220 rpm). Slå på spektrofotometer (Figur 2H) och ställ in den för att läsa absorbans vid 600 nm.
  2. Avlägsna mikrotiterplattan från 4 ° C, ta bort plastfilmen, och ta bort eventuella obundet protein från plattan genom att tvätta 10x med 200 ^ varje gång för 1x TBS pH 7,5 och smällde plattan upp och ner på pappershandduk mellan tvättar. Blockera med 200 | il 5% (vikt / volym) BSA eller 200 | il 5% (vikt / volym) blockeringsreagens i TBS under 1 h (eller över natten om det passar) med plattan insvept i plastomslag.
  3. Tvätta bort den blockerande sÖSNING 10x med 200 ul varje gång av 1x TBST, smällde plattan upp och ner på 4 lager av hushållspapper mellan tvättar. Det är möjligt att fylla brunnarna med 200 | il vatten i detta skede, täck dem med plastfolie och placera dem vid 4 ° C för att lagra för maximalt en vecka.

OBS: Starta kulturen snart nog att, vid tiden fag infekterade-BLT5403 från slutförandet av samhörighet valet är redo att lägga till, de celler i 500 ml är mellan 0,6 och 1,0 OD 600. Om de växer mycket längre än 1,0, kan lys inte uppstå på grund av begränsningar resurs som cellerna närmar stationär fas. Om cellerna inte uppnår en OD 600 av 0,6 åtminstone före införandet av fag kan infektionsmultiplicitet vara för hög, snabbt döda de celler, som kan påverka återgivningen av lysatet. Om cellerna ännu inte närmar sig en OD 600 på 0,6 genom slutförandet av samhörighet val, INOCUlate kolven med mer BLT5403 från den andra (eller till och med från både andra och tredje) provrör under skakning vid 37 ° C (figur 2F). Om en OD 600 på 1,0 närmar sig för fort, stäng av värmaren och shaker och öppna locket för att kyla kulturen och svälta bakterierna för syre. Uppta värme / skaka när fag har lagts till.

Härifrån använder filterbarriär tips för att undvika fag korskontaminering.

  1. När kolven ympas lade fagbibliotek (100 ^ il) i de proteiner, återförslut plattan med plastfolie och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
  2. Vid 55 minuter, notera OD 600 av cellerna. Fördubblingstiden är ungefär var 20 min. Agera därefter (se "not" ovan).
  3. Vid slutet av en timme bort plasthöljet från plattan och tvätta omedelbart genom att skaka ut fagen i den transformerade avfallet och sedan snabbt tillsätta 200 pl 1x TBST. (Använd en multipipettor med en 1 = 100 ^ huvudet och pipett inställd på 2 [dvs levererar 200 l / kolv depression] för detta och det går snabbt). Ställ in en timer för 1 min. Efter 1 minut, skaka ut buffert i transformerad avfall, smack plattan upp och ner på hushållspapper och lägg tillbaka på bänken (25 ° C platta). Upprepa tvättsteg 10x.
  4. Efter den 10: e tvätt, ta 200 pl BLT5403 celler från 50 ml Falcon rör vid 4 ° C och lägg dem i botten av brunnen från vilken den sista tvätten i TTBS har tagits bort. Linda plattorna i plastfolie och lägg vid 37 ° C i 20 minuter för att få någon fag fortfarande fastnat på bete för att infektera bakterier (se not i diskussionen om ihärdigt hämtas fag och / eller hög bakgrund från urskillningslöst bindande fag).
  5. I slutet av 20 minuter, packa upp plattorna och ta 10 il bakterier från BSA vid 25 ° C replikering en bra och lägga den i 990 l av LB 100 AMP markerade"1". Upprepa ytterligare två gånger för att väl (rören 2 och 3), vilket gav 3 triplikat av 1/100 utspädningar av fag från detta väl. Detta är BSA replikering en samplad tre gånger. Dessa späd kommer att användas för att uppskatta den genomsnittliga titer ± SEM för att replikering av BSA.
  6. Gör samma sak för replikering 2 och 3 i BSA (tre tredubbla prover av 10 pl vardera), för de tre replikerade brunnar i förgiftat bete protein, och för betet protein. Ställ dessa 27 Eppendorf-rör åt sidan och få de återstående 170 l av de infekterade bakterierna i brunnarna som växer mot lys.
  7. Om bakterierna i kolven är vid OD 600 = 0,6-1,0, dekantera 50 ml celler från Fernbach kolven i var och en av nio 250 ml Erlenmeyer-kolvar. Ta de resterande 170 l av faginfekterade BLT5403 bakterier i BSA replikering 1 väl och tillsätt det till de 50 ml rutor markerade "BSA Rep 1" (gul tejp). Gör detta för alla nio brunnar och sätta dem skaka i inkubatorn (
  8. Övervaka cellerna i 37 ° C inkubation skakapparat från tid till tid för lysering (ca 3 tim från tidpunkten för ympning). Gör spädningar från de 27 inledande spädningar (10 -2) i de fall märkta Eppendorf-rör under denna tid.
  9. För att utföra dessa spädningar från de första 27 spädningar från 3.12 ovan, ta 100 pl av LB med bakterier från Eppendorf-rör 1 (BSA replikerings en, först av de triplikatprover från denna 1/100 utspädning från detta väl) och lägg till den 900 l av LB i Eppendorf-rör 4 (1 x 10 -4 utspädning av BSA replikering en, först av de triplikatprover från detta väl).
  10. Släng filterbarriär tips för en ny innan det blir 100 pl av LB med bakterier från Eppendorf-rör 4 för att lägga till 900 l av LB i Eppendorf-rör 7 (1 x 10 -5 utspädning av BSA replikering en, först i tre exemplar prover från denna brunn). Fortsätta de spädningar (degna till 1 x 10 -6) för alla tre exemplar av alla replikationer av alla proteiner och behandlingar (135 rör totalt).
  11. När cellerna har lyserats, bringa kulturen till 0,5 M NaCl genom tillsats av 5 ml från en 5 M NaCl lager och överför till en märkt centrifugflaska.
  12. Centrifugera vid 8000 x g under 10 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten (virus) i en ren, steril 50 ml Falcon rör.
  13. Tillsätt några droppar kloroform till den dekanterade supernatanten i Falcon rör.
  14. Förvaras vid 4 ° C för nästa omgång av samhörighet val.

4. Dag tre

  1. Autoklav eller bleka allt laboratorieutrustning som har använts för att generera denna affinitet urvalsomgång för att förbereda sig för nästa omgång.

5. Bestämning av antikroppnivå

  1. Antal som många fasta LB 100 AMP plattor som det finns utspädningar i stigande ordning (det ska nu vara 1 plåt för varje borosilikatglas rör och Eppendorf-rör, var och en med samma nummer). Put plattorna i 37 ° C inkubator (figur 3D).
  2. Smält toppagaros (1,0 g Bacto trypton, 0,5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl, 0,6 g agaros, späd till 100 ml, autoklav) genom att lossa toppagaros flasklocket och växelvis mikrovågsugnen flaskan och virvla runt den för att blanda det tills den övre agaros har helt smält. Placera flaskan i vattenbadet svalna till 50 ° C (figur 3E).
  3. Ta en borosilikatglas 10 ml pipett med en pipett pump ansluten. Tänd en bunsenbrännare. Slå en frigolit Falcon rör innehavaren eller kallare locket upp och ner på bänken och placera LB100 AMP plattorna 1 till 6 (färskt ut ur 37 ° C inkubator) på det, Plate 1 översta (Figur 4A). Frigolit håller plattorna varma.
  4. Sätt 250 pl BLT5403 celler från 4 ° C till var och en av de numrerade borosilikatglas provrör beredda på dag ett ovan (avsnitt 3.7 och figurerna 4b och 4c). Arvariera de numrerade borosilikat rören i samma stigande serie som späd i 1,5 ml Eppendorf-rör (Figur 4A).
  5. Sätt 100 pl från utspädnings i Eppendorf-rör 1 i 250 l av celler i borosilikatglas provrör 1 (figur 4D och 4E). Värm först 5 i av pipetten över lågan lite (inte för mycket! ~ 3 swipes, Figur 4F) och dopp i det smälta toppagaros. Dra upp 3 ml och leverera snabbt in i provröret ovanpå celler / fag (Figur 4G).
  6. Blanda genom att snärta med ett finger samtidigt som du håller röret med den andra sidan (figur 4H) och häll innehållet på plattan (Figur 4I). Vippa plattan och använda provröret för att jaga bubblor och torra fläckar tills hela plattan är täckt av det övre agaros. Ställ den åt sidan, upprätt på bänken för att svalna.
  7. Släng borosilikatglas röret, ta ut filterbarriären spetsen, få enfärskt och fortsätter tills alla spädningar är klädd. Retrieve LB 100 AMP-plattor från inkubatorn, eftersom de är uttömda, men högst 6 åt gången eller de svalna och toppagaros stelnar för snabbt.
  8. När toppagaros är fast, vrida plattorna upp och ned (DET ÄR VIKTIGT ATT GÖRA DETTA). I annat fall, den agar / agaros "gråter", kondenserar på locket, faller ner på toppagaros och kör över det, ta fag med det gör det omöjligt att titer exakt) och antingen: 1) sätta plattorna i 37 ° C inkubator [tillbaka 4 timmar senare att räkna titer som T7 är aggressiv] OR: 2) Lämna dem upp och ner på bänken och de är redo nästa morgon för att räkna titer.
  9. Vidta alla nödvändiga åtgärder för att skydda mot att glaset splittras, eller skada, om den gör det, satte toppagaros hatten på flaskan löst och mikrovågsugn toppen agaros tills det kokar. Gör detta två gånger. Låt den svalna, dra åtmössa och lägga undan den. Vänd vattenbadet ned till sin vanliga temperatur eller stänga av den. Sätt späd i 4 ° C kylskåp. De kommer att behövas för att tolka titer och / eller göra om en del av titrering.

6. Bestämma och beräkna titer

  1. Undersök plack bildas på plattorna och kasta dem med sammanflytande lys (Figur 5A t.ex. 10 -2 utspädning). Bestäm vilka av de återstående seriespäd har producerat tillräckligt få plack för att möjliggöra en korrekt tally (fig. 5A en nd 5B). Registrera antalet plack från dessa plattor (tabell 1, figur 5B).
  2. Multiplicera antalet plack genom utspädning och sedan multiplicera detta antal med 100 för att få antalet plackbildande enheter per ml av infekterade bakterier tagna från brunnarna (dvs. endast 10 l av infekterade bakterier togs för var och en av de tre exemplar och so detta måste multipliceras med 100 för att få pulser per ml). Medelvärdet av antalet plackbildande enheter (PFU) per milliliter (PFU / ml outspädd infekterade bakterier tas ur mikrotiterplattan väl), över de tre tre exemplar tagna från detta väl.
  3. Bilda en Grand Genomsnitt av de stämmer för de tre replikatbrunnar och beräkna standardfelet för detta medel (tabell 1). Detta är vad som kommer att spelas in i figuren av ökningen av fag-titer för varje affinitet urvalsomgång och behandling (figur 5C).

7. Plack isolering, PCR och sekvensering

  1. I slutet av affinitetsurvalsomgången 4, väljer 18 individ, väl definierade, plack kolonier och, med hjälp av en steril Pasteur pipett, tandpetare, gul pipettspetsen eller liknande anordning, kärna dessa plack från titrering plattorna. Vid användning av rör eller spetsar, först väta insidan med Tris-HCl, pH 8,5 i Eppendorf-rör (Figur 5D).
    2. (Figur 5E). Släpp lampan med pipettspetsen fortfarande i agar / toppagaros och suga upp kärnan (figur 5F, se pil).
  2. Häll ut kärnan i 100 | il Tris-HCl, pH 8,5 i lämpligt rör (figur 5G) och skaka snabbt.
  3. Värm 20 l från denna volym vid 65 ° C i 10 min.
  4. Centrifugera den uppvärmda volymen vid 13000 x g i en bordscentrifug vid rumstemperatur under 10 min. Ta 3 pl från supernatanten av denna alikvot som skall användas i PCR-reaktioner med T7-UP-och T7-DOWN primrar.
  5. För var och en av de 18 isolerade plack, uppvärmda lösningar, göra en 50 pl PCR-reaktion med hjälp av en härdningstemperatur på 58 ° C och 35 cykler.
  6. Kör 20 ul av each reaktion på en 1% (vikt / volym) agarosgel innehållande 0,015% (vol / vol) etidiumbromid. Visualisera med en transilluminator med hjälp av lämpliga ögonskydd och nitril labbhandskar. (FÖRSIKTIGHET: etidiumbromid är en potent mutagen.) Fotografi av gelén och avyttra kontaminerade material på rätt sätt (fig. 6A och 6B).
  7. Om amplikonema är enskilda produkter, och inte från tomma vektor (produkt går nära 100 bp på en 1% (vikt / volym) TAE agarosgel, figurerna 6A och 6B pilar), rengör de återstående 30 l för användning som en sekvense mall. Om inte en enda produkt på gelén (Figur 6B, plack 15), skär ut den mest framträdande band (s) från gelén och extrahera DNA från gelén med användning av ett kit.
  8. Sekvens amplikoner som inte är tomma vektorer med användning av T7-UP primer.
  9. Undersök varje sekvens för de länkarmar och, från denna information, bestämma var påbörjandet av insatsen är placerad. Använd Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) för att fastställa identiteten för den kodade cDNA, om insatsen är i ramen och, om så är fallet, har hur stor del av den proteinkodande sekvensen (CDS) visats och fångats av bete.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att kunna försämra förmågan hos betet att interagera med fag-visade proteiner (metaboliskt förgiftat bete) ger en potent negativ kontroll för denna teknik. Det är också lämpligt för att bestämma om betet, när det är bundet till mikrotiterplattan väl bibehåller sin funktion. Båda dessa kontroller kommer att öka det förtroende som interagerar, fag-visade proteiner som återvunnits av nonpoisoned bete är legitima.

Provtagning tre tre exemplar från varje brunn lägger betydligt till den tiden och arbetet med affinitets urval men ger en mer exakt uppskattning av titer inom varje brunn än provtagning endast en gång. Medan de flesta av titrarna för de tre exemplar är i god överensstämmelse, notera att tre exemplar för replikering 2 av BSA i omgång fyra varierar kraftigt (Tabell 1). Genom provtagning flera gånger, de slutliga beräknade stämmer är inte lika mottagliga för pipettering fel och en mer exakt uppskattning av than faktiskt titer och variationen kring denna uppskattning, väl-till-bra, erhålls (tabell 1, figur 5C).

Ökad fag-titer, företrädesvis för nonpoisoned bete, eftersom antalet affinitet val rundor ökning, ger också förtroende för att tekniken fungerar (figur 5C). Bibehållandet av en ökande andel av fag innehållande insatsen i nonpoisoned bete brunnar som antalet affinitets val ökar är också gynnsamma (fig. 6A och 6B).

Efter avancerade rundor affinitetsselektering, en ökning av antalet återvinnas oberoende fag som sätter (urskiljas som PCR-amplikoner större i storlek än ~ 100 bp, Figur 6B), i förhållande till den första omgången (Figur 6A), samt reglerandet av dessa amplikoner på några identiskt stora band (not lanes 5-9, 11-18 i figur 6B </ Strong>), är en bra indikation på att vissa kloner väljs i affinitetsselektering (fig. 6A och 6B). Efter sekvensering av ett antal av plack erhölls i det slutliga affinitetsselektion runda, är återvinning av en liknande region (olika kloner) av samma protein oberoende bekräftelse på att den del av det visade proteinet har en bona fide affinitet för betet. Dessa oberoende återvinnas fag ger också information om vilken del av hela proteinet är i stånd att interagera med betet. Om fag visade cDNA-bibliotek har konstruerats med hjälp av slumpmässiga priming, kan en stor mångfald av partiell-och fullängds-protein täckning förväntas (inom gränserna för fag att tolerera cDNA insättningsstorlek), vilket leder till flera, oberoende kloner täcker samma del av proteinet. Även de angränsande out-of-frame träffar bör granskas för att avgöra om de kodar en liknande motiv som baden binder. (Detta förutsätter att biblioteken inte konstruerades med hjälp av ORF-teknik 3).

Tabell 1
Tabell 1. Beräkningar för den genomsnittliga titer / ml infekterade bakterier från brunnarna i den fjärde omgången av affinitets val för de tre behandlingarna. Siffrorna för varje tre exemplar av den 10 -3 utspädning av plack tas från den första replikeringen av betet väl är hämtade från figur 5B. Klicka här för att visa en större tabell .

Figur 1
Figur 1. Övergripande grafisk skildring av fagdisplay processen A) tillgång till en fag som visas bibliotek, företrädesvis konstruerad med hjälp av slumpmässigt primas, vald poly-A-RNA, för att generera cDNA, och B) ett bete som är, i den mån det är möjligt, verifierbar som biologiskt aktiv, även när immobiliserad på en fast bärare och, om möjligt, görs inaktivt genom tillsats av en inhibitor (t ex kompetitivt inhiberade från att binda betesprotein). RT: omvänd transkription.

Figur 2
.. Figur 2 En del av den utrustning och material som behövs för att utföra faguppvisning Steril teknik kräver tillgång till både: A) en autoklav och, B) ett laminärt flöde huva. Fagbibliotek och BLT5403 bakteriell lager kräver -80 & # 176, C temperaturer för långvarig förvaring C) Växande fag och bakterier kräver, DF) 37 ° C inkubatorer, varav en, EF) är kapabel att växa flytande kulturer (orbital). Optimera experimentet genom färgkodning, F) minimerar misstag. BLT5403 celler för titrering kan lagras under upp till en vecka, G) vid 4 ° C. Optimera placeringen av, H) spektrofotometer för följande celltätheter intill det kretsande skakapparat kan spara tid. Ofta behandlar ytor och pipetter med, I) kraftfull rengöringsmedel och J) Envirocide, kan hjälpa till att minimera risken för viruskontamination. Klicka här för att visa en större bild.

85fig3.jpg "fo: src =" / files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Ett möjligt upplägg användbart för att tillåta smidig affinitet val. A) BLT5403 odlas en eller två dagar före titrering och är pläterade, utan viral introduktion, för att fastställa att de inte är smittade med virus. Titrering på dagen för den affinitetsselektion kan underlättas genom framställning i förväg av: B) prelabeling Eppendorf och, c) borosilikatglas rören som skall användas B) alikvotering utspädningslösningar av LB 100AMP och förvaring vid 4 ° C över natten D.. ) Placera prenumbered LB 100AMP agar-innehållande, petriskålar vid 37 ° C för att värma ca 1 h före titrering. e) Smält den sterila toppagaros (lossa locket) och placera det i en förvärmd 50 ° C vattenbad för att kyla till denna temperatur en timme före titrering påbörjas. Använd en lead munk för att undvika flask kantring som toppagaros tas bort. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Titrering fag återhämtat sig från en runda av affinitets val. Plätering påbörjas så snart som möjligt efter infektion för att förhindra onaturligt hög titer. A) Den första uppsättningen av virusinfekterade BLT5403 utspädningar och borsilikatet rören monterade i rack. Använda filterbarriär tips: BC) 250 ^ BLT5403 celler från lager från 4 ° C överförs till borsilikatet rören. Använda filterbarriär tips: DE) BLT5403 i första borosilikatglas röret är infekterad med first virusspädning. F) Borsilikatet pipett värms över öppen eld för att förhindra igensättning och för att hålla den toppagaros varma. . Värm inte pipetten drivet eller bakterierna kommer att skållas och dö G) 3 ml smält toppagaros snabbt hämtas och hälls över bakterierna i borosilikatglas röret H) Röret är knäppt kort stund för att blanda innehållet och;. I) Innehållet hälls på den förvärmda LB 100AMP agarplattor, med hjälp av röret för att flytta bubblor på sidorna av plattan och för att säkerställa den toppagaros täcker hela plattan. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. Typiska titer reresultat. A) De lägre spädningar (10 -2) nästan undantagslöst resulterar i sammanflytande lys för alla behandlingar i första affinitet urvalsomgången (viruset i figuren har odlats alltför länge vilket leder till överdriven plackstorlek för att underlätta fotografering). B) Lämpliga spädningar av plack räknas med användning av en Sharpie att hålla reda på stämde plack. C) titem ökar drastiskt för bete brunnar medan de förblir mer eller mindre stabila under BSA eller förgiftade betet. I senare omgångarna, är titer från bete brunnar platåer och ytterligare affinitetsselektering improduktiv. D) En väl isolerad plack har valts för sekvensering och samlas in av väta Betesmark pipetten med lösning från Eppendorf-rör, var noga med att avlägsna överflödig vätska minst det överkörd flera plack och förorena kärnan. E) Pipetten har drivit igenom plack med pipetten glödlampa redan komprimerad. F) Glödlampan har släppts medan pipetten är fortfarande i toppen agaros, sugande plack upp i pipetten (pil). G) den kämförsedda plack är på väg att levereras in i vätskan i den lämpliga Eppendorf-rör. Fag späd (volym av infekterade bakterier per volym av LB 100AMP) avbildas på petriskålar (t.ex. 10 -3 = 1/1, 000 utspädning). De tre trippelprover från replikering väl 1 förkortas resan. 1, Trip. 2, och resa. 3, allt för replikering 1 (Rep 1 = bra 1). Siffrorna i botten av plattorna i B) är de verkliga placknumren stämde på plattorna. Dessa är för 10 -3 utspädning av bakterierna från den fjärde omgången av affinitetsselektering (R4 i figuren) över betet. Klicka här för att visa en större bild .


Figur 6. Typiska PCR-resultat för affinitetsselektering över en lämplig bete. A) Andelen tom vektor plack (pilar) är oftast ganska hög i början, men i betesbrunnar, B) minskar i efterföljande omgångar. Plattan innehåller insatsen har tenderat att bosätta sig på de som innehåller identiskt stora insats i denna senare affinitet urvalsomgång. MWM: molekylviktsmarkör.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genom att köra försöket i tre replikerade brunnar, kan självständigt förvärvat fag av samma proteinbindning till betet urskiljas, även om de är samma klon (dvs. ingen skillnad i nukleotidsekvensen för CDS region som har erhållits, men dessa har varit hämtas från oberoende brunnar). I annat fall är det enda sättet att skilja mellan fager som kodar för samma protein som binder till betet, om de är oberoende omvänt transkriberade regioner som skiljer sig i någon del av nukleotidsekvensen.

Användningen av en Fernbach kolv för att odla alla bakterier för användning förstärka affinitet vald fag tillåter en mycket mindre hektiskt övervakning av bakterietillväxt som leder fram till infektion efter affinitet val än att försöka övervaka 9 E-kolvar. Dekantering dessa bakterier, precis före infektion, i förvärmda Erlenmeyerkolvar eliminerar också underbibliotek titer avvikelser på grund av alteransoner i infektions grund av dålig bakterietillväxt i specifika kolvar. Sålunda bör förändringar i fag-titer från runda till runda beroende av antalet av fag kvarhålles i brunnarna och variationen i titer mellan replike brunnar bör vara minimal.

En exceptionell fördel med hjälp av fag-display är den stora kraften tekniken har att identifiera fag-visas-protein som har en affinitet för en viss bete. På grund av den effektivitet med vilken fagen replikera i BLT5403 värd, och med en enda fag som representerar en sällsynt CDS som hålles i en brunn i den första affinitetsselektion runda bör pälsen-fusionsprotein har en hög affinitet för betet, kommer vara representerade i den andra omgången med mycket större siffror. Genom att den fjärde omgången bör denna fag utgör majoriteten av fagen som finns i den lyserade kulturen.

Denna kapacitet av fagen replikera till hög titer är också en begränsning av den tekniskanique. Om en speciell bete har ett interagerande protein partner för vilken det har hög affinitet i biblioteket, är det mycket svårt att fånga proteiner som legitimt kan binder betet men vid en lägre affinitet, eftersom dessa kommer att tendera att konkurreras ut av högaffinitets-bindande protein . Användningen av nästa generations sekvenseringstekniker för att identifiera en sådan sällsynt fag är ett möjligt sätt att kringgå denna begränsning 1. Dessutom känsligheten hos BLT5403 till T7 fag ger anfall av "förorening" i hela labbet som kräver uthållighet, ganska hårda saneringsmedel (t.ex. Envirocide) och utmärkt steril teknik för att övervinna. Föroreningar kan resultera i en avsevärd tidsförlust i utvecklingen av affinitets val som man försöker att identifiera och eliminera källan.

Ett medel som har begränsad framgång i partitione fag i trånga och lösa "bindemedel" är att försöka återskapa den lösa pärmar första by införande i brunnarna av en lösning (1% SDS eller liknande kaotropt medel) som utformats för att avlägsna fag som är mindre hårt bundna till betet. Denna lösning kan sedan tas bort först, före införandet av bakterierna i brunnarna som förväntas bli smittad av de fager återstående bundna till betet. Denna teknik kan också minska bakgrund, falskt bindande fag, avsevärt. Men om denna teknik eftersträvas, är antalet sublibraries, replikat och dubbletter samhörighet valts i efterföljande omgångar fördubblats, vilket bidrar avsevärt till den tid och kostnad.

Efter loppet av fag-titer ökning under flera omgångar av affinitetsselektion kan köra igenom en stor volym av LB och ett stort antal LB 100 AMP-plattor, filterbarriär tips, Eppendorfrör etc. Detta är dyrt liksom sekvense skyldig att undersöka även ett blygsamt antal fag. Titrering ett stort antal spädningar av flera replikat av treatments i tre exemplar kräver mycket tid, så det är viktigt att ställa upp så mycket av materialet som möjligt dagen före affinitets val är av största vikt.

En spännande möjlighet som för närvarande håller på att utforskas är att använda läget för de oberoende fag-proteiner, bindning till ett bete, för att modellera de fysiska attribut och den tredimensionella strukturen av den region av proteinet som interagerar med betet. Till exempel undersöker attributen för proteinmål som band till en uppsättning homologa Late Embryogenesis Abundant (LEA) proteiner från Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) och sojaböna (Glycine max), det var en viktig slutsats som LEA proteiner bundna till regionen av den proteiner som var den mest (eller bland de mest) hydrofila av bindande proteiner 11. I efterhand, med tanke på att LEA proteiner hypotes att skydda sina kundmolekyler från denaturering under uttorkning, kan det vara surmised att regionen klientmolekylerna mest mottagliga för dysfunktion utan LEA skydd kan vara de som mest kan binda vatten (hydrofila).

Det är tillrådligt att minimera tiden mellan införandet av bakterierna i brunnarna och deras hämtning så att titer inte är uppblåst. Se till att späd är tillräckliga genom plätering några BLT5403 utan virusinfektion för att kontrollera att den bakteriella lager inte förorenas och att de största späd är tillräckliga för att undvika sammanflytande lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Projektet har delvis finansierats av en NSF IOS (0849230), Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011 till 04.375), och Sir Frederick McMaster Research Fellowship till ABD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Becton Dickinson Co. 211705
Yeast Extract Becton Dickinson 212750
Agar Becton Dickinson 214010
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Agarose Research Products International A20090
Blocking Reagent EMD Chemicals Inc. 69064
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher Scientific BP166-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Escherichia coli BLT5403 EMD Chemicals Inc. BLT5403 Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt Research Products International A40040
Ethidium bromide Fisher Scientific BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Corp. A-9647
Penta-HIS primary antibody Qiagen Inc. 34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate Sigma-Aldrich Corp. A-5153
para-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich Corp. N-7653
T7-UP primer EMD Chemicals Inc. 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer EMD Chemicals Inc. 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen Inc. 28104
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen Inc. 28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Invitrogen Life Technologies 4336917
Heating Block Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) 18780
96-well Cell Culture Plates Corning Costar 3590
Isotemp Incubator Oven Fisher Scientific 516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in Fisher Scientific 13-678-20A
ChromaView Transilluminator UVP Inc. TS-15
UV Shield Oberon 071AF
Gloves, Nitrile Fisher Scientific 19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes USA Scientific Inc 1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes Fisher Scientific 13-678-25E
Borosilicate culture tubes Fisher Scientific 14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland Type 362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

Tags

Biochemistry affinitetsselektion Phage display interaktion protein-protein-
Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K.… More

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K. R., Downie, A. B. A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits. J. Vis. Exp. (84), e50685, doi:10.3791/50685 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter