Summary
I denne artikel vil vi præsentere hurtige mikro-iontophoresis af neurotransmittere som en teknik til at undersøge integration af postsynaptiske signaler med høj rumlig og tidsmæssig præcision.
Abstract
En af de grundlæggende interesser i neurovidenskab er at forstå integrationen af stimulerende og hæmmende inputs langs meget kompleks struktur af dendritiske træet, som i sidste ende fører til neuronal output virkningspotentialer på Axon. Indflydelsen af forskellige rumlige og tidslige parametre for specifik synaptisk input om neuronal output er i øjeblikket under efterforskning, f.eks distance-afhængige dæmpning af dendritiske inputs, placering-afhængig interaktion af rumligt adskilte indgange indflydelse GABAergig hæmning på excitatory integration, lineær og ikke-lineære integration modes, og mange flere.
Med hurtig mikro-iontoforese af glutamat og GABA det er muligt præcist at undersøge den rumlige og tidsmæssige integration af glutamaterge excitation og GABAerg hæmning. Kritiske tekniske krav er enten en udløst lysstofrør, light-emitting diode (LED), eller en to-foton scaLønning mikroskop for at visualisere dendritiske grene uden at indføre betydelige foto-beskadigelse af vævet. Endvidere er det meget vigtigt at have en mikro-iontoforese forstærker, der giver mulighed for hurtig kapacitans kompensation af høje resistensniveauer pipetter. Et andet afgørende punkt er, at ingen sender ufrivilligt er udgivet af pipetten under eksperimentet.
Når de er etableret, vil denne teknik giver pålidelige og reproducerbare signaler med en høj neurotransmitter og beliggenhed specificitet. Sammenlignet med glutamat og GABA uncaging, hurtig iontoforese tillader brug begge sendere på samme tid, men i meget fjerntliggende steder uden begrænsning til synsfeltet. Der er også fordele i forhold til fokal elektrisk stimulering af axoner: med mikro-iontoforese placeringen af input site er absolut kendt, og det er sikkert, at kun neurotransmitter interesse frigives. Skal det imidlertid tages i betragtning, at med mikro-iontoforese kunpostsynapse aktiveres, og præsynaptiske aspekter af neurotransmitter release er ikke løst. I denne artikel vil vi vise, hvordan du opsætter mikro-iontophoresis i hjernen skive eksperimenter.
Introduction
Neuroner i centralnervesystemet modtage en række synaptiske input på deres tynde og forgrenet dendritiske processer 1.. Der er de fleste af de excitatoriske dendritiske inputs medieret af glutamaterge synapser. Disse synapser kan aktiveres i et rumligt distribueret måde, hvilket resulterer i postsynaptiske lineær integration af excitatoriske postsynaptiske potentialer (EPSP'er). Hvis synapser aktiveres samtidig og fysisk nærhed på dendritceller, kan disse excitatory indgange integreres overnationale lineært og generere dendritiske spikes 2-5.
Integreringen af excitatoriske inputs afhænger placeringen af indgangen på dendritiske træet. Signaler, der ankommer ved den distale tot region er meget mere svækket end proksimale inputs grund kabel filtrering 6.. I hippocampus er fjernt inputs til de apikale tot dendritter genereret af en anden hjerne region end dem på proximal dendrites 7.. En spændende spørgsmål er derfor, er hvordan synaptic input behandles af forskellige dendritiske rum, og hvis dendritiske integration regulerer indflydelse disse lagdelte indgange på neuronfyring på forskellige måder.
Ikke blot de funktionelle egenskaber, morfologiske funktioner i dendritceller er placering og gruppering af de input, der påvirker dendritiske integration af excitatoriske inputs, også de ekstra hæmmende input fra GABAergic terminaler afgørende fastlægge effekten af de glutamaterge synapser 8,9. Disse forskellige aspekter af synaptisk integration kan være ideelt undersøgt ved hjælp neurotransmitter mikro-iontophoresis, som giver rumligt definerede anvendelse af forskellige neurotransmittere til dendritiske domæner. Vi viser her, hvordan man kunne etablere mikro-iontophoresis af glutamat og GABA til at undersøge signal integration i neuroner.
For denne ansøgning, fin spidshøje resistensniveauer pipetter fyldt med koncentrerede neurotransmitter løsninger anvendes. Disse pipetter er placeret tæt på den ydre membran af cellen, hvor neurotransmitter receptorer er lokaliseret. En god visualisering af dendritiske grene er påkrævet. Dette opnås bedst ved hjælp af fluorescerende farvestoffer, som indføres via patch-pipetten. Derefter en meget kort (<1 ms) strømimpuls (i intervallet 10 til 100 nA) anvendes til at udstøde de ladede signalstoffer. Med disse korte pulser og effektiv kapacitans kompensation, kan postsynaptiske potentialer eller strømninger blive fremkaldt med høj tidsmæssig og rumlig præcision, hvilket betyder placeringen af excitatoriske input kendes nøjagtigt. Glutamat mikro-iontoforese kan aktivere synapser i en defineret radius, der er mindre end 6 um som vist her (figur 1 9), men det er også muligt at nå enkelt synapse opløsning 10-12.
Heine, M., et al 13.. Med hurtig mikro-iontophoresis er det let muligt at anvende to eller flere iontoforetiske pipetter og placere dem på forskellige, selv fjerntliggende steder på dendritiske træ. På denne måde kan integration af ophidsende begivenheder, herunder fra forskellige veje, undersøges. Det er også muligt at anvende en glutamat og en GABA fyldt iontoforetisk pipette samtidigt. På denne måde virkningen af GABAerg hæmning på forskellige steder i forhold til den excitatoriske indgang (på vej, off-sti inhibering) kan studeres. Også virkningen af hæmning af interneuroner rettet mod specifikke neuronale domæner ligesom distale dendritter, soma eller axoner 14, kan undersøges ved hjælp af GABA iontophoresis. I dyrkede neuroner, tilbyder hurtig mikro-iontophoresis mulighed for at investigate enkelt synapse distribution og de elementære aspekter af synaptisk kommunikation i neuroner i meget mere detaljeret 10,11.
I denne artikel vil vi demonstrere i detaljer, hvordan man etablere glutamat og GABA iontophoresis til brug i akutte hjernen skiver, som giver efterforsker synaptisk integration af excitatoriske og hæmmende inputs i afhængighed input placering, input styrker, og timing, alene eller i samspil. Vi vil påpege fordele og begrænsninger ved denne teknik, og hvordan du foretager fejlfinding med succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Systemkrav
- Microscope system: God visualisering af dendritceller er afgørende. Hvis den er tilgængelig, kan du bruge en to-foton laser scanning mikroskop system. I vores eksperimenter har vi brugt en TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Tyskland eller Ultima IV-system, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin udstyret med en Ti: Sapphire ultrahurtig-pulset laser (Chameleon Ultra II, Sammenhængende) og en høj NA målsætning (60X, 0,9 NA, Olympus) at visualisere dendritter, som vi havde fyldt med et fluorescerende farvestof via patch-pipetten. Selvom foto-skade menes at være mindre strenge anvendelse af 2-foton scanning, reducere lasereffekten (under 8 mW ved væv) og opholdstider (under 1 mikrosekunder), eller så meget som muligt.
- En anden mulighed er at udløse en bred felt fluorescens lyskilde (LED eller et lysstofrør) synkront med erhvervelse at reducere eksponeringstiden så meget som muligt. Vi har brugt en monokromator med integreret lyskilde (TILLPhotonika, Gräfelfing, Tyskland) på et Zeiss Axioskop 2 FS opretstående mikroskop, som var udstyret med Dodt kontrast infrarød belysning (TILLPhotonics, Gräfelfing, Tyskland). I vores eksperimenter eksponeringstider varierede fra sædvanligvis 10 msek til max. 30 msek.
- Brug en hurtig mikro-iontophoresis forstærker, fx en to-kanals mikro-iontophoresis systemet MVCS-C-02 (NPI elektroniske, Tamm, Tyskland) med hurtig kapacitans kompensation. De fine spids iontoforese mikroelektroder har modstande 25 - 100 MOhm (afgørende afhængig af dysestørrelse og pipetten form), og hurtige stigetider kan kun opnås, hvis kapacitans kompensation for det iontoforetiske forstærkeren optimalt tunet. Denne hurtige kompensation er nødvendigt at anvende de nuværende pulser med en kort og hurtig indsættende i sub-millisekunder til iontoforetiske pipette og derved skubbe sender med høj rumlig opløsning i stedet størrelser under 1 um 13. Iontoforese forstærkere er alså tilgængelige fra flere andre virksomheder, som vi ikke har testet i vores laboratorium. Disse enheder er til vores kendskab ikke er udstyret med kapacitans kompensation kredsløb.
2.. Forbered Løsninger
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) og intern løsning, da det er nødvendigt for det eksperimentelle design. Den eneste tilføjelse til den indre opløsning, der er påkrævet, er en rød eller grønt fluorescerende farvestof (fx 50 til 200 uM Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazid, Invitrogen), afhængigt af optisk udstyr. Her et eksempel for ACSF saccharose, som kan anvendes til dissektion, i mM: 60 NaCI, 100 saccharose, 2,5 KCI, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 1 CaCl2, 5 MgCI2, 20 glucose og for normal ACSF løsning til patch-clamp eksperimenter i mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glucose.
- Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) alle ekstracellulære løsninger konstant.
- Forbered intern løsning, for eksempel i mM: 140 K-gluconat, 7 KCI, 5 HEPES-syre, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA, med 50-200 uM Alexa 488.
- For glutamat mikro-iontoforese fremstille en opløsning med 150 mM glutaminsyre og pH indstilles til 7,0 med NaOH. Tilføj 50 -200 pM Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazide (Invitrogen) til visualisering.
- Til iontoforese af GABA forberede en 1 M GABA opløsning og pH indstilles til 5 med HCI 15. På dette pH GABA er opladet, kun så det kan anvendes ved hjælp af iontoforese. Bemærk, at den lave pH i opløsningen skubbet til det ekstracellulære rum kan påvirke GABA transmission selve 16,17.
Beskyt GABA løsning fra lys og ofte forberede frisk GABA stamopløsning, eftersom ældre løsning kan miste sin effektivitet. - Hvis det er svært at se GABAergic begivenheder, en high Cl - drivkraft intern løsning, for eksempel ved at udelade KCl hjælpe måske at visualisere GABAerge begivenheder at se, om GABA iontoforese arbejder, men at undersøge synaptisk integration en fysiologisk drivkraft kan anbefales. For generel detektering af små GABAergic begivenheder, kan en protokol vist i figur 8C hjælpe.
3.. Træk og Test Iontophoresis Pipetter
- I almindelighed er at trække de rigtige pipetter måske den mest kritiske trin for at opnå kontrolleret neurotransmitter iontoforese. Ved brug iontoforese i cellekultur, er det muligt at trække meget fine elektroder ligner skarpe mikroelektroder 10. I patch-clamp-forsøg i akutte skiver, men disse meget tynde pipetter bøje på skive overflade, når de sænkes ned i vævet med en vinkel, hvilket gør det umuligt at nå dybere dendritter.
- Derfor trække en pipette med en meget lille spids, således at ingen neurotransmitter kan lække ud, men spidsen er stadig at være stiv nok til at trænge ind i vævet (figur 2). For eksempel bruger 150 GB F 8P klasse pipetter (Science Products, Hofheim, Tyskland), og en vandret aftrækker (for eksempel en DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland eller en P-97 Puller, Sutter Instrument Company , Novato, CA) med flere trækker skridt til at opnå en lille åbning, men også en kort snittappen med en stejl vinkel (figur 2 og tabel 2).
- Det er også muligt at anvende kvartsglas pipetter til at trække iontoforetiske pipetter 10. Disse formodes at have bedre mekaniske egenskaber og for at være mere pålidelige, men specielle laser aftrækkere er påkrævet. Men det er også muligt at opnå gode resultater med normale glaspipetter, der normalt bruges til at trække patch pipetter.
- Test pipetten ydeevne og modstandsdygtighed i et kammer uden væv, før du bruger dem førstetid kunne da lækage af glutamat skade vævet.
- Opsæt iontophoresis forstærkeren korrekt. Derefter fylde pipetten med neurotransmitter og farvestof indeholdende opløsning, og læg det i badet (ACSF).
- Kompensér kapacitans (figur 3). Normalt meget skarp pipetter vil have en højere kapacitans end stumpe dem.
- Kontrollér modstanden af pipetten: Den mikro-iontophoresis forstærker bruges her har en indbygget funktion til at måle pipette modstand. Det fremkalder korte rektangulære testimpulserne, som kan overvåges med en standard oscilloskop eller et A / D bord sluttet til en computer med køb software. Afhængig af formen og spidsen størrelse, bør spidsen har en modstand mellem 25-90 MOhm.
- Fokus på spidsen med en 60X eller 40X vand immersionsobjektivet og skifte til fluorescerende billeddannelse og hvis det er muligt, zoome i. Hvis fluorescerende farvestof siver ud af pipetten tip, anvende en lille positiv (i tilfælde af glutamate) eller negativ (i tilfælde af GABA, figur 4) bevarer strøm (<0,02 uA). Hvis det ikke hjælper at annullere lækage, ændre pipette.
- Påfør en stærk trin strøm eller bruge den manuelle trigger og overvåge spidsen i fluorescerende billede for at se, om løsningen kan skubbes ud af pipetten. Som nævnt ovenfor, er polariteten af den aktuelle puls afhængigt ladning af molekylet, der formodes at blive skubbet ud. At skubbe glutamat det er en negativ strøm og GABA en positiv strøm (figur 4).
- Luftbobler i pipetten at blokken udstødning af farvestof og senderen, kan cleares ved at anvende en høj udstødning løbende flere gange.
- Taget sammen, hvis der ikke er synlig udsivning og test udslyngning var vellykket, kompensere kapacitans og starte eksperimentet.
- Forsigtig: Da kapacitans kompensation opnås ved et feedback-kredsløb, dette kredsløb kan overskridelse eller svinge, hvis det er overcompensated. Forsigtigt bruge drejeknappen indstilling til kapacitans kompensation.
- Afhængig af aftrækker stabilitet er det somme tider nødvendigt at justere aftrækker indstillinger fra tid til anden, da glødetråden kan have ændret egenskaber. Men hvis en gang en god pipette designet, kan det bruges til flere dage. Derfor, efter endt eksperimentet gemme iontoforetiske pipetten i en lukket beholder uden at beskadige spidsen.
- For den næste eksperiment fylde pipetten med neurotransmitter løsning gælder flere stærke eject pulser at rydde spids og derefter kontrollere, om egenskaber (fx. modstandsdygtigheden) ændrer sig væsentligt. Derefter kompensere kapacitans og bruge pipetten igen. Må ikke bruge en enkelt pipette med forskellige neurotransmitter løsninger.
4.. Forbered hjerneskiver
- Hvis mikro-iontophoresis bruges for første gang, helt sikkert forberede skiverne efter at have etableret et pålideligt arbejder aftrækker program. <li> Udfør anæstesi og halshugning procedurer i overensstemmelse med de dyrepleje retningslinjer for din institution eller kommune.
- Efter fjernelse af hjernen, overføre det til iskold ACSF saccharose (se protokol 2.1).
- Skær området af interesse i skiver af passende tykkelse (for eksempel 300 um).
- Inkuber skiverne i ACSF saccharose ved 35 ° C i 30 min. Efterfølgende overføre dem til en neddykket bedrift kammer indeholdende normal ACSF ved stuetemperatur.
- Gennem udarbejdelse og eksperimentere carbogenize de ACSF omgiver skiver med 95% O 2, 5% CO 2.
5.. Etablere en hel-celle optagelse
- Placer iontoforese pipetten (r) allerede nær skive overfladen før lappe en celle, for at undgå langvarig positionering, efter oprettelse af helcelle-tilstand.
- Træk en lav modstand patch pipette (3-5 MOhm), fyld den med dI indeholdende intern opløsning og anvende positivt tryk til pipetten (30 - 60 mbar).
- Indtast bad og tilgang cellen under visuel vejledning (infrarød Dodt kontrast eller to foton gradient kontrast billede).
- Overvåg pipette modstand med en test puls (f.eks -10 mV, 20 ms) i spænding clamp mode. Når berøre vævet korrigere offset potentiale.
- Approach cellen og forsigtigt skubbe pipettespidsen i det, indtil en "forsænkning" kan ses tydeligt. Slip straks trykket af pipetten, anvende 40-60 mbar undertryk og skifte membranpotentialet til -65 mV.
- Når holdestrømmen når værdier under 100 Pa, slippes undertrykket.
- Efter etablering af en giga tætning (modstand> 1 GQ), sprænges membranen med en kort, stærk sugning til pipetten eller korte overkompensation af kapacitans kompensation kredsløbet.
- Afhængig af, hvilken tilstand (spænding eller strøm clamp) er påkrævetfor den eksperimentelle design, kompenserer korrekt.
- Begynd at bringe iontoforetiske pipette i sin endelige stilling. Hvis en mere detaljeret beskrivelse af, hvordan man kunne udføre patch clamp optagelser er nødvendig, er der flere gode retningslinjer til rådighed 18,19.
6.. Placer Iontoforetisk pipetten og generere en Postsynaptisk Iontoforetisk Potential
- I almindelighed, kan iontoforetiske begivenheder kan fremkaldes ved bestemte steder afhængigt af den ønskede eksperiment, for eksempel ved en spiny dendritceller til glutamat mikro-iontoforese på dendritiske akslen, soma eller Axon indledende segment for GABA mikro-iontoforese.
- Approach cellen op til ca 1 um afstand uden at røre den. Efter at have nået positionen af interesse, det er afgørende, at der ikke neurotransmitter siver ud, og at pipetten kapacitans er kompenseret korrekt.
- Hvis nærmer cellen med en glutamat fyldt iontoforetisk pipette forårsager påviselig depolarisering af membranpotentialet, juster bevarer strøm hvis det er muligt, eller skifte pipette.
- Anvend korte negative strømimpulser, startende fra nul og øge den nuværende systematisk (fx 0,1-0,4 msek, 0,01-1 uA pulser). Dette hjælper med at finde ud af i hvilken rækkevidde den iontoforetiske strøm fremkalder de ønskede svar i den konkrete eksperimentelle set-up.
- Hvis der ikke er nogen reaktion påviselig, løft pipetten adskillige hundrede mikrometer og anvende en stærk eject strøm (> 0,1 uA) til at rense spidsen. Juster kapacitans kompensation nærme cellen, og prøv igen.
- Hvis der stadig ingen reaktion, reducere bevarer strøm. Vær meget forsigtig med dial-indstillingerne, da denne procedure kan forårsage ukontrolleret neurotransmitter release. Derfor konstant overvåger optagelsen til at opdage de respektive ændringer i membranpotentialet.
- Hvis det er vanskeligt at påvise GABAerge begivenheder, kan det være nyttigt at anvende enn intern opløsning sammensætning giver i en høj Cl - drivkraft. For at opnå dette, reducere Cl - koncentrationen i pipetten opløsning (se protokol afsnit 2.6.). Dette vil resultere i større GABAerge begivenheder på hvilende membranpotentiale som følge af en højere drivkraft.
- Alternativt injiceres lange aktuelle trin resulterer i membranpotentialet chancer fra -100 mV til -48 mV (fig. 8C). Med denne protokol Cl - drivkraft øges ved hyperpolariseret potentialer forårsager en depolariserende GABA respons.
- Det er også muligt at bruge trin strøminjektion protokol til at bestemme tilbageførsel potentiale fremkaldte begivenheder, som hjælper til at bestemme GABAergic karakteren af de begivenheder. Lækage af GABA er sværere at opdage end lækage af glutamat. I dette tilfælde kan en konstant overvågning af input modstand hjælpe, når GABA fyldte pipette er kontaktet. Hvis input modstanden falder, bevarer strøm kan be øget eller en anden pipette anvendes.
- Som kontrolforsøg for glutamat iontophoresis, foreslår vi en Ca 2 + billeddannelse eksperiment, ved hjælp af 200 uM OGB-1 og ingen EGTA i pipette løsning til at visualisere lokal calciumindløb der kan være forårsaget af utæt glutamat.
- Generelt er det at opnå et stabilt respons er meget vigtigt at have en mekanisk stabil pipette til at undgå drift over tid. Drift kan være forårsaget af temperaturændringer, hvorfor det anbefales at tænde for udstyret mindst en halv time før målingerne for at undgå termisk drift. Vær sikker på at bruge god spatronforseglinger i pipetteholder og spidsen er virkelig fast. Selve holderen kan desuden fastgøres med Teflon tape, desuden være sikker på at der ikke er spænding på kablerne fra hovedtrin eller manipulator, som også er en potentiel kilde til afdrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En simpel metode til at bestemme den rumlige spredning af iontoforese er at trække den iontoforetiske pipetten trinvis fra dendritceller, samtidig med at den udstødte glutamat konstant. Vi fandt, at den rumlige udstrækning af en mikro-iontoforetisk stimulering havde en diameter på cirka 12 um (Figur 1 viser radius). Hvor dybt i vævet på iontophoresis kan bruges, afhænger af stivheden af pipette. Men iontoforetiske pipetter er nødvendige for eksperimenter i skiver (figur 2), som anvendes her, er ikke begrænsende indtrængningsdybde. Snarere det optiske system og den faldende opløsning i dybden af hjernen skive er den begrænsende faktor. For en god kvalitet optagelse er det afgørende, at ingen sender siver ud af pipetten. I tilfælde af glutamat, kan en lækage identificeres, hvis der er en pludselig depolarisering når dendritceller er nærmede med pipettespidsen eller hvis baseline pludselig bliverustabil (Figur 5). Efter etablering af en stabil optagelse, er det muligt at fremkalde EPSP'er af definerede amplituder, dendritiske pigge eller action potentialer med denne teknik på hvilket som helst sted i hele dendritiske træet (figur 6). Ved at anvende glutamat med hurtig mikro-iontoforese, samtidig egenskaber EPSP'er, deres formering og summation, på forskellige selv fjerntliggende steder, kan undersøges (figur 7). GABAerge begivenheder kan fremkaldes alene eller som supplement til glutamat med en anden pipette ved at fylde den iontoforetiske pipette med en stærkt koncentreret GABA opløsning (se: Protokol afsnit 2) og en positiv eject strøm. Der er en simpel protokol for at bekræfte GABAergic karakteren af de begivenheder og gøre GABAergic begivenheder lettere at opdage, hvis du ikke bruger en høj drivkraft intern løsning: Sprøjt negative strømme (ca. 1 sek amplituden afhænger input modstand celle) resulterer i hyperpolarising voltage trin, der starter ved omkring -100 mV og derefter stige i 5 mV trin (figur 8). Ved meget negative potentialer GABAergic begivenheder er lettere at påvise, på grund af den højere drivkraft. Og hvis signalerne omvendt omkring den beregnede Cl - reversible potentiale for løsninger, er det meget sandsynligt, at de er GABAerg i naturen (figur 8). Med en ekstra GABA mikro-iontoforetiske pipette, er det muligt at undersøge, for eksempel, effekten af GABAerg hæmning på glutamaterge begivenheder, ligesom dendritiske natrium / calcium-pigge, ved at variere den relative timing af dendritiske spike og IPSP (figur 9), den relative placering af begge begivenheder eller deres amplituder. (Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for Animal Care og brug Udvalg universitetet i Bonn, den tyske Center for neurodegenerative sygdomme, og staten Nordrhein-Westfalen.)
Figur 1. Rumlige udstrækning iontoforetisk skubbet glutamat bestemt af pipette tilbagetrækning. A) Maksimal projektion af et to-foton billede af en CA1 pyramideformet celle dendritceller fyldt med 100 uM Alexa 594 og den iontoforetiske pipetten i udgangsstillingen (skala bar 8 um). Mellemværker viser tilbagetrækning af den iontoforetiske pipette og den tilsvarende iontoforetiske EPSP registreres i soma. Pilen angiver placeringen af den iontoforetiske pipettespids. B) Afstand afhængighed af EPSP amplituder forhold til den oprindelige position af iontoforetiske pipettespidsen (≤ 1 um væk fra dendritceller, n = 6 filialer). Med denne kunne vi estimere radius af glutamat spredes ved systematisk at trække pipette. Nedfældning viser repræsentativt eksempel spor. Fejlsøjler repræsenterermiddelværdi ± SEM. (Tilpasset fra Müller et al. 2012 9 personer, genoptrykt med tilladelse fra Elsevier).
Figur 2. Hvordan en iontoforetisk pipette skal se ud. A) Infrarød CCD billede af en iontoforetisk pipette i forhold til en lille 5,5 MOhm patch pipette ved hjælp af en 60X målsætning. B) Iontoforetisk pipette med skala ved hjælp af en 60X målsætning. Kalibrering: mindste = 10 um.
Figur 3. Kapacitans kompensation for det iontoforetiske pipette med build i test-puls (10 nA, 10 msek, NPI elektroniske, Tamm,Tyskland). Det er vigtigt at kompensere kapacitans korrekt at overvåge højre pipette modstand og for at sikre hurtig og præcis neurotransmitter ansøgning.
Figur 4.. Principper for mikro-iontophorese. A) Skematisk tegning af en CA1 pyramideformede neuron i hele celle patch-clamp konfiguration og en iontoforetisk pipette fyldt med glutamat. Glutamat er negativt ladet, derfor en positiv strøm anvendes på pipetten vil holde det lække ud af pipetten: Den bevarer nuværende er positiv (venstre panel). For at skubbe glutamat fra pipetten, anvende en negativ strøm (højre panel). På denne måde glutamat er tvunget ud af pipette og kan vække excitatory begivenheder i den postsynaptiske celle. B) Skematisk tegning af CA1 pyramideformet neuron i hele celle patch-clamp konfiguration og en iontoforetisk pipette fyldt med GABA. GABA er positivt ladet ved en lav pH-værdi. Derfor vil en negativ strøm holde det lække ud af pipetten (venstre panel). Du skubber GABA anvende en positiv strøm (højre panel). På denne måde GABA kommer ud af pipetten, og kan fremkalde inhibitoriske begivenheder i den postsynaptiske celle.
Figur 5. Gode og dårlige iontoforetiske pipetter. A) repræsentativt eksempel på en iontoforetisk glutamaterg EPSP genereres på en dendritiske filial af et CA1 pyramideformet neuron. B) repræsentativt eksempel på en iontoforetisk dendritiske spike genereret en dendritiske filial i CA1-området af hippocampus med fortsat mild glutamat lækage fra pipettespidsen.
Figur 6.. Repræsentative resultater for single glutamat mikro-iontophorese. A) Skematisk tegning af en patched CA1 pyramidal neuron og en iontoforetisk pipette fyldt med glutamat. B) EPSP fremkaldt i en CA1 pyramideformet neuron med glutamat iontoforese. C) Dendritiske Na + / Ca2 + spike fremkaldt på en proximal dendritceller af en CA1 pyramidal neuron, lavere spor viser hældningen af spændingen spor, peak angiver den maksimale hældning af den dendritiske spids. D) Ved at hæve det aktuelle påføres iontoforetiske amplituden af EPSP stiger indtil den krydser aktionspotentialet tærskel.
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/>
Figur 7. Repræsentative resultater for dobbelt glutamat mikro-iontophoresis på forskellige steder på dendritiske træ. A) Skematisk tegning af en patched CA1 pyramidal neuron og to iontoforetiske pipetter fyldt med glutamat, som er anbragt på en proximal og en distal dendritceller, hhv. B) iontoforetisk EPSP fremkaldt på en proximal dendritceller af en CA1 pyramidal neuron (1). C) Iontoforetisk EPSP fremkaldt ved en distal dendritceller (2).
Figur 8. Repræsentative resultater for GABA mikro-iontophorese. A) Skematisk tegning af en lappet CA1 pyramideformet neuron og en iontoforetisk pipette fyldt med GABA.B) Iontoforetisk IPSP fremkaldt på en proximal dendritceller af en CA1 pyramideformede neuron. C) Lang strøm injektion af systematisk at ændre amplituder til en CA1 pyramideformet neuron via patch-pipetten, at bestemme reversible potentiale af den fremkaldte hændelse (løbende injektioner fra -400 pA til 0 pA). Artefakt angiver tid-punkt af GABA iontoforese. Den fremkaldte begivenhed viser en reversible potentiale på ca -70 mV (pil).
Figur 9. Repræsentative resultater af samtidige glutamat og GABA iontoforese til at undersøge integration af hæmning og excitation. A) Skematisk tegning af en patched pyramideformet neuron og en pipette fyldt med glutamat (grøn) og med GABA (orange). B) iontophoretisk fremkaldtedendritiske pigge alene i de efterfølgende sweeps, viser lavere spor dV / dt, toppe indikerer dendritiske pigge. C) iontoforetisk fremkaldt IPSP alene. D) Både glutamaterge og GABAerg begivenheder sammen.
| Placering specificitet | Transmitter specificitet | Toksicitet / bivirkninger | Præsynaptiske stimulering | Langsigtet eksperiment | Omkostninger / kompleksitet | |
| Mikro-iontoforese | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-foton uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Synaptic stimulation | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabel 1. . Sammenligning af forskellige teknikker Fordele og ulemper ved teknikker til at stimulere neuroner efter forskellige kriterier (- = dårlig, + = ikke optimal, + + = god, + + + = bedst).
| Patch pipetter | Iontoforetiske pipetter | |||
| Pre-trækker P (A) Single pull | Sidste Pull P (B) | Pre-trækker P (A) Single Pull | Sidste Pull P (B) | |
| Heat H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Kraft Pre Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Afstand Threshold s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Delay VARMESTO t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Afstand VARMESTO s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Forsinkelse F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Tving Træk 1 F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Afstand Pull 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Tving Pull 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Justér (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabel 2. Eksemplarisk puller protokol. For en vandret aftrækker (DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland), ved hjælp af GB150F-8P fibre (Science Products, Hofheim, Tyskland) for både patch og iontoforetiske pipetter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her forklarer vi, hvordan man anvender hurtige mikro-iontophoresis af neurotransmittere til at undersøge synaptisk integration på dendritter. Denne teknik er med succes blevet anvendt til at undersøge glutamaterge og GABAerg synaptisk transmission i forskellige hjerneområder in vitro og in vivo 9,20-22. Micro-iontophorese har været anvendt i mere end 60 år, men i de tidlige år var det meste bruges til enten lokalt anvende neurotransmittere og narkotika på langsomme eller mellemliggende tidsskalaer 23 eller for mikroinjektion af stoffer i celler 24.
Mikro-iontoforese blev et særligt interessant værktøj til at studere dendritiske integration siden indførelsen af forstærkere, som er udstyret med en hurtig kapacitans kompensation for høj resistens elektroder 10,11. Med denne forbedring blev det muligt at anvende korte rektangulære iontoforetiske strømme resulterer i postsynaptiske responser, der Resembled mere realistisk tidsforløbet af synaptiske begivenheder 10,25.
Hvad er de tekniske krav og problemer med at beskæftige sig med, når de om mikro-iontophorese? En iontoforetisk forstærker, der giver mulighed for godtgørelse af den høje kapacitans af de fine iontoforetiske pipetter. Den korrekte indstilling af kapaciteten kompensation er meget vigtigt, hvis højhastigheds drift i forbindelse med stor modstandsdygtighed mikroelektroder kræves. Ukompenserede omstrejfende kapacitanser debiteres fra den iontoforetiske strøm, der leveres af instrumentet, og derfor forsinker anvendelse. Kompensere kapacitans korrekt er afgørende, og forklaret i detaljer i videoen. Desuden er det afgørende, at det optiske system giver et godt fluorescerende billede af dendritceller og den iontoforetiske pipetten uden at inducere foto-beskadigelse af vævet. Optimalt skal du bruge en to-foton-system og reducere laser magt og dvæle gange så meget som forenelig meden anstændig billedkvalitet. Hvis en mere konventionel lyskilde, sørge for at reducere eksponeringstiden så meget som muligt, for eksempel ved hjælp af mekaniske skodder eller elektrisk udløsning. Sandsynligvis den mest kritiske punkt er pipetten design, som vil give mulighed for en defineret og konkret anvendelse af den anvendte neurotransmitter. Dette trin kræver en vis indsats og tid til at finde de optimale indstillinger. Her præsenteres protokoller for glutamat og GABA iontoforese, hvis andre neurotransmittere blokkere, eller modulatorer er brugt, er det nødvendigt, at stoffet er stærkt koncentreret, og endnu vigtigere, at det er opladet. For eksempel, da GABA har en nettoladning på nul ved en pH-værdi på 0 pH skal justeres (se protokol afsnit 2), hvilket resulterer i en positiv nettoladning.
Når mikro-iontophoresis er etableret, vil det give en udvidet værktøjssæt til at studere synaptiske integration i neuroner. Det gør det muligt at stimulere synapser af interesse selektivt meden særlig neurotransmitter. Ved hjælp af en udvalgt neurotransmitter på definerede steder, postsynaptiske strømme og potentialer, og deres udbredelse kan undersøges. Endvidere er det muligt at bruge flere iontophoreseelektroderne samtidigt at undersøge integration af flere glutamaterge indgange eller systematisk ændre den relative timing eller styrken af begivenheder.
Nogle generelle kritiske punkter skal tages i betragtning, når du bruger mikro-iontophoresis. Profilen af neurotransmitter koncentrationen efter mikro-iontoforese er forskellig fra endogen udgivelse. Murnick m.fl. 10 rapporterede, at hastigheden af frigivelse fra iontophoresis spids (ca. 1 msec) sandsynligvis være betydeligt langsommere end synaptisk frigivelse fra vesikler, der foregår i brøkdele af et millisekund (0,2 ms) 26.. Desuden er diffusion til og fra den synaptiske kløft sandsynligvis aftagende koncentration stiger og henfald af iontoforetisk anvendte neurotransmittere.Desuden er mængden af udstødes neurotransmitter sandsynligvis være højere end fysiologisk udgivet mængder, dog med høj resistens elektroder, single glutamaterge og GABAergic postsynapses kunne aktiveres ved hjælp af mikro-iontophoresis 10-12. En rumlig selektivitet i området nogle få mikrometer er også for nylig blevet opnået ved to-foton uncaging af neurotransmittere 3,4,27.
Mens betydeligt mere omkostningskrævende, har to-foton uncaging flere fordele i forhold mikro-iontophorese. Navnlig det kan bruges til at frigive neurotransmitter samtidigt på flere synaptiske steder og ikke kræver præcis positionering af en fin elektrode spids. Men det har også nogle alvorlige ulemper, der skal overvejes, når der vælges en fremgangsmåde til en bestemt eksperiment. Mange bur forbindelser har uønskede bivirkninger såsom blokaden af neurotransmitterreceptorer 28. For eksempel glutamat mange og GABA bureer blevet rapporteret at forstyrre GABAerg hæmning. Ligeledes kan den relativt høje lasereffekt kræves for to-foton uncaging resultere i foto-beskadigelse af postsynaptiske neuron, især når stimulation anvendes gentagne gange over adskillige minutter. Endvidere mens mikro-iontoforese er begrænset i antallet af stimulerede sites, kan disse steder vælges frit på hele dendritiske træ af en neuron, for eksempel på distale og basale dendritter, at simulere lagdelte synaptisk input fra forskellige hjerneområder. To-foton uncaging, som for øjeblikket anvendes af de fleste grupper, vil være begrænset til synaptiske steder i et bestemt brændplan og i synsfeltet, som afhænger af formålet anvendes (typisk 40X eller 60X nedsænkning i vand). Det skal tages i betragtning, at begge teknikker altid føre til aktivering af ekstrasynaptiske receptorer, hvilket kan gøre fortolkningen af resultaterne vanskeligere.
En anden ulempe ved mikro-iontoforese er, at only den postsynapse kan aktiveres. Hvis præsynaptiske funktion og rolle vesikel-frigivet neurotransmitter skal fastsættes i den eksperimentelle fokus kan lokale el synaptisk stimulation være en metode til valg. Men ulemperne ved elektrisk synaptisk stimulering sammenlignet med mikro-iontoforese er den ukendte placering af de aktiverede synapser og co-aktivering af axoner fra forskellige neuronale populationer, potentielt tilhører andre neurotransmitter-systemer (tabel 1).
Sammenfattende er den vigtigste fordel ved mikro-iontophoresis er efter vores opfattelse, at det er muligt at anvende flere forskellige neurotransmittere og undersøge deres samspil om neuronale rum såsom dendritter 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann og Walker Jackson for omhyggeligt at læse manuskriptet. Forfatterne har modtaget støtte, der blev leveret af Ministeriet for forskning MIWF af statens Nordrhein-Westfalen (SR), Den BMBF-Projekträger DLR US-tyske samarbejde i beregningsmæssige neurovidenskab (CRCNS, SR), Centers of Excellence i neurodegenerative sygdomme (COEN; SR), og universitetet i Bonn intramuralt finansieringsprogram (BONFOR, SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
