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Neuroscience

ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण

Published: July 31, 2013 doi: 10.3791/50701
Automatic Translation
1,2, 1,2
1NRW Research Group 'Dendritic integration in the CNS', Department of Epileptology, University of Bonn, 2Neuronal Networks Group, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE)

Summary

इस लेख में हम उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ पोस्टअन्तर्ग्रथनी संकेतों के एकीकरण की जांच के लिए एक तकनीक के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर के तेज सूक्ष्म योणोगिनेसिस परिचय.

Abstract

तंत्रिका विज्ञान में मौलिक हितों की एक अंततः अक्षतंतु पर कार्रवाई क्षमता के neuronal उत्पादन की ओर जाता है जो वृक्ष के समान पेड़ के बहुत जटिल संरचना के साथ उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों के एकीकरण को समझने की है. न्यूरोनल उत्पादन पर विशिष्ट synaptic इनपुट के विविध स्थानिक और लौकिक मापदंडों के प्रभाव के वृक्ष के समान आदानों की दूरी पर निर्भर क्षीणन, स्थानिक अलग आदानों के स्थान पर निर्भर बातचीत, उत्तेजक एकीकरण, रेखीय पर GABAergig निषेध के प्रभाव जैसे, जांच के अंतर्गत वर्तमान में है और गैर रेखीय एकीकरण मोड, और बहुत ज्यादा है.

ग्लूटामेट और गाबा की तेज सूक्ष्म योणोगिनेसिस के साथ यह ठीक glutamatergic उत्तेजना और GABAergic निषेध के स्थानिक और लौकिक एकीकरण की जांच के लिए संभव है. क्रिटिकल तकनीकी आवश्यकताओं या तो एक ट्रिगर फ्लोरोसेंट लैंप, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), या एक दो फोटोन एससीए हैंऊतक के महत्वपूर्ण तस्वीर क्षति शुरू करने के बिना वृक्ष के समान शाखाओं कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप nning. इसके अलावा, यह उच्च प्रतिरोध pipettes के तेज समाई मुआवजे के लिए अनुमति देता है कि एक सूक्ष्म योणोगिनेसिस एम्पलीफायर होना बहुत जरूरी है. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु नहीं ट्रांसमीटर अनायास प्रयोग के दौरान पिपेट द्वारा जारी किया जाता है.

एक बार स्थापित, इस तकनीक का एक उच्च न्यूरोट्रांसमीटर और स्थान विशिष्टता के साथ विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत दे देंगे. ग्लूटामेट और GABA uncaging के मुकाबले तेजी से योणोगिनेसिस देखने के क्षेत्र के लिए सीमा के बिना एक ही समय में लेकिन बहुत दूर के स्थानों पर दोनों ट्रांसमीटर का उपयोग करने की अनुमति देता है. वहाँ axons की फोकल बिजली की उत्तेजना की तुलना में फायदे भी हैं: सूक्ष्म योणोगिनेसिस साथ इनपुट साइट का स्थान निश्चित रूप से जाना जाता है और यह केवल ब्याज की न्यूरोट्रांसमीटर जारी की है कि यकीन है. हालांकि यह उस के साथ सूक्ष्म योणोगिनेसिस ही विचार किया जाना हैpostsynapse सक्रिय है और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के प्रीसानेप्टिक पहलुओं का समाधान नहीं कर रहे हैं. इस अनुच्छेद में हम मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों में सूक्ष्म योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स उनके पतले और डालियां फैला वृक्ष के समान प्रक्रियाओं 1 पर अन्तर्ग्रथनी आदानों की एक किस्म प्राप्त करते हैं. वहाँ, उत्तेजक वृक्ष के समान आदानों की बहुमत glutamatergic synapses द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. इन synapses के उत्तेजक postsynaptic क्षमता (EPSPs) के postsynaptic रेखीय एकीकरण, जिसके परिणामस्वरूप एक spatially वितरित तरह से सक्रिय किया जा सकता है. Synapses के एक साथ और dendrite पर स्थानिक निकटता में सक्रिय कर रहे हैं, तो इन उत्तेजक आदानों सुप्रा रैखिक एकीकृत और वृक्ष के समान स्पाइक्स को 2-5 उत्पन्न किया जा सकता है.

इसके अलावा, उत्तेजक आदानों के एकीकरण के वृक्ष के समान पेड़ पर इनपुट के स्थान पर निर्भर करता है. बाहर का गुच्छा क्षेत्र में आने का संकेत है कि बहुत अधिक तनु केबल छानने 6 के कारण समीपस्थ आदानों की तुलना कर रहे हैं. हिप्पोकैम्पस में, शिखर गुच्छा डेन्ड्राइट को दूर आदानों समीपस्थ dendri पर उन लोगों की तुलना में एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र द्वारा उत्पन्न कर रहे हैंtes 7. एक रोमांचक सवाल इसलिए है, कैसे synaptic इनपुट अलग वृक्ष के समान डिब्बों से संसाधित और वृक्ष के समान एकीकरण अलग अलग तरीकों से neuronal फायरिंग पर इन स्तरों पर होती आदानों के प्रभाव को नियंत्रित करता है. है

कार्यात्मक संपत्तियों, डेन्ड्राइट का रूपात्मक सुविधाओं इतना ही नहीं, आदानों के स्थान और क्लस्टरिंग महत्वपूर्ण glutamatergic synapses 8,9 की प्रभावकारिता निर्धारित भी उत्तेजक आदानों, GABAergic टर्मिनलों से अतिरिक्त निरोधात्मक आदानों के वृक्ष के समान एकीकरण प्रभावित कर रहे हैं. अन्तर्ग्रथनी एकीकरण के इन विभिन्न पहलुओं आदर्श वृक्ष के समान डोमेन के लिए अलग न्यूरोट्रांसमीटर के स्थानिक परिभाषित आवेदन की अनुमति देता है जो न्यूरोट्रांसमीटर सूक्ष्म योणोगिनेसिस, का उपयोग कर जांच की जा सकती है. हम सफलतापूर्वक न्यूरॉन्स में संकेत एकीकरण की जांच के लिए ग्लूटामेट और गाबा की सूक्ष्म योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे यहाँ प्रदर्शित करता है.

इस आवेदन, ठीक इत्तला दे दी के लिएकेंद्रित न्यूरोट्रांसमीटर समाधान के साथ भरा उच्च प्रतिरोध pipettes का उपयोग किया जाता है. ये pipettes न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स स्थित हैं जहां सेल, की बाहरी झिल्ली के करीब तैनात हैं. वृक्ष के समान शाखाओं का एक अच्छा दृश्य के लिए आवश्यक है. यह सबसे अच्छा पैच विंदुक के माध्यम से पेश कर रहे हैं जो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर हासिल की है. फिर एक बहुत ही कम (<1 मिसे) वर्तमान नाड़ी (10 की रेंज में - 100 एनए) का आरोप लगाया न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं बेदखल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन कम दालों और प्रभावी समाई मुआवजा के साथ, postsynaptic क्षमता या धाराओं उत्तेजक इनपुट का स्थान ठीक से जाना जाता है जिसका अर्थ है उच्च अस्थायी और स्थानिक परिशुद्धता के साथ पैदा किया जा सकता है. ग्लूटामेट सूक्ष्म योणोगिनेसिस (चित्रा 1 9) जैसा कि यहाँ दिखाया 6 माइक्रोन से छोटी है, जो एक परिभाषित त्रिज्या में synapses सक्रिय कर सकते हैं, लेकिन यह एक अन्तर्ग्रथन संकल्प 10-12 तक पहुंचने के लिए भी संभव है.

हेन, एम, एट अल 13 के दो photon uncaging के साथ प्राप्त स्थान आकार से छोटी है, जो 0.5 माइक्रोन से नीचे आकार, हाजिर करने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि पता चला है. तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस के साथ यह दो या अधिक iontophoretic pipettes का उपयोग करें और वृक्ष के समान पेड़ पर अलग है, यहां तक ​​कि दूर के स्थानों पर उन्हें जगह आसानी से संभव है. इस तरह, अलग रास्ते से उन सहित उत्तेजक घटनाओं, के एकीकरण की जांच की जा सकती है. यह एक ही समय में एक ग्लूटामेट और एक गाबा भरे iontophoretic पिपेट का उपयोग करने के लिए भी संभव है. इस तरह उत्तेजक इनपुट (पर पथ, ऑफ पथ अवरोध) के सापेक्ष विभिन्न स्थानों पर GABAergic निषेध के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, विशिष्ट neuronal डोमेन को लक्षित interneurons द्वारा अवरोध का प्रभाव, बाहर का डेन्ड्राइट तरह, सोमा या axons 14, गाबा योणोगिनेसिस का उपयोग कर जांच की जा सकती है. सभ्य न्यूरॉन्स में, तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस inve करने का अवसर प्रदान करता हैबहुत अधिक विस्तार 10,11 में न्यूरॉन्स में एक synapse के वितरण और synaptic संचार के प्राथमिक पहलुओं stigate.

इस लेख में हम इनपुट स्थान, इनपुट ताकत है, और समय, अकेले या परस्पर क्रिया में की निर्भरता में उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की synaptic एकीकरण की जांच की अनुमति देता है जो तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में उपयोग के लिए ग्लूटामेट और GABA योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे विस्तार में प्रदर्शित करता है. हम फायदे और सीमाएं इस तकनीक का और कैसे सफलतापूर्वक निवारण करने के लिए बात करेंगे.

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Protocol

1. सिस्टम आवश्यकताएँ

  1. माइक्रोस्कोप प्रणाली: डेन्ड्राइट का अच्छा दृश्य महत्वपूर्ण है. उपलब्ध हैं, एक दो photon लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग करें. नीलम ultrafast-स्पंदित लेजर (गिरगिट अल्ट्रा द्वितीय, सुसंगत) और एक उच्च एनए उद्देश्य: हमारे प्रयोगों में हम एक तिवारी के साथ सुसज्जित एक ट्रिम स्कोप द्वितीय, LaVision बायोटेक, Bielefeld, जर्मनी या एक चरम सीमा का चतुर्थ प्रणाली, प्रेयरी टेक्नोलॉजीज, मिडलटन, विस्कॉन्सिन में इस्तेमाल किया (60X, 0.9 एनए, ओलिंप) हम पैच विंदुक के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट डाई से भरा था जो डेन्ड्राइट कल्पना करने के लिए. तस्वीर क्षति 2 फोटॉन स्कैनिंग का उपयोग कर कम गंभीर माना जाता है, लेजर शक्ति को कम (ऊतक में नीचे 8 मेगावाट) और बार ध्यान केन्द्रित करना (नीचे 1 μsec) या जितना संभव हो सके.
  2. एक दूसरी संभावना जितना संभव समय जोखिम को कम करने के लिए अधिग्रहण के साथ तुल्यकालित एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत (एलईडी या एक फ्लोरोसेंट लैंप) को गति प्रदान करने के लिए है. हम एक एकीकृत प्रकाश स्रोत (TILLPho साथ एक monochromator का इस्तेमाल किया हैDodt विपरीत अवरक्त रोशनी (TILLPhotonics, Gräfelfing, जर्मनी) के साथ सुसज्जित किया गया था, जो एक Zeiss Axioskop 2 एफएस ईमानदार माइक्रोस्कोप पर टॉनिक, Gräfelfing, जर्मनी). हमारे प्रयोगों में जोखिम बार मिसे आमतौर पर 10 से अधिकतम करने के लिए बताया गया. 30 मिसे.
  3. एक दो चैनल सूक्ष्म योणोगिनेसिस प्रणाली जैसे MVCS सी -02 (NPI इलेक्ट्रॉनिक, Tamm, जर्मनी) तेजी से समाई मुआवजे के साथ., एक तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस एम्पलीफायर का उपयोग करें ठीक इत्तला दे दी योणोगिनेसिस microelectrodes 25 का प्रतिरोध है - MΩ 100 (महत्वपूर्ण टिप आकार और विंदुक आकार पर निर्भर करता है), और iontophoretic एम्पलीफायर की समाई मुआवजा बेहतर देखते है तो तेजी से वृद्धि बार ही प्राप्त किया जा सकता है. इस तेजी से मुआवजा iontophoretic पिपेट को उप millisecond रेंज में एक संक्षिप्त और तेजी से शुरू होने के साथ वर्तमान दालों लागू करने के लिए और इस तरह 1 माइक्रोन 13 नीचे स्थान आकार में उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ट्रांसमीटर बेदखल करने के लिए आवश्यक है. योणोगिनेसिस एम्पलीफायरों अल रहे हैंहम हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण नहीं किया है, जो कई अन्य कंपनियों से तो उपलब्ध. इन उपकरणों समाई मुआवजा circuitry के साथ सुसज्जित नहीं हमारे ज्ञान करने के लिए कर रहे हैं.

2. समाधान तैयार करें

  1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) और यह प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक है के रूप में आंतरिक समाधान तैयार है. आवश्यकता है जो आंतरिक समाधान, के लिए केवल इसके ऑप्टिकल उपकरण के आधार पर एक लाल या हरी फ्लोरोसेंट डाई (जैसे 50 से 200 माइक्रोन एलेक्सा Fluor 488 या 594 hydrazide, Invitrogen), है. और सामान्य ACSF के लिए, 60, NaCl 100 सूक्रोज, 2.5 KCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO, 1 2 CaCl, 5 2 MgCl, 20 ग्लूकोज: मिमी में विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो ACSF सूक्रोज, के लिए यहाँ एक उदाहरण मिमी में पैच दबाना प्रयोगों के लिए समाधान: 125 NaCl, 3 KCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO, 2.6 2 CaCl, 1.3 2 MgCl, 15 ग्लूकोज.
  2. सभी कोशिकी समाधान लगातार (95% 2 हे, 5% सीओ 2) Carbogenize.
  3. मिमी में, उदाहरण के लिए, आंतरिक समाधान तैयार: 140 कश्मीर gluconate, 7 KCl, 5 HEPES एसिड, 0.5 2 MgCl, 5 phosphocreatine, 0.16 EGTA, 50 के साथ - 200 माइक्रोन एलेक्सा 488.
  4. ग्लूटामेट लिए सूक्ष्म योणोगिनेसिस 150 मिमी glutamic एसिड के साथ एक समाधान तैयार करने और NaOH के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें. 50 -200 माइक्रोन एलेक्सा Fluor 488 या दृश्य के लिए 594 hydrazide (Invitrogen) जोड़ें.
  5. गाबा की योणोगिनेसिस एक 1 एम गाबा समाधान के लिए तैयार है और एचसीएल 15 के साथ 5 पीएच को समायोजित करने के लिए. इस पीएच गाबा का आरोप लगाया है पर, उसके बाद ही यह योणोगिनेसिस का उपयोग कर लागू किया जा सकता है. समाधान में कम पीएच गाबा संचरण ही 16,17 प्रभाव हो सकता है बाह्य अंतरिक्ष के लिए निकली कि कृपया ध्यान दें.
    प्रकाश से गाबा समाधान को सुरक्षित रखें और पुराने समाधान अपने प्रभाव को कम कर सकते हैं, क्योंकि अक्सर ताजा गाबा शेयर समाधान तैयार करते हैं.
  6. यह GABAergic घटनाओं, एक उच्च देखने के लिए मुश्किल हैजीएच सीएल - ड्राइविंग बल आंतरिक समाधान, KCl के बाहर छोड़ कर उदाहरण के लिए, गाबा योणोगिनेसिस काम कर रहा है देखने के लिए अगर GABAergic घटनाओं कल्पना करने के लिए मदद कर सकता है, लेकिन एक मनोवैज्ञानिक प्रेरणा शक्ति की सिफारिश की जा सकती है अन्तर्ग्रथनी एकीकरण की जांच करने के लिए. छोटे GABAergic घटनाओं की सामान्य पता लगाने के लिए, चित्रा 8C में दिखाया गया है एक प्रोटोकॉल में मदद कर सकते हैं.

3. योणोगिनेसिस pipettes खींचो और टेस्ट

  1. सामान्य तौर पर, सही pipettes खींच शायद नियंत्रित न्यूरोट्रांसमीटर योणोगिनेसिस प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है. सेल संस्कृति में योणोगिनेसिस का उपयोग कर, यह 10 तेज microelectrodes के लिए इसी तरह की बहुत ठीक इलेक्ट्रोड खींचने के लिए संभव है. वे एक कोण के साथ ऊतकों में कम कर रहे हैं जब तीव्र स्लाइस में पैच दबाना प्रयोगों में, हालांकि, ये बहुत पतली pipettes यह असंभव गहरी डेन्ड्राइट तक पहुंचने के लिए कर रही है, टुकड़ा सतह पर मोड़.
  2. इसलिए, इसलिए, एक बहुत छोटे टिप के साथ एक विंदुक खींच कि कोई neurotransmitter बाहर लीक कर सकते हैं, लेकिन टिप अभी भी ऊतक (चित्रा 2) में प्रवेश के लिए काफी कठोर हो गया है. या एक पी 97 डांड़ी, Sutter साधन कंपनी, उदाहरण के लिए, 150 जीबी एफ 8P वर्ग pipettes (विज्ञान उत्पाद, Hofheim, जर्मनी) और एक क्षैतिज खींचने (उदाहरण के लिए एक DMZ-यूनिवर्सल डांड़ी, जीट्ज़ उपकरण जीएमबीएच, Martinsried, जर्मनी का उपयोग , एक खड़ी कोण (चित्रा 2 और 2 तालिका) के साथ एक छोटी सी शुरुआत है, लेकिन यह भी एक छोटी टेपार प्राप्त करने के लिए कई खींच कदम के साथ Novato, सीए).
  3. यह iontophoretic pipettes 10 खींचने के लिए क्वार्ट्ज गिलास pipettes उपयोग करने के लिए भी संभव है. ये बेहतर यांत्रिक गुणों के लिए और अधिक विश्वसनीय होना चाहिए रहे हैं, लेकिन विशेष लेजर खींचने के लिए आवश्यक हैं. लेकिन यह आमतौर पर पैच pipettes खींचने के लिए उपयोग किया जाता है जो सामान्य कांच pipettes, साथ अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए भी संभव है.
  4. पहली बार के लिए उन्हें प्रयोग करने से पहले, ऊतक के बिना एक कक्ष में पिपेट प्रदर्शन और विरोध टेस्टसमय, ग्लूटामेट के रिसाव के बाद से ऊतकों को नुकसान पहुँचा सकता है.
  5. सही ढंग से योणोगिनेसिस एम्पलीफायर सेट करें. तब न्यूरोट्रांसमीटर और डाई युक्त समाधान के साथ विंदुक भरने और स्नान (ACSF) में जगह.
  6. समाई (चित्रा 3) क्षतिपूर्ति. आमतौर पर बहुत तेज pipettes कुंद लोगों की तुलना में एक उच्च समाई होगा.
  7. पिपेट का प्रतिरोध की जाँच: यहां इस्तेमाल सूक्ष्म योणोगिनेसिस एम्पलीफायर पिपेट प्रतिरोध को मापने के लिए एक निर्माण में सुविधा है. यह एक मानक आस्टसीलस्कप या अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर से जुड़ा एक ए / डी बोर्ड के साथ नजर रखी जा सकती है, जो संक्षिप्त आयताकार परीक्षण दालों, उदाहरण भी देते हैं. आकार और टिप के आकार पर निर्भर करता है, टिप 25 के बीच एक प्रतिरोध करना चाहिए था - MΩ 90.
  8. पिपेट टिप से बाहर फ्लोरोसेंट डाई लीक तो एक 60x या 40X पानी विसर्जन उद्देश्य और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए स्विच के साथ और यदि संभव हो तो टिप पर फोकस, ज़ूम, (ग्लू के मामले में एक छोटे से सकारात्मक लागूtamate) या नकारात्मक (गाबा, चित्रा 4 के मामले में) (0.02 <μA) वर्तमान बरकरार रहती है. कि रिसाव को रद्द करने के लिए मदद नहीं करता है, पिपेट बदल जाते हैं.
  9. एक मजबूत कदम मौजूदा लागू करें या मैनुअल ट्रिगर का उपयोग और समाधान पिपेट से बाहर निकली जा सकता है देखने के लिए फ्लोरोसेंट छवि में टिप की निगरानी. जैसा कि ऊपर कहा, वर्तमान नाड़ी के polarity अलग माना जाता है कि अणु के आरोप के आधार पर किया जाता है. ग्लूटामेट बेदखल करने के लिए यह एक नकारात्मक वर्तमान और GABA एक सकारात्मक वर्तमान (चित्रा 4) के लिए. है
  10. डाई और ट्रांसमीटर के ब्लॉक इंजेक्शन, एक उच्च इंजेक्शन वर्तमान में कई बार लगाने से साफ किया जा सकता है कि पिपेट में हवाई बुलबुले.
  11. वहाँ कोई दिखाई रिसाव है और परीक्षण इंजेक्शन सफल रहा है, साथ में ले ली, समाई क्षतिपूर्ति और प्रयोग शुरू करते हैं.
  12. सावधानी: समाई मुआवजा एक प्रतिक्रिया सर्किट से हासिल किया जाता है, इस सर्किट overshoot कर सकते हैं या यह overcomp है अगर हिलानाensated. धीरे समाई मुआवजे के लिए डायल सेटिंग का उपयोग करें.
  13. रेशा गुण परिवर्तित हो सकता है के बाद से चालक स्थिरता पर निर्भर करता है यह, कभी कभी समय - समय पर खींचने सेटिंग्स समायोजित करने के लिए आवश्यक है. एक बार एक अच्छा पिपेट बनाया गया है हालांकि, अगर यह कई दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, खत्म करने के बाद प्रयोग टिप को नुकसान पहुँचाए बिना एक बंद कंटेनर में iontophoretic पिपेट की दुकान.
  14. अगले प्रयोग न्यूरोट्रांसमीटर समाधान के साथ विंदुक भरने के लिए, टिप साफ करें और फिर गुण (जैसे प्रतिरोध) परिवर्तन तो काफी जाँच करने के लिए कई मजबूत बेदखल दालों लागू होते हैं. फिर समाई क्षतिपूर्ति और फिर पिपेट का उपयोग करें. अलग न्यूरोट्रांसमीटर समाधान के साथ एक एकल पिपेट का उपयोग न करें.

4. मस्तिष्क स्लाइसें तैयार

  1. सूक्ष्म योणोगिनेसिस पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है, तो निश्चित रूप से एक मज़बूती से काम कर खींचने कार्यक्रम की स्थापना के बाद स्लाइस तैयार करते हैं.
    2. <अपनी संस्था या स्थानीय प्राधिकारी के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार ली> प्रदर्शन करना संज्ञाहरण और कत्ल प्रक्रियाओं.
  2. मस्तिष्क को हटाने के बाद, बर्फ के ठंडे ACSF सुक्रोज (प्रोटोकॉल 2.1 देखें) को हस्तांतरण.
  3. उचित मोटाई के स्लाइस (उदाहरण के लिए 300 माइक्रोन) में रुचि के क्षेत्र में कटौती.
  4. 30 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर ACSF सुक्रोज में स्लाइस सेते हैं. इसके बाद कमरे के तापमान पर सामान्य ACSF युक्त एक जलमग्न होल्डिंग कक्ष को हस्तांतरण.
  5. तैयारी और प्रयोग के दौरान 95% 2 हे, 5% सीओ 2 के साथ स्लाइस आसपास ACSF carbogenize.

5. एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग की स्थापना

  1. पूरे सेल मोड स्थापित करने के बाद, लंबे समय तक चलने स्थिति से बचने के लिए, पट्टी एक सेल से पहले टुकड़ा सतह के पास पहले से ही योणोगिनेसिस पिपेट (ओं) स्थिति.
  2. एक कम प्रतिरोध पैच विंदुक (3 - mΩ 5) खींचो, घ के साथ भरनेतु आंतरिक समाधान युक्त और पिपेट को सकारात्मक दबाव (30 - 60 मिलीबार) लागू होते हैं.
  3. दृश्य मार्गदर्शन में स्नान और दृष्टिकोण सेल (अवरक्त dodt विपरीत या दो फोटॉन ढाल विपरीत छवि) दर्ज करें.
  4. वोल्टेज दबाना मोड में एक परीक्षण पल्स (जैसे -10 एम वी, 20 मिसे) के साथ विंदुक प्रतिरोध की निगरानी करें. ऊतक ऑफसेट संभावित सही छू जाता है.
  5. सेल दृष्टिकोण और धीरे स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है एक "हिलकोरे" जब तक यह में पिपेट टिप धक्का. 60 मिलीबार नकारात्मक दबाव और -65 एम वी झिल्ली संभावित स्विच - तुरंत पिपेट का दबाव जारी, 40 लागू होते हैं.
  6. पकड़े मौजूदा 100 पीए नीचे मूल्यों पहुंचता है, नकारात्मक दबाव जारी है.
  7. एक giga मुहर की स्थापना के बाद (प्रतिरोध> 1 GΩ), पिपेट या समाई मुआवजा सर्किट का संक्षिप्त overcompensation के लिए एक छोटी, मजबूत चूषण के साथ संबंध विच्छेद झिल्ली.
  8. जो मोड पर निर्भर करता है (वोल्टेज या वर्तमान दबाना) की आवश्यकता हैप्रयोगात्मक डिजाइन के लिए, उचित क्षतिपूर्ति.
  9. इसकी अंतिम स्थिति में iontophoretic पिपेट लाने के लिए शुरू करो. सफलतापूर्वक पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए एक अधिक विस्तृत विवरण की जरूरत है, 18,19 उपलब्ध कई उत्कृष्ट दिशानिर्देश हैं.

6. Iontophoretic पिपेट प्लेस और एक में postsynaptic Iontophoretic संभावित उत्पन्न

  1. सामान्य में, iontophoretic घटनाओं सोमा या गाबा सूक्ष्म योणोगिनेसिस के लिए अक्षतंतु प्रारंभिक खंड, वृक्ष के समान शाफ्ट पर, ग्लूटामेट सूक्ष्म योणोगिनेसिस के लिए एक काँटेदार डेन्ड्राइट में, उदाहरण के लिए, इच्छित प्रयोग के आधार पर परिभाषित स्थानों पर पैदा की जा सकती है.
  2. यह छूने के बिना लगभग 1 मीटर दूरी को प्रकोष्ठ का दृष्टिकोण. ब्याज की स्थिति तक पहुँचने के बाद यह कोई न्यूरोट्रांसमीटर बाहर लीक और विंदुक समाई सही ढंग से मुआवजा दिया है कि है कि महत्वपूर्ण है.
  3. एक ग्लूटामेट साथ सेल आ iontophoretic pipett भरी हैंई झिल्ली क्षमता का पता लगाने योग्य विध्रुवण का कारण बनता है, यदि संभव हो तो वर्तमान बनाए रखने के लिए समायोजित, या पिपेट बदल जाते हैं.
  4. , लघु नकारात्मक वर्तमान दालों लागू करें शून्य से शुरू करने और (जैसे 0.1-0.4 मिसे, 0.01-1 μA दालों) व्यवस्थित वर्तमान में वृद्धि. इस iontophoretic वर्तमान विशिष्ट प्रयोगात्मक में वांछित प्रतिक्रियाओं सेट अप के उदाहरण भी देते हैं जो श्रृंखला में पता लगाने के लिए मदद करता है.
  5. कोई जवाब नहीं पता लगाने योग्य नहीं है, तो पिपेट कई सौ माइक्रोमीटर उठा और टिप साफ करने के लिए (> 0.1 μA) एक मजबूत बेदखल वर्तमान लागू होते हैं. , समाई मुआवजा समायोजित सेल दृष्टिकोण, और फिर कोशिश करें.
  6. अभी भी कोई जवाब नहीं है, तो मौजूदा बनाए रखने के लिए कम. इस प्रक्रिया अनियंत्रित न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज पैदा कर सकता है के बाद से डायल सेटिंग्स के साथ बहुत सावधान रहना होगा. इसलिए, लगातार झिल्ली क्षमता में संबंधित परिवर्तन का पता लगाने के लिए रिकॉर्डिंग की निगरानी.
  7. यह GABAergic घटनाओं का पता लगाने के लिए मुश्किल है, तो यह एक का उपयोग करने के लिए सहायक हो सकता हैएन आंतरिक समाधान रचना एक उच्च सीएल में बेदखल - असली ताकत. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, सीएल कम - विंदुक समाधान (. प्रोटोकॉल अनुभाग 2.6 देखें) में एकाग्रता. यह एक उच्च प्रेरणा शक्ति के कारण आराम झिल्ली क्षमता पर बड़ा GABAergic घटनाओं में परिणाम होगा.
  8. वैकल्पिक रूप से, -100 एम वी से -48 ​​एम वी (चित्रा 8C) को झिल्ली संभावित संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप में लंबे मौजूदा कदम इंजेक्षन. इस प्रोटोकॉल के साथ सीएल - ड्राइविंग बल एक depolarizing गाबा प्रतिक्रिया पैदा hyperpolarized क्षमता में वृद्धि हुई है.
  9. यह घटनाओं की GABAergic प्रकृति का निर्धारण करने में मदद करता है जो पैदा की घटनाओं, के उलट क्षमता का निर्धारण करने के लिए कदम मौजूदा इंजेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए भी संभव है. गाबा का रिसाव ग्लूटामेट के रिसाव से पता लगाने के लिए कठिन है. इस मामले में, इनपुट प्रतिरोध का एक निरंतर निगरानी गाबा भरा पिपेट संपर्क किया जाता है, तो कर सकते हैं. इनपुट प्रतिरोध कम हो जाती है, तो वर्तमान ख कर सकते हैं बनाए रखने केई वृद्धि हुई है या एक अलग पिपेट इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  10. ग्लूटामेट योणोगिनेसिस के लिए नियंत्रण प्रयोगों के रूप में, हम ग्लूटामेट लीक की वजह से हो सकता है कि स्थानीय कैल्शियम बाढ़ कल्पना करने के लिए पिपेट समाधान में 200 माइक्रोन OGB -1 और कोई EGTA का उपयोग कर, एक सीए 2 + इमेजिंग प्रयोग का सुझाव देते हैं.
  11. सामान्य तौर पर, एक स्थिर प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए समय के साथ बहाव से बचने के लिए एक यंत्रवत् स्थिर पिपेट है करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. बहाव तापमान में परिवर्तन की वजह से हो सकता है, इसलिए यह माप थर्मल बहाव से बचने के लिए पहले कम से कम आधे घंटे के उपकरण पर स्विच करने के लिए सिफारिश की है. विंदुक धारक में अच्छा कारतूस जवानों उपयोग करने के लिए और टिप वास्तव में तय हो गई है सुनिश्चित करें. धारक ही अतिरिक्त Teflon टेप के साथ तय किया जा सकता है, इसके अलावा, यह भी बहाव का एक संभावित स्रोत है जो headstage या जोड़तोड़ से केबल पर कोई तनाव नहीं है कि सुनिश्चित करें.

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Representative Results

योणोगिनेसिस के स्थानिक प्रसार को निर्धारित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण अलग हो ग्लूटामेट स्थिर रखते हुए, डेन्ड्राइट से चरणबद्ध iontophoretic पिपेट वापस लेना है. हम एक सूक्ष्म iontophoretic उत्तेजना के स्थानिक हद तक लगभग 12 माइक्रोन (चित्रा 1 त्रिज्या दिखा) की एक व्यास पड़ा मिला. कैसे योणोगिनेसिस इस्तेमाल किया जा सकता है ऊतक में गहरी पिपेट की कठोरता पर निर्भर करता है. हालांकि, यहां उपयोग किया जाता है जो स्लाइस (चित्रा 2), में प्रयोगों के लिए आवश्यक iontophoretic pipettes, प्रवेश की गहराई को सीमित नहीं कर रहे हैं. बल्कि ऑप्टिकल प्रणाली और मस्तिष्क टुकड़ा की गहराई में कम संकल्प सीमित कारक है. एक अच्छी गुणवत्ता रिकॉर्डिंग के लिए यह कोई ट्रांसमीटर पिपेट से बाहर लीक कर रहा है कि महत्वपूर्ण है. आधारभूत अचानक हो जाता है अगर डेन्ड्राइट पिपेट टिप के साथ संपर्क किया है या जब अचानक विध्रुवण अगर वहाँ ग्लूटामेट के मामले में एक रिसाव पहचाना जा सकता हैअस्थिर (चित्रा 5). एक स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थापना के बाद, यह वृक्ष के समान पेड़ (चित्रा 6) भर में किसी भी स्थान पर इस तकनीक के साथ परिभाषित आयाम, वृक्ष के समान spikes या कार्रवाई क्षमता के EPSPs आह्वान करने के लिए संभव है. तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस साथ ग्लूटामेट लागू करके, EPSPs के गुण, उनके प्रचार और योग, एक साथ अलग अलग भी दूर के स्थानों पर, (चित्रा 7) की जांच की जा सकती है. और एक सकारात्मक बेदखल वर्तमान: GABAergic घटनाओं के एक उच्च केंद्रित गाबा समाधान (प्रोटोकॉल खंड 2 देखें) के साथ iontophoretic पिपेट भर कर एक दूसरे पिपेट साथ ग्लूटामेट अकेले या इसके अलावा में पैदा किया जा सकता है. घटनाओं की GABAergic प्रकृति पुष्टि करने के लिए और एक उच्च प्रेरणा शक्ति आंतरिक समाधान का उपयोग नहीं करते हैं, पता लगाने के लिए GABAergic घटनाओं को आसान बनाने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है: नकारात्मक धाराओं (लगभग 1 सेकंड इंजेक्षन, आयाम के इनपुट प्रतिरोध पर निर्भर करता है सेल) hyperpolarising वो जिसके परिणामस्वरूप मेंltage कदम, -100 एम वी के आसपास में शुरू करने और फिर 5 एमवी कदम (8 चित्रा) में वृद्धि हुई है. बहुत नकारात्मक क्षमता पर GABAergic घटनाओं उच्च प्रेरणा शक्ति के कारण का पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं. संकेतों की गणना सीएल चारों ओर रिवर्स और अगर - समाधान के लिए उलट क्षमता है, यह है कि वे (चित्रा 8) प्रकृति में GABAergic हैं कि बहुत संभावना है. एक अतिरिक्त गाबा सूक्ष्म iontophoretic विंदुक के साथ, यह वृक्ष के समान कील और IPSP के सापेक्ष समय (9 चित्रा) द्वारा अलग, वृक्ष के समान सोडियम / कैल्शियम spikes की तरह, glutamatergic घटनाओं पर, उदाहरण के लिए, GABAergic निषेध के प्रभाव की जांच करने के लिए संभव है दोनों घटनाओं, या उनके आयाम के सापेक्ष स्थान. (सभी पशु प्रयोगों पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की और बॉन विश्वविद्यालय, neurodegenerative रोगों और राज्य Northrhine-Westfalia के लिए जर्मन सेंटर का प्रयोग समिति थे.)


चित्रा 1. Iontophoretically निकली ग्लूटामेट के स्थानिक हद पिपेट त्याग द्वारा निर्धारित की. 100 माइक्रोन एलेक्सा 594 और प्रारंभिक स्थिति (पैमाने बार 8 माइक्रोन) में iontophoretic पिपेट से भरा एक CA1 पिरामिड सेल डेन्ड्राइट के एक दो photon छवि का एक) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण. Insets iontophoretic पिपेट का त्याग और सोमा में दर्ज इसी iontophoretic EPSP दिखा. तीर iontophoretic पिपेट टिप की स्थिति को दर्शाता है. EPSP आयाम के बी) दूरी निर्भरता iontophoretic पिपेट टिप की प्रारंभिक स्थिति (≤ 1 माइक्रोन दूर डेन्ड्राइट, एन = 6 शाखाओं से) के सापेक्ष. इस के साथ हम व्यवस्थित retracting पिपेट से फैल ग्लूटामेट की त्रिज्या अनुमान सकता है. इनसेट शो प्रतिनिधि उदाहरण के निशान. त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व± SEM के मतलब है. (मुलर एट अल से अनुकूलित. 2012 9, Elsevier से अनुमति के साथ reprinted).

चित्रा 2
चित्रा 2. कैसे एक iontophoretic पिपेट की तरह दिखना चाहिए. एक iontophoretic पिपेट की ए) इन्फ्रारेड सीसीडी छवि एक 60x उद्देश्य का उपयोग बड़े पैमाने के साथ. बी) Iontophoretic पिपेट एक 60X उद्देश्य का उपयोग कर एक छोटा सा 5.5 MΩ पैच पिपेट की तुलना में. अंशांकन: छोटी = 10 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. परीक्षण नाड़ी (10 एनए, 10 मिसे, NPI इलेक्ट्रॉनिक, Tamm, में निर्माण का उपयोग कर iontophoretic पिपेट की समाई मुआवजाजर्मनी). सही पिपेट प्रतिरोध नजर रखने के लिए और तेजी से और सही न्यूरोट्रांसमीटर आवेदन सुनिश्चित करने के लिए सही ढंग से समाई क्षतिपूर्ति करने के लिए महत्वपूर्ण है.

चित्रा 4
4 चित्रा. सूक्ष्म योणोगिनेसिस के सिद्धांतों. पूरे सेल पैच दबाना विन्यास और ग्लूटामेट से भरा एक iontophoretic पिपेट में एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन ए) योजनाबद्ध ड्राइंग. ग्लूटामेट नकारात्मक विंदुक के लिए लागू एक सकारात्मक वर्तमान पिपेट के बाहर लीक से रखेंगे, इसलिए आरोप लगाया है: मौजूदा सकारात्मक है (बाएं पैनल) बनाए रखने के लिए. पिपेट से ग्लूटामेट बेदखल करने के लिए, एक नकारात्मक वर्तमान लागू (सही पैनल). इस रास्ते में ग्लूटामेट पिपेट से बाहर मजबूर है और postsynaptic सेल में उत्तेजक घटनाओं पैदा कर सकते हैं. सी बी) योजनाबद्ध ड्राइंगपूरे सेल पैच दबाना विन्यास और गाबा से भरा एक iontophoretic पिपेट में A1 पिरामिड न्यूरॉन. गाबा सकारात्मक एक कम पीएच पर आरोप लगाया है. इसलिए, एक नकारात्मक वर्तमान पिपेट (बाएं पैनल) के बाहर लीक से रखेंगे. बेदखल करने के लिए गाबा एक सकारात्मक वर्तमान (सही पैनल) लागू होते हैं. इस तरह गाबा पिपेट से बाहर आता है और postsynaptic सेल में निरोधात्मक घटनाओं पैदा कर सकते हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. अच्छा और बुरा iontophoretic pipettes. एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन के एक वृक्ष के समान शाखा पर उत्पन्न एक iontophoretic glutamatergic EPSP की ए) प्रतिनिधि उदाहरण. बी) एक iontophoretic वृक्ष के समान कील के प्रतिनिधि उदाहरण पिपेट टिप से चल रहे हल्के ग्लूटामेट रिसाव साथ हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र में एक वृक्ष के समान शाखा उत्पन्न.

चित्रा 6
6 चित्रा. एकल ग्लूटामेट सूक्ष्म योणोगिनेसिस के लिए प्रतिनिधि परिणाम है. एक समझौता CA1 पिरामिड न्यूरॉन ए) योजनाबद्ध ड्राइंग और एक iontophoretic पिपेट ग्लूटामेट साथ भर दिया. बी) EPSP ग्लूटामेट योणोगिनेसिस साथ एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन में पैदा की. सी) वृक्ष के समान ना + / सीए 2 + कील एक CA1 पिरामिड की एक समीपस्थ डेन्ड्राइट पर पैदा न्यूरॉन, कम ट्रेस वोल्टेज का पता लगाने के ढलान से पता चलता है, शिखर वृक्ष के समान स्पाइक के शिखर ढलान इंगित करता है. यह कार्रवाई संभावित सीमा पार तक डी) में वृद्धि जब EPSP की iontophoretic आयाम को लागू वर्तमान में वृद्धि होगी.

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चित्रा 7. वृक्ष के समान पेड़ पर विभिन्न स्थानों पर डबल ग्लूटामेट सूक्ष्म योणोगिनेसिस के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. क्रमशः एक समझौता CA1 पिरामिड न्यूरॉन और दो ​​iontophoretic pipettes ग्लूटामेट से भरा, एक समीपस्थ पर तैनात कर रहे हैं जो, और एक बाहर का डेन्ड्राइट के ए) योजनाबद्ध ड्राइंग, एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन (1) का एक समीपस्थ डेन्ड्राइट पर पैदा की. बी) Iontophoretic EPSP. सी) Iontophoretic EPSP एक बाहर का डेन्ड्राइट (2) में पैदा की.

8 चित्रा
चित्रा 8. गाबा सूक्ष्म योणोगिनेसिस के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. एक समझौता CA1 पिरामिड न्यूरॉन और गाबा से भरा एक iontophoretic पिपेट की ए) योजनाबद्ध ड्राइंग.बी) Iontophoretic IPSP) एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन. सी के एक समीपस्थ डेन्ड्राइट पर व्यवस्थित -400 पीए से पैदा की घटना के पलटने की क्षमता (वर्तमान इंजेक्शन निर्धारित करने के लिए, पैच विंदुक के माध्यम से एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन करने के आयाम बदलने की लंबी मौजूदा इंजेक्शन पैदा को 0 पीए). विरूपण साक्ष्य गाबा योणोगिनेसिस का समय बिंदु इंगित करता है. पैदा की घटना लगभग -70 एम वी (तीर) के एक उलट क्षमता को दर्शाता है.

9 चित्रा
9 चित्रा. एक साथ ग्लूटामेट और निषेध और उत्तेजना के एकीकरण की जांच के लिए गाबा योणोगिनेसिस के प्रतिनिधि परिणाम है. ग्लूटामेट (हरा) के साथ और गाबा (नारंगी) के साथ पर भरा एक समझौता पिरामिड न्यूरॉन और एक विंदुक के ए) योजनाबद्ध ड्राइंग. बी) Iontophoretically पैदाअकेले वृक्ष के समान spikes के बाद स्वीप में, कम निशान डीवी / डीटी, चोटियों वृक्ष के समान spikes से संकेत मिलता दिखा. सी) Iontophoretically. डी) दोनों glutamatergic और GABAergic घटनाओं को एक साथ अकेले IPSP पैदा की.

स्थान विशिष्टता ट्रांसमीटर विशिष्टता विषाक्तता / साइड इफेक्ट Presynaptic उत्तेजना लंबे समय तक प्रयोग लागत / जटिलता
माइक्रो योणोगिनेसिस + + + + + + - + +
2 फोटॉन uncaging + + + + + + + + + - + +
Synaptic उत्तेजना - - + + + + + + + + + + + + ++

तालिका 1. . विभिन्न तकनीकों की तुलना लाभ और तकनीक का नुकसान अलग मापदंड के अनुसार न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने के लिए (- = बुरा + = नहीं इष्टतम, + + + = अच्छा, + + + + = सबसे अच्छा).

पैच pipettes Iontophoretic pipettes
पी (ए) एक पुल पूर्व खींचतान अंतिम खींचो पी (बी) पी (ए) एकल खींचो पूर्व खींचतान अंतिम खींचो पी (बी)
हीट एच 700 480 510 600
सेना के पूर्व खींचो एफ (HI) 018 035 018 008
दूरी थ्रेसहोल्ड है (HI) 017 012 025 015
विलंब Heatstop टी (एच) 050 030 050 030
दूरी Heatstop एस (एच) 030 000 030 000
विलंब एफ (एफ 1) 000 136 000 050
1 एफ 1 खींचो सेना 000 065 200 400
दूरी खींचो 2 एस (F2) 000 005 000 001
2 एफ 2 खींचो सेना 000 080 000 095
समायोजित (ई.) 121 000 121 000

तालिका 2. Exemplarily खींचने प्रोटोकॉल. एक क्षैतिज खींचने के लिए (DMZ-पैच और iontophoretic pipettes दोनों के लिए GB150F-8P तंतु (विज्ञान उत्पाद, Hofheim, जर्मनी) का उपयोग यूनिवर्सल डांड़ी, जीट्ज़ उपकरण जीएमबीएच, Martinsried, जर्मनी).

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Discussion

यहाँ हम डेन्ड्राइट पर synaptic एकीकरण की जांच के लिए न्यूरोट्रांसमीटर की तेजी सूक्ष्म योणोगिनेसिस लागू करने के लिए समझाना. इस तकनीक को सफलतापूर्वक इन विट्रो और इन विवो 9,20-22 में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में glutamatergic और GABAergic synaptic प्रसारण की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है. माइक्रो योणोगिनेसिस 60 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन प्रारंभिक वर्षों में यह ज्यादातर या तो स्थानीय धीमी या मध्यवर्ती timescales के 23 या कोशिकाओं 24 में पदार्थों की microinjection के लिए न्यूरोट्रांसमीटर और दवाओं लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

माइक्रो योणोगिनेसिस उच्च प्रतिरोध इलेक्ट्रोड 10,11 के लिए एक तेज समाई मुआवजा से लैस हैं जो एम्पलीफायरों, की शुरूआत के बाद से वृक्ष के समान एकीकरण के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से दिलचस्प उपकरण बन गया. इस सुधार के साथ यह अनुसंधान कौशल जो postsynaptic प्रतिक्रियाओं में जिसके परिणामस्वरूप संक्षिप्त आयताकार iontophoretic धाराओं, लागू करने के लिए संभव हो गयाअधिक वास्तविक अन्तर्ग्रथनी घटनाओं 10,25 के समय पाठ्यक्रम mbled.

सूक्ष्म योणोगिनेसिस की स्थापना जब तकनीकी आवश्यकताओं और से निपटने के लिए कठिनाइयों, क्या कर रहे हैं? एक iontophoretic एम्पलीफायर ठीक iontophoretic pipettes के उच्च समाई के मुआवजे के लिए अनुमति देता है की जरूरत है. उच्च प्रतिरोध microelectrodes के साथ संयोजन के रूप में उच्च गति आपरेशन आवश्यक है, तो क्षमता मुआवजे की सही ट्यूनिंग बहुत महत्वपूर्ण है. Uncompensated आवारा capacitances के साधन के द्वारा आपूर्ति की है कि iontophoretic वर्तमान का आरोप लगाया है, और इसलिए आवेदन को धीमा कर रहे हैं. ठीक समाई मुआवज़े महत्वपूर्ण और वीडियो में विस्तार से समझाया गया है. इसके अतिरिक्त, यह ऑप्टिकल प्रणाली ऊतक की तस्वीर क्षति उत्प्रेरण बिना डेन्ड्राइट और iontophoretic पिपेट का एक अच्छा फ्लोरोसेंट छवि देता है कि महत्वपूर्ण है. बेहतर, एक दो photon प्रणाली का उपयोग करें और लेजर शक्ति को कम करने और के साथ के रूप में ज्यादा के रूप में संगत बार ध्यान केन्द्रित करनाएक सभ्य छवि गुणवत्ता. एक और अधिक परंपरागत प्रकाश स्रोत इस्तेमाल किया जाता है, यांत्रिक शटर का उपयोग कर या बिजली के ट्रिगर द्वारा, उदाहरण के लिए, के रूप में ज्यादा के रूप में संभव समय जोखिम को कम करने के लिए सुनिश्चित करें. शायद सबसे महत्वपूर्ण बिंदु इस्तेमाल किया न्यूरोट्रांसमीटर के एक परिभाषित और विशेष आवेदन के लिए अनुमति देगा जो पिपेट डिजाइन, है. यह कदम कुछ प्रयास और इष्टतम सेटिंग्स को खोजने के लिए समय की आवश्यकता है. यहाँ, हम अन्य न्यूरोट्रांसमीटर, ब्लॉकर्स या modulators के लिए उपयोग किया जाता है, यह पदार्थ अत्यधिक यह आरोप लगाया है कि और भी अधिक महत्वपूर्ण बात यह केंद्रित है और है कि आवश्यक है, ग्लूटामेट और GABA योणोगिनेसिस के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. गाबा 0 का पीएच पर शून्य का शुद्ध आरोप है के बाद से, उदाहरण के लिए, पीएच एक शुद्ध सकारात्मक आरोप में जिसके परिणामस्वरूप (प्रोटोकॉल खंड 2 देखें) समायोजित किया जाना है.

सूक्ष्म योणोगिनेसिस स्थापित किया जाता है, यह न्यूरॉन्स में synaptic एकीकरण अध्ययन करने के लिए एक विस्तारित toolset प्रदान करेगा. यह चुनिंदा साथ ब्याज की synapses के उत्तेजक अनुमति देता हैएक विशेष neurotransmitter. परिभाषित स्थानों, postsynaptic धाराओं और क्षमता पर एक चयनित न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग करना और उनके प्रसार की जांच की जा सकती है. इसके अलावा, यह कई glutamatergic आदानों के एकीकरण की जांच या व्यवस्थित सापेक्ष समय या घटनाओं की ताकत को बदलने के लिए एक साथ कई iontophoretic इलेक्ट्रोड का उपयोग करना संभव है.

कुछ सामान्य महत्वपूर्ण बिंदुओं सूक्ष्म योणोगिनेसिस का उपयोग करते समय विचार किया जाना है. सूक्ष्म योणोगिनेसिस के बाद न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता की प्रोफाइल अंतर्जात रिहाई से अलग है. Murnick और दूसरों को 10 योणोगिनेसिस टिप (मिसे 1 के बारे में) से रिहाई की गति एक millisecond (0.2 मिसे) 26 के भागों में पाया जाता है जो फफोले, से अन्तर्ग्रथनी रिहाई की तुलना में काफी धीमी होने की संभावना है कि सूचना दी. इसके अलावा, के लिए और synaptic फांक से प्रसार होने की संभावना एकाग्रता में वृद्धि और iontophoretically लागू न्यूरोट्रांसमीटर का क्षय चल रही है.इसके अलावा, अलग न्यूरोट्रांसमीटर की मात्रा उच्च प्रतिरोध इलेक्ट्रोड, एकल glutamatergic और GABAergic postsynapses साथ, तथापि, physiologically जारी संस्करणों की तुलना में अधिक होने की संभावना है सूक्ष्म योणोगिनेसिस 10-12 का उपयोग कर सक्रिय किया जा सकता है. कुछ micrometers के रेंज में एक स्थानिक चयनात्मकता भी हाल ही में न्यूरोट्रांसमीटर 3,4,27 की दो photon uncaging द्वारा हासिल किया गया है.

काफी अधिक लागत गहन जबकि, दो photon uncaging सूक्ष्म योणोगिनेसिस पर कई फायदे हैं. विशेष रूप से यह कई synaptic स्थलों पर एक साथ न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक ठीक इलेक्ट्रोड टिप की सटीक स्थिति की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, यह भी एक विशेष रूप से प्रयोग के लिए एक विधि का चयन माना जाता है जब कुछ महत्वपूर्ण नुकसान है. कई बंदी यौगिकों ऐसे neurotransmitter रिसेप्टर्स 28 की नाकाबंदी के रूप में अवांछित साइड इफेक्ट है. उदाहरण के लिए, कई ग्लूटामेट और GABA पिंजरोंGABAergic निषेध के साथ हस्तक्षेप करने के लिए सूचित किया गया है. इसके अलावा, दो photon uncaging के लिए आवश्यक अपेक्षाकृत उच्च शक्ति लेजर उत्तेजना कई मिनट से अधिक बार बार लागू किया जाता है, खासकर जब postsynaptic न्यूरॉन की तस्वीर क्षति हो सकती है. सूक्ष्म योणोगिनेसिस प्रेरित साइटों की संख्या में सीमित है, जबकि इसके अलावा, इन साइटों को अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से बहुस्तरीय synaptic इनपुट अनुकरण करने के लिए, बाहर का और बेसल डेन्ड्राइट पर उदाहरण के लिए, एक न्यूरॉन के पूरे वृक्ष के समान पेड़ पर स्वतंत्र रूप से चुना जा सकता है. दो photon uncaging, यह वर्तमान में सबसे समूहों द्वारा किया जाता है, के रूप में एक विशेष फोकल हवाई जहाज़ में और (आमतौर पर 40X या 60X पानी विसर्जन) का इस्तेमाल उद्देश्य पर निर्भर करता है जो देखने के क्षेत्र में synaptic स्थलों तक ही सीमित रहेगा. यह दोनों तकनीकों हमेशा परिणामों की व्याख्या और अधिक कठिन बना सकता है जो extrasynaptic रिसेप्टर्स की सक्रियण के लिए नेतृत्व कि विचार किया जाना है.

सूक्ष्म योणोगिनेसिस का एक और नुकसान है कि ओ हैnly postsynapse सक्रिय किया जा सकता है. Presynaptic समारोह और पुटिका में जारी न्यूरोट्रांसमीटर की भूमिका प्रयोगात्मक ध्यान में निर्धारित किए जाने की जरूरत है, स्थानीय विद्युत अन्तर्ग्रथनी उत्तेजना पसंद का एक तरीका हो सकता है. हालांकि, बिजली synaptic उत्तेजना का नुकसान सूक्ष्म योणोगिनेसिस की तुलना में संभवतः अन्य न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम (1 टेबल) से संबंधित, सक्रिय synapses के अज्ञात स्थान और अलग neuronal आबादी से axons की सह सक्रियण हैं.

सारांश में सूक्ष्म योणोगिनेसिस का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह कई अलग न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग करने के लिए और इस तरह के डेन्ड्राइट 9 के रूप में neuronal डिब्बों पर उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है कि, हमारी राय में, है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम ध्यान से पांडुलिपि पढ़ने के लिए हंस रेनर Polder, मार्टिन Fuhrmann और वाकर जैक्सन धन्यवाद. , neurodegenerative रोगों में उत्कृष्टता के केंद्र (कोएन, लेखकों राज्य Northrhine-Westfalia (एसआर), कम्प्यूटेशनल न्यूरोसाइंस में BMBF-Projekträger डीएलआर अमेरिका जर्मन सहयोग (एसआर CRCNS) के अनुसंधान MIWF मंत्रालय द्वारा प्रदान किया गया है कि धन प्राप्त किया; एसआर), और बॉन अंदर का वित्त पोषण कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (BONFOR, एसआर).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany  
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA  
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent  
60X Objective, NA 0.9 Olympus  
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany  
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA  
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany  
  Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

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References

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).

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Müller, C., Remy, S. Fast… More

Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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