Summary
I denne artikkelen introduserer vi fort micro-iontoforese av nevrotransmittere som en teknikk for å undersøke integrering av postsynaptiske signaler med høy romlig og tidsmessig presisjon.
Abstract
En av de grunnleggende interesser i nevrovitenskap er å forstå integreringen av eksitatoriske og hemmende innganger langs svært komplekse strukturen i dendrittiske treet, som til slutt fører til neuronal produksjon av aksjonspotensialer på axon. Påvirkningen av ulike romlige og tidsmessige parametre for spesifikke synaptiske innspill på neuronal produksjonen er for tiden under etterforskning, f.eks avstandsavhengig demping av dendrittiske innganger, plasseringen-avhengige interaksjonen mellom romlig segregerte innganger, påvirkning av GABAergig hemming på eksitatoriske integrasjon, lineær og ikke-lineære integrering moduser, og mange flere.
Med rask mikro-iontoforese av glutamat og GABA er det mulig å presist undersøke den romlige og tidsmessige integrering av glutamatergic eksitasjon og GABAergic hemming. Kritiske tekniske kravene er enten en utløst lysrør, light-emitting diode (LED), eller en to-foton scanning mikroskop for å visualisere dendrittiske grener uten å innføre vesentlig foto-skade av vev. Videre er det meget viktig å ha en mikro-iontoforese forsterker som tillater rask kapasitans kompensasjon av høye motstand pipetter. Et annet viktig punkt er at ingen senderen er uvilkårlig utgitt av pipetten i løpet av eksperimentet.
Når etablert, vil denne teknikk og gir pålitelige og reproduserbare signaler med en høy nevrotransmitter og plassering spesifisitet. Sammenlignet med glutamat og GABA uncaging, gir rask iontoforese med begge sendere på samme tid, men på svært fjerne steder uten begrensning til synsfeltet. Det er også fordeler i forhold til fokal elektrisk stimulering av aksoner: med mikro-iontoforese plasseringen av inngangs området er definitivt kjent, og det er for at kun den nevrotransmitter av interesse er sluppet. Men det må tas i betraktning at med mikro-iontoforese barepostsynapse er aktivert og presynaptiske aspekter av signalstoffet utgivelsen er ikke løst. I denne artikkelen viser vi hvordan du setter opp mikro-iontoforese i hjernen skive eksperimenter.
Introduction
Nevroner i sentralnervesystemet motta en rekke av synaptiske innganger på de tynne og ramified dendrittiske prosesser en. Det er de fleste av de eksitatoriske dendrittiske innganger mediert av glutamatergic synapser. Disse synapser kan aktiveres i en rommessig fordelt måte, noe som resulterer i postsynaptiske lineær integrering av eksitatoriske postsynaptiske potensialer (epsps). Hvis synapsene aktiveres samtidig og i romlig nærhet på Dendritt, kan disse eksitatoriske innganger være integrert supra-lineært og generere dendrittiske toppene 2-5.
Videre avhenger integrering av eksitatoriske innganger på plasseringen av den inngangen på den dendrittiske treet. Signaler som ankommer ved den distale tuft region er mye mer attenuert enn proksimale innganger på grunn av kabel-filtrering 6.. I hippocampus, er fjernt innganger til den apikale dusk dendrites generert av en annen hjernen regionen enn de på proksimale dendrites 7. Et spennende spørsmål er derfor, er hvordan synaptiske innspill behandles av ulike dendrittiske avdelinger og hvis dendrittiske integrering regulerer påvirkning av disse lagdelte innganger på nevronal utløsning på forskjellige måter.
Ikke bare de funksjonelle egenskaper, morfologiske trekk ved Dendritt, er plasseringen og gruppering av inngangene påvirker dendrittiske integrering av eksitatoriske innganger, også den ekstra inhiberende innganger fra gabaergic terminaler avgjørende bestemme effekten av glutamatergic synapser 8,9. Disse forskjellige aspekter ved synaptiske integrasjon kan være ideelt undersøkt ved hjelp av nevrotransmitter mikro-iontoforese, som tillater romlig definerte anvendelse av forskjellige nevrotransmittere til dendrittiske domener. Vi viser her hvordan du lykkes etablere mikro-iontoforese av glutamat og GABA å undersøke signal integrasjon i nerveceller.
For denne søknaden, tynnhøye motstand pipetter fylt med konsentrerte neurotransmitter løsninger brukes. Disse pipetter er plassert nær den ytre membran av cellen, hvor de nevrotransmitter-reseptorer er lokalisert. En god visualisering av de dendrittiske grener er nødvendig. Dette oppnås best ved hjelp av fluorescerende fargestoffer, som er introdusert via plasteret pipette. Da en meget kort (<1 msek) strømpuls (i området fra 10-100 nA) brukes for å løse ut de ladede molekyler nevrotransmitter. Med disse korte pulser og effektiv kapasitans kompensasjon, kan postsynaptiske potensialet eller strøm bli fremkalt med høyere tids-og romlig nøyaktighet, noe som innebærer plasseringen av eksitatoriske inngang er nøyaktig kjent. Glutamat mikro-iontoforese kan aktivere synapser i en definert radius, som er mindre enn 6 um som vist her (fig. 1 9), men det er også mulig å oppnå enkelt synapse oppløsning 10-12.
Heine, M., et al 13.. Med rask mikro-iontoforese er det lett mulig å bruke to eller flere iontoforetisk pipetter og plassere dem på ulike, selv fjerne flekker på dendrittiske treet. På denne måten kan integrering av eksitatoriske hendelser, inkludert de fra ulike veier, undersøkes. Det er også mulig å anvende et glutamat og en GABA fylt iontoforetisk pipette samtidig. På denne måten kan virkningen av GABAerg hemming på forskjellige steder i forhold til den eksitatoriske inngangen (på-bane, utenfor-bane inhibering) kan studeres. Også effekten av hemming av interneurons rettet mot spesifikke nevrale domener, som distale dendritter, soma eller aksoner 14, kan bli undersøkt ved hjelp av GABA iontoforese. I dyrkede nerveceller, tilbyr rask mikro-iontoforese muligheten til å investigate enkelt synapse distribusjon og elementære aspektene ved synaptisk kommunikasjon i nevroner i mye mer detalj 10,11.
I denne artikkelen viser vi i detalj hvordan å etablere glutamat og GABA iontoforese for bruk i akutte hjernen skiver, noe som gjør det mulig å undersøke synaptiske integrering av eksitatoriske og hemmende innganger i avhengighet av innspill beliggenhet, innspill styrker, og timing, alene eller i samspill. Vi vil påpeke fordeler og begrensninger av denne teknikken og hvordan å feilsøke vellykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Systemkrav
- Mikroskop system: God visualisering av dendrite er avgjørende. Hvis tilgjengelig, kan du bruke en to-foton laser scanning mikroskop system. I våre forsøk har vi brukt en TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Tyskland eller en Ultima IV system, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin utstyrt med et Ti: Sapphire lynraske-pulset laser (Chameleon Ultra II, Samstemt) og en høy NA objektiv (60X, 0,9 NA, Olympus) å visualisere dendritter som vi hadde fylt med et fluorescerende fargestoff via patch pipette. Selv om foto-skade er antatt å være mindre alvorlig ved hjelp av to-foton-skanning, redusere lasereffekten (under 8 mW ved vevet) og holdetider (under en μsec) eller så mye som mulig.
- En andre mulighet er å utløse et bredt felt fluorescens-lyskilde (LED eller en fluorescerende lampe) synkront med anskaffelse for å redusere eksponeringstiden så mye som mulig. Vi har brukt en monochromator med integrert lyskilde (TILLPhotonics, Gräfelfing, Tyskland) på en Zeiss Axioskop to FS oppreist mikroskop som var utstyrt med Dodt kontrast infrarød belysning (TILLPhotonics, Gräfelfing, Tyskland). I våre forsøk eksponeringstider varierte fra vanligvis 10 millisekunder til maks. 30 millisekunder.
- Bruk en rask mikro-iontophoresis forsterker, f.eks en to-kanals micro-iontoforese system MVCS-C-02 (NPI elektronisk, Tamm, Tyskland) med rask kapasitans kompensasjon. De tynn iontoforetiske microelectrodes har motstand av 25-100 MΩ (avgjørende avhengig av tips størrelse og pipette form), og raske veksten tider kan bare oppnås dersom kapasitans kompensasjon av iontoforetisk forsterkeren er optimalt innstilt. Denne raske kompensasjon er det nødvendig å anvende strømpulser med en kort og hurtig innsettende i sub-millisekund hold iontoforetisk pipette og derved å støte ut senderen med høy romlig oppløsning i flekk størrelser under omkring 1 pm 13. Iontoforetiske forsterkere er alså tilgjengelig fra flere andre selskaper, som vi ikke har testet i vårt laboratorium. Disse enhetene er til vår kunnskap ikke utstyrt med kapasitans kompensasjon krets.
2. Forbered Solutions
- Forbered kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) og intern løsning som det er nødvendig for den eksperimentelle design. Den eneste tillegg til den indre løsning, som er nødvendig, er en rød eller grønn fluorescerende farge (for eksempel 50 til 200 uM Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazid, Invitrogen), avhengig av den optiske utstyr. Her er et eksempel for ACSF sukrose som kan brukes til disseksjon, i mM: NaCl 60, 100 sukrose, 2,5 KCl, 1,25 NaH PO 2 4, 26 3 NaHCO, 1 2 CaCl, 5 2 MgCl, 20 glukose, og for normal ACSF løsning for patch-klemme eksperimenter i mm: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 4 PO, 26 3 NaHCO, 2.6 2 CaCl, 1.3 MgCl 2, 15 glukose.
- Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) alle ekstracellulære løsninger hele tiden.
- Forbered intern løsning, for eksempel i mm: 140 K-gluconate, 7 KCl, 5 HEPES-syre, 0.5 2 MgCl, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA, med 50-200 mikrometer Alexa 488.
- For glutamat mikro-iontoforese tilberede en oppløsning med 150 mM glutaminsyre og justere pH til 7,0 med NaOH. Tilsett 50 -200 mikrometer Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazid (Invitrogen) for visualisering.
- For iontoforese av GABA forberede en 1 M løsning GABA og justere pH-verdien til 5 med 15 HCl. På dette pH GABA er ladet, bare da det kan påføres med iontoforese. Vær oppmerksom på at den lave pH i løsningen kastes ut den ekstracellulære plass kan påvirke GABA overføring selv 16,17.
Beskytt GABA løsning mot lys og ofte forberede frisk GABA lager løsning, siden eldre løsning kan miste sin effektivitet. - Hvis det er vanskelig å se gabaergic hendelser, en high Cl - drivkraft intern løsning, for eksempel ved å utelate KCl, kan bidra til å visualisere gabaergic hendelser for å se om GABA iontophoresis fungerer, men å undersøke synaptiske integrering en fysiologisk drivkraft kan anbefales. For generell deteksjon av små gabaergic hendelser, kan en protokoll vist i figur 8C hjelpe.
3. Trekk og Test iontoforese Pipettes
- Generelt, trekke de riktige pipetter er kanskje den mest kritiske trinnet for å oppnå kontrollert nevrotransmitter iontoforese. Ved bruk av iontoforese i cellekultur, er det mulig å trekke svært fine elektroder som ligner skarpe mikroelektroder 10. I patch-clamp eksperimenter i akutte skiver, men disse meget tynne pipetter bøyes på skive overflate når de senkes inn i vevet med en vinkel, noe som gjør det umulig å nå dypere dendritter.
- Derfor trekker en pipette med en meget liten spiss, slik at ingen Neurotransmitter kan lekke ut, men spissen må være likevel stiv nok til å trenge inn i vevet (figur 2). For eksempel bruke 150 GB F 8P klasse pipetter (Science Produkter, Hofheim, Tyskland) og en horisontal avtrekker (for eksempel en DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland, eller en P-97 Puller, Sutter Instrument selskapet , Novato, CA) med flere rykk skritt for å oppnå en liten åpning, men også en kort tapper med en bratt vinkel (figur 2 og tabell 2).
- Det er også mulig å anvende kvartsglass pipetter for å trekke iontoforetisk 10 pipetter. Disse er ment å ha bedre mekaniske egenskaper og for å være mer pålitelig, men spesielle laser avtrekker er nødvendig. Men det er også mulig å oppnå gode resultater med vanlig glass pipetter, som vanligvis brukes for å trekke patch pipetter.
- Test pipette ytelse og motstand i et kammer uten vev, før du bruker dem for førstetid, kan ettersom lekkasje av glutamat skade vevet.
- Sett opp iontoforese forsterker riktig. Deretter fylle pipette med signalstoffet og fargestoff som inneholder løsning og plassere den i badekaret (ACSF).
- Kompensere kapasitans (figur 3). Vanligvis svært skarpe pipetter vil ha en høyere kapasitans enn sløv seg.
- Sjekk motstanden av pipetten: Mikro-iontoforese forsterker brukt her har en innebygd funksjon for å måle pipette motstand. Det fremkaller korte rektangulære test pulser, som kan overvåkes med en standard oscilloskop eller en A / D styret koblet til en datamaskin med oppkjøpet programvare. Avhengig av formen og spissen størrelse, bør spissen ha en motstand mellom 25-90 MΩ.
- Fokus på tuppen med en 60X eller 40X vannimmersjonsobjektiv og bytte til fluorescerende bildebehandling og hvis mulig, zoome i. Hvis fluorescerende fargestoff lekker ut av pipetten spissen, påfør en liten positiv (i tilfelle av glutamate) eller negativ (i tilfellet av GABA, figur 4) opprettholde strømmen (<0,02 μA). Hvis det ikke hjelper å avbryte lekkasje, endre pipette.
- Anvende et sterkt steg strøm eller bruke den manuelle utløseren og overvåke tuppen i det fluorescerende bildet for å se om løsningen kan bli slynget ut av pipetten. Som nevnt ovenfor er polariteten av den aktuelle puls avhengig av kostnad av molekylet som er ment å bli kastet ut. For å løse ut glutamat det er en negativ strøm, og for GABA en positiv strøm (figur 4).
- Luftbobler i pipette som blokkerer utstøting av fargestoff og senderen, kan ryddet ved å bruke en høy utstøting gjeldende flere ganger.
- Tatt sammen, hvis det ikke er noen synlig lekkasje og test utstøting var vellykket, kompensere kapasitans og starte forsøket.
- Forsiktig: Siden kapasitansen kompensasjon oppnås ved en tilbakekoblingskrets, denne krets kan oversving eller oscillerer hvis det er overcompensated. Forsiktig bruk skalainnstilling for kapasitans kompensasjon.
- Avhengig av avtrekker stabilitet er det noen ganger nødvendig å justere avtrekker innstillinger fra tid til annen, da glødetråden kan ha endret egenskaper. Imidlertid, hvis en gang en god pipette er utformet, kan den brukes i flere dager. Derfor, etter avsluttet eksperiment lagre iontoforetisk pipetten i en lukket beholder uten å ødelegge tuppen.
- For neste eksperimentet fylle pipette med signalstoffet løsning, påfør flere sterke eject pulser for å fjerne tuppen og deretter sjekke om egenskapene (f.eks motstand) vesentlig forandring. Deretter kompensere kapasitans og bruke pipetten igjen. Ikke bruk et enkelt pipette med ulike nevrotransmitter løsninger.
4. Forberede hjernen skiver
- Hvis mikro-iontoforese brukes for første gang definitivt forberede skivene etter å etablere en pålitelig arbeider avtrekker program. <li> Perform anestesi og halshogging prosedyrer i henhold til de animalske omsorg retningslinjer for din institusjon eller lokale myndigheter.
- Etter fjerning av hjernen, overføre den til iskald ACSF sukrose (se protokoll 2.1).
- Skjær regionen av interesse i skiver av passende tykkelse (for eksempel 300 mikrometer).
- Inkuber skivene i ACSF sukrose ved 35 ° C i 30 min. Deretter overfører dem til en neddykket holdekammeret inneholdende normale ACSF ved romtemperatur.
- Gjennom utarbeidelse og eksperimentere carbogenize den ACSF omgir skiver med 95% O 2, 5% CO 2.
5. Etablere en hel-celle opptak
- Plasser iontoforese pipetten (e) allerede nær skive overflaten før lappe en celle, for å unngå langvarig posisjonering, etter etablering av hel-celle-modus.
- Trekk en lav motstand patch pipette (3 - 5 mΩ), fyll den med dye inneholder intern løsning og bruke positivt press på pipetten (30 - 60 mbar).
- Oppgi bad og tilnærming til cellen under visuell veiledning (infrarød Dodt kontrast eller to foton gradient kontrastrikt bilde).
- Overvåk pipette motstand med en test puls (f.eks -10 mV, 20 ms) i spenning klemme modus. Når berøre vevet korrigere offset potensial.
- Nærmer cellen og skyv Pipettespissen inn i det før et "smilehull" kan sees tydelig. Umiddelbart fjerne trykket av pipetten, anvende 40 - 60 mbar undertrykk og slå membranpotensialet til -65 mV.
- Når holdestrømmen når verdier under 100 Pa, slipper undertrykk.
- Etter å etablere en giga tetning (ved> en GΩ), briste membranen med en kort, sterk sugekraft på pipetten eller korte overkompensasjon av kapasitansen Kompensasjon.
- Avhengig av hvilken modus (spenning eller strøm klemme) krevesFor eksperimentell design, kompensere hensiktsmessig.
- Begynn å bringe iontoforetisk pipette til sin endelige posisjon. Hvis en mer detaljert beskrivelse av hvordan man lykkes utføre patch clamp opptak er nødvendig, er det flere gode retningslinjer tilgjengelige 18,19.
6. Plasser iontoforetisk Pipetter og generere en postsynaptic iontoforetisk Potential
- Generelt kan iontoforetisk hendelser bli fremkalt ved definerte steder avhengig av den ønskede eksperimentet, for eksempel, ved en spiny dendritt for glutamat mikro-iontoforese, ved den dendritiske aksel, soma eller akson første segment for GABA mikro-iontoforese.
- Nærmer cellen opp til ca 1 mikrometer avstand uten å berøre den. Etter å ha nådd stillingen av interesse er det avgjørende at ingen nevrotransmitter lekker ut og at pipette kapasitans er kompensert riktig.
- Hvis nærmer cellen med en glutamat fylt iontoforetisk pipette forårsaker påviselig depolarisering av membranen potensial, justere beholde gjeldende hvis mulig, eller endre pipette.
- Påfør korte negative strøm pulser, som starter fra null og øke dagens systematisk (f.eks 0,1 til 0,4 ms, 0,01 til 1 μA pulser). Dette bidrar til å finne ut i hvilken rekkevidde den iontoforetisk nåværende fremkaller de ønskede svarene i den spesifikke eksperimentelle oppsett.
- Hvis det ikke er respons synlig, løfter pipetten flere hundre mikrometer og bruke en sterk eject strøm (> 0,1 μA) for å rense spissen. Juster kapasitans kompensasjon, nærmer cellen, og prøv igjen.
- Hvis det fortsatt ingen respons, redusere beholde nåværende. Vær veldig forsiktig med oppringning innstillinger siden denne prosedyren kan føre til ukontrollert neurotransmitterfrigivning. Derfor kontinuerlig overvåke opptaket for å oppdage respektive endringer i membranpotensialet.
- Hvis det er vanskelig å oppdage gabaergic hendelser, kan det være nyttig å bruke enn indre løsning sammensetning ettergivende i en høy Cl - drivkraft. For å oppnå dette, redusere Cl - konsentrasjonen i pipette løsning (se protokoll punkt 2.6.). Dette vil resultere i større gabaergic hendelser på hvilende membranpotensial på grunn av en høyere drivkraft.
- Alternativt injisere lange gjeldende trinnene resulterer i membran potensielle sjanser fra -100 mV til -48 mV (figur 8C). Med denne protokollen Cl - drivkraften er økt ved hyperpolarized potensialer forårsaker en depolariserende GABA respons.
- Det er også mulig å bruke trinn strøminjiseringen protokoll for å bestemme potensialet for reversering av de fremkalte arrangementer, noe som bidrar til å bestemme den GABAerg natur av hendelsene. Lekkasje av GABA er vanskeligere å oppdage enn lekkasje av glutamat. I dette tilfellet kan en konstant overvåkning av inngangssignalene motstand hjelp, når den GABA fylt pipetten er kontaktet. Hvis input motstand reduseres, beholde nåværende kan be forhøyet eller en annen pipette brukes.
- Som kontroll eksperimenter for glutamat iontophoresis, foreslår vi en Ca 2 + bildebehandling eksperiment, ved hjelp av 200 mikrometer OGB-en og ingen EGTA i pipette løsningen for å visualisere lokale kalsium tilstrømningen som kan være forårsaket av lekker glutamat.
- Generelt, for å oppnå en stabil respons er det meget viktig å ha en mekanisk stabilt pipette for å unngå drift over tid. Drift kan være forårsaket av temperaturendringer, derfor anbefales det å slå på utstyret minst en halv time før målinger for å unngå termisk drift. Pass på å bruke god patron seler i pipetteholder og spissen er virkelig fast. Selve holderen kan i tillegg festes med Teflon tape, og videre, sørg for at det ikke er spenning på kablene fra headstage eller manipulator, som også er en potensiell kilde til drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkel metode for å bestemme den romlig spredning av iontoforese er å trekke tilbake den iontoforetisk pipette trinnvis fra Dendritt, samtidig som mates ut glutamat konstant. Vi fant at den romlige utstrekningen av en mikro-iontoforetisk stimulering hadde en diameter på omtrent 12 um (figur 1 som viser radius). Hvor dypt i vevet på iontoforese kan brukes, avhenger av stivheten av pipetten. Imidlertid iontoforetisk pipetter som trengs for eksperimenter i stykker (fig. 2), som er brukt her, ikke er begrensende dybden av penetrering. Snarere det optiske systemet og den avtagende oppløsningen i dybden av hjernen skive er den begrensende faktor. For en god kvalitet opptak er det avgjørende at ingen sender lekker ut av pipetten. I tilfelle av glutamat, kan en lekkasje bli identifisert hvis det er en plutselig depolarisering når dendritt er kontaktet med pipettespissen eller hvis grunnlinjen blir plutseligustabil (figur 5). Etter å etablere et stabilt opptak, er det mulig å fremkalle epsps av definerte amplituder, dendrittiske pigger eller aksjonspotensialer med denne teknikken på hvilket som helst sted i hele dendrittiske treet (figur 6). Ved å anvende glutamat med rask mikro-iontoforese, egenskapene til epsps, deres formering og summering, samtidig på forskjellige selv fjerntliggende steder, kan bli undersøkt (figur 7). Gabaergic hendelser kan bli fremkalt alene eller i tillegg til glutamat med en andre pipette ved å fylle pipetten iontoforetisk med en meget konsentrert GABA-løsning (se: Protokoll delen 2), og en positiv strøm utmating. Det er en enkel protokoll for å bekrefte gabaergic arten av de hendelser og for å gjøre gabaergic hendelser lettere å oppdage, om ikke ved hjelp av en høy drivkraft indre løsning: Injiser negative strømmer (ca. 1 sekund; amplituden avhenger inngangsmotstand av den celle) som resulterer i hyperpolarising voltage trinn, som starter på rundt -100 mV og deretter øke i 5 mV trinn (Figur 8). Ved svært negative potensialer gabaergic arrangementer er lettere å oppdage på grunn av den høyere drivkraft. Og hvis signalene reversere rundt den beregnede Cl - reversering potensial for løsningene, er det svært sannsynlig at de er GABAergic i naturen (Figur 8). Med en ekstra GABA mikro-iontoforetisk pipette, er det mulig å undersøke, for eksempel effekten av GABAerg inhibering på glutamatergic arrangementer, som dendrittiske natrium / kalsium pigger, ved å variere de relative tidspunktene for dendrittiske pigg og IPSP (figur 9), kan relative plasseringen av både hendelser, eller deres amplituder. (Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med retningslinjene for Animal Care og bruk komité ved Universitetet i Bonn, den tyske Center for nevrodegenerative sykdommer og staten Northrhine-Westfalia.)
Figur 1. Utstrekningen av iontophoretically utløst glutamat bestemmes av pipette dementi. A) Maksimal intensitet projeksjon av en to-foton-bilde av en CA1 pyramideformet celle dendritt fylt med 100 mM Alexa 594 og den iontoforetisk pipetten i den første stilling (Målestaven 8 mikrometer). Innfellinger viser tilbaketrekking av iontoforetisk pipette og tilsvarende iontoforetisk EPSP registrert på soma. Pilen viser posisjonen til iontoforetisk pipette spissen. B) Avstand avhengighet av EPSP amplituder i forhold til den opprinnelige plasseringen av iontoforetisk pipette spissen (≤ 1 mikrometer unna dendrite, n = 6 avdelinger). Med dette kan vi beregne radius av glutamat spres ved systematisk trekke pipetten. Innfelte viser representativt eksempel spor. Feil søylene representerergjennomsnitt ± SEM. (Tilpasset fra Müller et al. 2012 9, gjengitt med tillatelse fra Elsevier).
Figur 2. Hvordan en iontoforetisk pipette bør se ut. A) Infrarød CCD bilde av en iontoforetisk pipette sammenlignet med en liten 5,5 MΩ patch pipette med en 60X objektiv. B) iontoforetisk pipette med skala ved hjelp av en 60X objektiv. Kalibrering: minste = 10 mikrometer.
Figur 3. Kapasitans kompensasjon av iontoforetisk pipette med bygge i test-puls (10 nA, 10 ms, NP elektronisk, Tamm,Tyskland). Det er viktig å kompensere kapasitansen riktig for å overvåke riktig pipette motstand og for å sikre rask og nøyaktig nevrotransmitter søknad.
Figur 4. Prinsipper for mikro-iontoforese. A) Skjematisk tegning av en CA1 pyramidal nevroner i hele cellen patch-clamp konfigurasjon og en iontoforetisk pipette fylt med glutamat. Glutamat er negativt ladet, derfor en positiv strøm som brukes på pipetten vil holde den lekker ut av pipetten: The beholde strømmen er positiv (venstre panel). For å løse ut glutamat fra pipette, gjelder en negativ strøm (høyre panel). På denne måte glutamat er tvunget ut av pipetten og kan fremkalle eksitatoriske hendelser i den postsynaptiske celle. B) Skjematisk tegning av CA1 pyramideformet nevroner i hele cellen patch-clamp konfigurasjon og en iontoforetisk pipette fylt med GABA. GABA er positivt ladet ved en lav pH. Derfor vil en negativ strøm holde den lekker ut av pipetten (venstre panel). For å løse ut GABA bruke en positiv strøm (høyre panel). På denne måten GABA kommer ut av pipetten og kan fremkalle hemmende hendelser i den postsynaptiske celle.
Figur 5. Gode og dårlige iontoforetisk pipetter. A) Representant eksempel på en iontoforetisk glutamatergic EPSP generert på dendrittiske gren av en CA1 pyramidal neuron. B) Representant eksempel på en iontoforetisk dendrittiske pigg generert en dendrittiske gren i CA1 området av hippocampus med pågående mild glutamat lekkasje fra pipette spissen.
Figur 6. Representative resultater for enkelt glutamat mikro-iontoforese. A) Skjematisk tegning av en oppdatert CA1 pyramidal nevroner og en iontoforetisk pipette fylt med glutamat. B) EPSP fremkalt i en CA1 pyramidal neuron med glutamat iontoforese. C) Dendritic Na + / Ca 2 + pigg fremkalt på en proksimal dendrite av en CA1 pyramideformet nervecellen, viser lavere spor skråningen av spenning spor, indikerer peak toppen skråningen av dendrittiske pigg. D) Når man øker strømmen tilført den iontoforetisk amplituden av EPSP vil øke fram til den krysser aksjonspotensial terskel.
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/>
Figur 7. Representative resultater for dobbel glutamat mikro-iontoforese på forskjellige steder på dendrittiske treet. A) Skjematisk tegning av en lappet CA1 pyramideformet neuron og to iontoforetisk pipetter fylt med glutamat, som er plassert på en proksimal og en distal dendritt, henholdsvis. B) iontoforetisk EPSP fremkalt på en proksimal dendritt av en CA1 pyramideformet neuron (1). C) iontoforetisk EPSP fremkalt ved en distal dendritt (2).
Figur 8. Representative resultater for GABA mikro-iontoforese. A) Skjematisk tegning av en oppdatert CA1 pyramidal nevroner og en iontoforetisk pipette fylt med GABA.B) iontoforetisk IPSP fremkalt på en proksimal dendritt av en CA1 pyramideformet neuron. C) Lang strøminjiseringen av systematisk å endre amplitudene til en CA1 pyramideformet nevron via plasteret pipette, for å bestemme reversering potensial fremkalt arrangementet (løpende injeksjoner fra -400 pA til 0 Pa). Artifact indikerer tid-point av GABA iontoforese. Den fremkalt hendelse indikerer en reversering potensial på omtrent -70 mV (pil).
Figur 9. Representative resultatene av samtidige glutamat og GABA iontoforese å undersøke integrering av hemming og eksitasjon. A) Skjematisk tegning av en oppdatert pyramideformet nevroner og en pipette fylt med glutamat (grønn) og videre med GABA (oransje). B) Iontophoretically fremkaltdendrittiske toppene alene, i senere feier, lavere spor viser dV / dt, topper indikerer dendrittiske pigger. C) Iontophoretically vakte IPSP alene. D) Både glutamatergic og GABAergic arrangementer sammen.
| Beliggenhet spesifisitet | Senderen spesifisitet | Toksisitet / bivirkninger | Presynaptiske stimulering | Langsiktig eksperiment | Kostnader / kompleksitet | |
| Micro-iontoforese | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-foton uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Synaptic stimulering | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabell 1. . Sammenligning av ulike teknikker Fordeler og ulemper ved teknikker for å stimulere nevroner i henhold til ulike kriterier (- = dårlig, + = ikke optimal, + + = bra, + + + = best).
| Patch pipetter | Iontoforetisk pipetter | |||
| Pre-trekker P (A) En pull | Siste Pull P (B) | Pre-trekker P (A) Enkeltrom Pull | Siste Pull P (B) | |
| Heat H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Force Pre Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Avstand Threshold s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Delay VARMESTOPP t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Avstand VARMESTOPP s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Delay F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Tvinge Trekk en F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Avstand Pull 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Tvinge Trekk to F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Juster (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabell 2. Exemplarily avtrekker protokollen. For en horisontal avtrekker (DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland), ved hjelp GB150F-8P filamenter (Science Produkter, Hofheim, Tyskland) for både lapp og iontoforetisk pipetter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her forklarer vi hvordan du søker rask mikro-iontoforese av nevrotransmittere å undersøke synaptiske integrasjon på dendritter. Denne teknikken har blitt brukt til å undersøke glutamatergic og GABAergic synaptisk transmisjon i ulike områder av hjernen in vitro og in vivo 9,20-22. Micro-iontoforese har vært brukt i mer enn 60 år, men i tidlige år ble det mest brukt til enten lokalt gjelder nevrotransmittere og narkotika på langsom eller middels tidsskalaer 23 eller for mikroinjeksjon av stoffer i cellene 24.
Micro-iontoforese ble et spesielt interessant verktøy for å studere dendrittiske integrasjon siden innføringen av forsterkere, som er utstyrt med en rask kapasitans kompensasjon for høy motstand elektroder 10,11. Med denne forbedringen ble det mulig å søke korte rektangulære iontoforetisk strømninger som resulterer i postsynaptiske svar, som Resembled mer realistisk tiden løpet av synaptiske hendelser 10,25.
Hvilke tekniske krav og vanskeligheter med å forholde seg til, ved etablering av mikro-iontoforese? En iontoforetisk forsterker er nødvendig som gir mulighet for kompensering av høy kapasitans av de fine iontoforetisk pipetter. Den korrekte innstilling av kapasiteten kompensasjon er meget viktig hvis drift med høy hastighet i forbindelse med høy motstandsevne mikroelektroder er nødvendig. Kompenserte tilfeldige kapasitanser belastes fra iontoforetisk strømmen som leveres av instrument, og derfor bremser søknad. Kompenserende kapasitans ordentlig er avgjørende og forklart i detalj i videoen. I tillegg er det viktig at det optiske system gir et godt bilde av den fluorescerende dendritt og den iontoforetisk pipette uten å indusere foto-skade av vev. Optimalt bruke en to-foton-systemet og redusere lasereffekten og holdetider så mye som er kompatibel meden anstendig bildekvalitet. Hvis en mer konvensjonell lyskilde blir brukt, sørge for å redusere eksponeringstiden så mye som mulig, for eksempel, ved å bruke mekaniske eller elektriske skodder trigging. Trolig det mest kritiske punkt er pipetteutforming, som vil tillate for en definert og spesifikk anvendelse av nevrotransmitter benyttes. Dette trinnet krever litt innsats og tid for å finne de optimale innstillingene. Her presenterer vi protokoller for glutamat og GABA iontoforese, hvis andre nevrotransmittere, blokkere eller modulatorer blir brukt, er det nødvendig at stoffet er sterkt konsentrert, og enda viktigere er at den er ladet. For eksempel, siden GABA har en nettoladning på null ved en pH-verdi på 0, er den pH som skal justeres (se pkt. 2 Protocol), som resulterer i en netto positiv ladning.
Når mikro-iontophoresis er etablert, vil det gi en utvidet verktøysett for å studere synaptiske integrering i nerveceller. Den lar stimulerende synapser av interesse selektivt meden bestemt nevrotransmitter. Ved hjelp av en valgt nevrotransmitter på definerte steder, postsynaptiske strømninger og potensialer og deres forplantning kan etterforskes. Videre er det mulig å bruke flere iontoforetisk elektroder samtidig for å undersøke integrering av flere glutamatergic innganger eller systematisk forandre den relative tidspunkt eller styrken av hendelser.
Noen generelle kritiske punkter må vurderes ved bruk av mikro-iontoforese. Profilen av nevrotransmitter konsentrasjon etter mikro-iontoforese er forskjellig fra endogene frigjøring. Murnick og andre ti rapporterte at hastigheten på utgivelsen fra iontoforese spissen (ca 1 ms) vil sannsynligvis være betydelig tregere enn synaptiske utgivelse fra vesikler, som oppstår i løpet av brøkdeler av et millisekund (0,2 ms) 26. Dessuten er diffusjon til og fra den synaptiske spalten sannsynlig avtagende konsentrasjon stige og forråtnelse av iontophoretically anvendt nevrotransmittere.Videre er volumet av utløst nevrotransmitter trolig høyere enn fysiologisk utgitt volumer, men med høy motstand elektroder, enkelt glutamatergic og gabaergic postsynapses kan aktiveres ved hjelp av mikro-iontoforese 10-12. En romlig selektivitet i størrelsesorden noen få mikrometer har også nylig blitt oppnådd ved to-foton uncaging av nevrotransmittere 3,4,27.
Mens betraktelig mer kost intensiv, har to-foton uncaging flere fordeler fremfor mikro-iontoforese. Spesielt kan den brukes til å frigi nevrotransmitter samtidig på flere steder synaptiske og krever ikke den nøyaktige posisjonering av et fint elektrodespissen. Imidlertid har den også noen viktige ulemper som må vurderes ved valg av en fremgangsmåte for et spesielt eksperiment. Mange bur forbindelser ha uønskede bivirkninger som blokaden av nevrotransmitterreseptorer 28. For eksempel har mange glutamat og GABA burhar blitt rapportert å forstyrre GABAerg hemming. Dessuten kan den relativt høye lasereffekten som kreves for to-foton uncaging resultere i foto-skade av den postsynaptiske nevroner, særlig når stimulering påføres gjentatte ganger i løpet av flere minutter. Videre, mens mikro-iontoforese er begrenset i antall stimulerte områder, kan disse områdene velges fritt på hele treet dendrittiske av et nevron, for eksempel på de distale og basal dendritter, for å simulere lagdelte synaptiske inndata fra forskjellige områder av hjernen. To-foton uncaging, som det er i dag brukt av de fleste gruppene, vil bli begrenset til synaptiske områder i en bestemt fokusplan og i synsfeltet, som avhenger av målet som brukes (vanligvis 40X eller 60X nedsenking i vann). Det må tas i betraktning at begge teknikkene alltid føre til aktivering av extrasynaptic reseptorer, noe som kan gjøre tolkningen av resultatene vanskelig.
En annen ulempe ved mikro-iontoforese er at only den postsynapse kan aktiveres. Hvis presynaptisk funksjon og rollen til vesikkel-utgitt neurotransmitter må settes inn i den eksperimentelle fokus, kan lokal elektrisk stimulering synaptiske være en metode for valg. Men ulempene ved elektrisk stimulering synaptiske sammenlignet med mikro-iontoforese er det ukjente sted av de aktiverte synapser og co-aktivering av aksoner fra forskjellige nevronale populasjoner, potensielt tilhører andre nervesystemer (tabell 1).
Oppsummert den viktigste fordelen av mikro-iontophoresis er, etter vårt syn, at det er mulig å bruke flere forskjellige nevrotransmittere og å studere deres interaksjon på nevrale avdelinger som dendrites ni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann og Walker Jackson for å lese nøye manuskriptet. Forfatterne fikk støtte som ble gitt av departementet for forskning MIWF av staten Northrhine-Westfalia (SR), BMBF-Projekträger DLR US-tysk samarbeid i beregningsorientert nevrovitenskap (CRCNS; SR), Centers of Excellence i nevrodegenerative sykdommer (COEN; SR), og Universitetet i Bonn egenutført finansiering program (BONFOR; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
