Summary
В этой статье мы представляем быстрая микро-ионофореза нейромедиаторов как метод для исследования интеграции постсинаптических сигналов с высокой пространственной и временной точности.
Abstract
Одним из фундаментальных интересов в области неврологии, чтобы понять интеграции возбуждающих и тормозящих входов по очень сложной структурой дендритных дерева, которое в итоге приводит к выходу нейронов потенциалы действия в аксона. Влияние различных пространственных и временных параметров конкретного синаптических входных нейронов на выход в настоящее время исследуется, например, расстояние-зависимое затухание дендритных входов, расположение-зависимое взаимодействие пространственно отделены входов, влияние GABAergig ингибирование возбуждающих интеграции, линейный и нелинейный режимы интеграции, и многое другое.
С быстрым микро-электрофорез глутамат и ГАМК можно точно исследовать пространственную и временную интеграции глутаматэргическую возбуждения и ГАМК-торможения. Критические технические требования либо срабатывает лампа дневного света, светодиодные (LED), или двухфотонного SCAnning микроскоп для визуализации дендритных ветвей без введения значительных фото-повреждения ткани. Кроме того, очень важно иметь микро-электрофорез усилитель, который обеспечивает быструю компенсацию емкости высокого пипетки сопротивления. Другим важным моментом является то, что ни передатчика не невольно выпущен пипетки во время эксперимента.
Как только установлено, этот метод будет давать надежные и воспроизводимые сигналы с высокой нейротрансмиттера и расположение специфичности. По сравнению с глутамат и ГАМК uncaging, быстро ионофореза позволяет использовать оба передатчика одновременно, но в очень отдаленных местах без ограничений в поле зрения. Есть также преимущества по сравнению с координационным электрической стимуляции аксонов: с микро-электрофорез расположение входной участок точно известно и то, что только нейромедиатора интерес будет отпущена. Однако необходимо учитывать, что с микро-электрофорез толькоpostsynapse активируется и пресинаптических аспекты высвобождения нейротрансмиттеров не решен. В этой статье мы покажем, как создать микро-ионофореза в экспериментах среза мозга.
Introduction
Нейроны в центральной нервной системе получать различные синаптических входов на их тонкими и разветвленной дендритных процессов 1. Там, большинство возбуждающих входов дендритных опосредованы глутаматэргическую синапсов. Эти синапсах может быть активирована в пространственно распределенных способом, в результате чего постсинаптических линейный интеграции возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП). Если синапсы активизируются одновременно и в пространственной близости на дендритов, эти возбуждающие входы могут быть интегрированы сверх-линейно и генерировать 2-5 дендритных шипов.
Кроме того, интеграция возбуждающих входов зависит от местоположения входа на дендритных дерева. Сигналы, которые поступают в дистальной области пучок гораздо более ослабленной, чем проксимальных входов из-за кабеля фильтрацию 6. В гиппокампе далеких вклад в дендритов пучки генерируются другой регион мозга, чем те, на проксимальных dendriTES 7. Волнующий вопрос поэтому, что синаптические Ввод обрабатывается различными отсеками дендритных и если дендритных интеграции регулирует влияние этих слоистых входы нейронов по-разному.
Не только функциональные свойства, морфологические характеристики дендрита, расположение и кластеризации входы, влияющих на дендритных интеграции возбуждающих входов, а также дополнительные входы ингибирующее от ГАМКергических терминалов решающей определить эффективность глутаматэргическую синапсов 8,9. Эти различные аспекты синаптической интеграции может быть идеально исследованы с помощью нейромедиатора микро-электрофорез, что позволяет пространственно определенных применение различных нейротрансмиттеров в дендритных доменов. Мы демонстрируем здесь, как успешно установить микро-ионофореза глутамата и ГАМК расследовать интеграции сигнала в нейронах.
Для этого приложения, с острым концомвысокого сопротивления пипетки заполнены концентрированных растворов нейромедиатора используются. Эти пипетки расположены близко к наружной мембране клетки, где рецепторы нейротрансмиттеров расположены. Хорошим визуализации дендритных ветвей не требуется. Это лучше всего достигается с использованием флуоресцентных красителей, которые вводятся через патч пипетки. Затем очень короткий (<1 мс) импульса тока (в диапазоне 10 - 100 нА) используется для извлечения заряженных молекул нейромедиаторов. С помощью этих коротких импульсов и эффективной компенсации емкости, постсинаптические потенциалы или токи могут быть вызваны с высокой временной и пространственной точностью, что означает, что расположение возбуждающих входных точно известно. Глутамат микро-ионтофореза может активировать синапсов в определенный радиус, который меньше, чем 6 мкм, как показано ниже (рис. 1 9), но также можно достичь одним разрешение синапс 10-12.
Heine, М., и др. 13. С быстрым микро-ионофореза это легко можно использовать два или более ионтофоретическая пипетки и разместить их на разных, даже далеких пятна на дендритных дерева. Таким образом, интеграция возбуждающих событий, в том числе из различных путей, могут быть исследованы. Кроме того, можно использовать глутамат и ГАМК заполненные ионтофоретическая пипетки в то же время. Таким образом, эффект ингибирования ГАМК в разных местах по отношению к возбуждающим входа (на пути, вне пути ингибирования) могут быть изучены. Кроме того, влияние ингибирования интернейроны ориентированные на конкретные нейронные доменов, как и дистальных дендритов, сомы или аксонов 14, можно исследовать с помощью ГАМК ионофореза. В культивируемых нейронах, быстрый микро-электрофорез дает возможность INVEstigate одного синапса и распределения элементарных аспектов синаптические связи нейронов в гораздо более подробно 10,11.
В данной статье мы опишем подробно, как установить глутамата и ГАМК ионтофорезом для применения в острых кусочков мозга, который позволяет исследовать синаптической интеграции возбуждающих и тормозящих входов в зависимости от расположения входа, входные сильные стороны, и сроки, самостоятельно или во взаимодействии. Мы выделим преимущества и недостатки этой методики и способы устранения успешно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Системные требования
- Микроскоп система: хорошей визуализации дендритов имеет решающее значение. Если возможно, используйте двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа системы. В наших экспериментах мы использовали TRIM Сфера II, LaVision Биотек, Билефельд, Германия или Ultima IV системы, Prairie Technologies, Миддлтон, Висконсин оснащен Ti: Sapphire сверхбыстрых импульсных лазера (Chameleon Ultra II, когерентные) и высокой цели, NA (60X, 0,9 NA, Olympus) для визуализации дендритов, которые мы заполнены флуоресцентным красителем через патч пипетки. Хотя фото-повреждения считается менее тяжелым, используя 2-фотон сканирования, уменьшить мощность лазера (ниже 8 мВт на ткани) и времени выдержки (менее 1 мкс) или в максимально возможной степени.
- Вторая возможность, чтобы вызвать широким полем флуоресценции источник света (LED или флуоресцентная лампа) синхронно с приобретением уменьшить время экспозиции в максимально возможной степени. Мы использовали монохроматор с встроенным источником света (TILLPhoтоники, Gräfelfing, Германия) на Zeiss Axioskop 2 FS прямой микроскоп который был оснащен Dodt контрастностью инфракрасной подсветки (TILLPhotonics, Gräfelfing, Германия). В наших экспериментах экспозиции обычно колебалась от 10 мс до макс. 30 мсек.
- Используйте быстрый микро-ионофореза усилителя, например, двух-канальный микро-ионофореза системы MVCS-C-02 (НПИ электронные, Тамм, Германия) с быстрой компенсации емкости. Остроконечного микроэлектродов ионофореза иметь сопротивление 25 - 100 МОм (решающей в зависимости от размера наконечника и форму пипетки) и быстрое время роста может быть достигнуто только, если емкость компенсации дл ионофореза усилитель оптимально настроены. Это быстрый компенсации необходимо применять импульсов тока с кратким и быстрым наступлением в суб-миллисекундного диапазона дл ионофореза пипетки и, таким образом, чтобы извлечь передатчик с высоким пространственным разрешением в месте размерами менее 1 мкм 13. Ионофорез усилители др.так можно получить из нескольких других компаний, которые мы не тестировали в нашей лаборатории. Эти устройства к нашим знаниям не оборудованы емкости схемы компенсации.
2. Готовят растворы
- Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) и внутреннее решение, как это требуется для эксперимента. Единственное дополнение к внутренним решением, которое требуется, является красным или зеленым флуоресцентным красителем (например, от 50 до 200 мкМ Alexa Fluor 488 или 594 гидразид, Invitrogen), в зависимости от оптического оборудования. Здесь пример ACSF сахароза которые могут быть использованы для вскрытия, в мМ: NaCl, 60, 100 сахарозы, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 CaCl 2, MgCl 2, 5, 20 глюкозы, и для нормального ACSF решение для патч-зажим эксперименты в мм: 125 NaCl, KCl 3, 1,25 Na 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 15 глюкозы.
- Carbogenize (95% O 2, 5% СО 2) все внеклеточной решения постоянно.
- Подготовьте внутренний раствор, например, в мМ: 140 K-глюконат, 7 KCl, 5 HEPES-кислоты, 0,5 MgCl 2, 5 фосфокреатина, 0,16 EGTA; с 50 - 200 мкМ Alexa 488.
- Для глутамата микро-электрофорез получения раствора 150 мМ глутаминовой кислоты и доведения рН до 7,0 с помощью NaOH. Добавить 50 -200 мкм Alexa Fluor 488 или 594 гидразидом (Invitrogen) для визуализации.
- Для ионофореза ГАМК подготовить 1 М ГАМК на растворение и довести рН до 5 с помощью HCl 15. При этом значении рН ГАМК заряжен, только тогда он может применяться с использованием ионофореза. Пожалуйста, обратите внимание, что низкий рН раствора выбрасываются в межклеточное пространство могут быть проблемы ГАМК самой передачи 16,17.
Защитите ГАМК решение от света и часто готовить свежий ГАМК раствора, так как пожилые решение может потерять свою эффективность. - Если это трудно понять, ГАМКергическими события, приветGH Cl - движущая сила внутреннего решения, например, оставляя KCl, может помочь визуализировать ГАМКергическими событий, чтобы убедиться, ГАМК ионтофорезом работает, однако для исследования синаптической интеграции физиологических движущей силой может быть рекомендовано. Для общего обнаружения малых ГАМКергическими событий, протокол показано на рисунке 8C может помочь.
3. Потяните и тестирование Ионофорез Пипетки
- В общем, потянув правую пипетки может быть, самый важный шаг для достижения контролируемого ионтофорезом нейромедиатора. При использовании ионофореза в клеточной культуре, можно вытащить очень тонких электродов похожа на острый микроэлектродов 10. В патч-зажим экспериментов при остром ломтиками, однако, эти очень тонкой пипетки сгибать на часть поверхности, когда они опущены в ткань с углом, что делает невозможным достичь глубокого дендритов.
- Поэтому тянуть пипетки с очень маленькими чаевыми, так что нет нeurotransmitter может просочиться, но кончик должен быть еще достаточно жесткими, чтобы проникать в ткани (рис. 2). Например, можно использовать 150 ГБ F 8P класса пипетки (Наука Продукция, Hofheim, Германия) и горизонтальных съемник (например, DMZ-Универсальный съемник, Цайца-Instruments GmbH, Martinsried, Германии, или Р-97 Съемник, Саттер Instrument Company , Novato, CA) с несколькими шагами потянув достичь небольшого отверстия, а также короткий конусность с крутым углом (рисунок 2 и таблицу 2).
- Кроме того, можно использовать кварцевый стеклянных пипеток тянуть ионтофоретическая пипетки 10. Они должны иметь лучшие механические свойства и более надежными, однако специальные съемники лазер не требуется. Но также возможно достичь хороших результатов при обычной пипетки стекла, которые обычно используются для вытягивания патч пипетки.
- Проверьте производительность пипетки и сопротивление в камере без ткани, прежде чем использовать их в первыйвремени, так как утечки глутамата может повредить ткань.
- Настройка усилителя ионтофорезом правильно. Затем заполнить пипетку с нейромедиатором и раствор, содержащий краситель и поместить его в ванну (ACSF).
- Компенсировать емкость (рис. 3). Как правило, очень резкий пипетки будет иметь более высокую емкость, чем те, тупые.
- Проверьте сопротивление пипетки: микро-ионофореза усилителя, используемого здесь имеет встроенные функции для измерения сопротивления пипетки. Это вызывает краткое прямоугольных импульсов тест, который может контролироваться со стандартным осциллографа или A / D платы подключен к компьютеру с приобретением программного обеспечения. В зависимости от формы и размера наконечника, наконечник должен иметь сопротивление между 25 - 90 МОм.
- Сфокусируйтесь на кончике с 60X или 40X цель погружения воды и перейти на флуоресцентные изображения и, если возможно, увеличить дюйма Если флуоресцентный краситель утечки из кончика пипетки, нанесите небольшое положительное (в случае Glutamate) или отрицательным (в случае ГАМК, рисунок 4) сохранить ток (<0,02 мкА). Если это не поможет, чтобы отменить утечка, изменение пипетки.
- Применить сильный текущий шаг или использовать ручной запуск и мониторинг чаевые в флуоресцентное изображение, чтобы увидеть, если решение может быть выброшен из пипетки. Как упоминалось выше, полярность импульса тока в зависимости от заряд молекулы, которая должна быть извлечена. Чтобы извлечь глутамата это негативный тока и для ГАМК положительного тока (рис. 4).
- Пузырьки воздуха в пипетку, которые блокируют выброс красителя и передатчик, могут быть устранены путем применения высокого выброса текущем несколько раз.
- Взятые вместе, если нет видимых утечек и тест выброса была успешной, компенсировать емкость и начать эксперимент.
- Внимание: Так как емкость компенсация достигается за счет цепи обратной связи, эта схема может превышать или вибрировать, если это overcompensated. Аккуратно с помощью диска настройки для компенсации емкости.
- В зависимости от стабильности съемника иногда бывает необходимо настроить параметры съемника время от времени, так как нить может изменились свойства. Однако, если один раз хорошо пипетки предназначен, он может быть использован в течение нескольких дней. Таким образом, после окончания эксперимента хранить ионтофоретическая пипетки в закрытом контейнере без повреждения наконечника.
- Для следующего эксперимента заполнить пипетку с нейромедиатором решения, применять несколько сильных извлечения импульсов для очистки наконечника и затем проверить, если свойства (например, сопротивление) существенно измениться. Затем компенсации емкости и использовать пипетку снова. Не используйте одну пипетку с различными решениями нейромедиатора.
4. Подготовьте срезах мозга
- Если микро-электрофорез используется в первый раз определенно подготовить ломтиков после установления надежного рабочего съемник программы. <li> Perform анестезии и обезглавливания процедур в соответствии с животным принципы ухода вашего учреждения или органа местного самоуправления.
- После удаления мозга, передать его на ледяной сахароза ACSF (см. Протокол 2.1).
- Cut интересующей области на кусочки соответствующей толщины (например, 300 мкм).
- Инкубируйте срезов в сахарозе ACSF при 35 ° С в течение 30 мин. Впоследствии, перенесите их в подводном холдинга камеру, содержащую нормальное ACSF при комнатной температуре.
- В ходе подготовки и эксперимента carbogenize ACSF окружающих ломтики с 95% O 2, 5% СО 2.
5. Создание Цельноклеточная записи
- Поместите ионофореза пипетки (ы) уже около срез поверхности перед исправления клетке, чтобы избежать длительного позиционирования, после установления цельноклеточной режиме.
- Потяните низкое сопротивление патч пипетки (3 - 5 МОм), залейте его Dвы содержащий внутренний раствор и применяют положительное давление в пипетку (30 - 60 мбар).
- Введите ванной и подход ячейку под визуального наведения (инфракрасный отличие Dodt или два фотона контраста изображения градиент).
- Монитор пипетки сопротивления с тестового импульса (например, -10 мВ, 20 мс) в режиме напряжения зажима. При прикосновении к ткани исправить смещение потенциала.
- Подойдите к клетке и аккуратно нажмите на наконечник пипетки в нее, пока "ямочка" хорошо видно. Сразу сброса давления из пипетки, применяют 40 - 60 мбар отрицательное давление и переключение мембранного потенциала до -65 мВ.
- Когда удерживающий ток достигает значения ниже 100 пА, отпустите отрицательным давлением.
- После установления гига уплотнение (сопротивление> 1 ГОм), разрыв мембраны с коротким, сильное всасывание в пипетки или краткого сверхкомпенсация схемы компенсации емкости.
- В зависимости от выбранного режима (напряжения или токовые клещи) требуетсяна опытно-конструкторских компенсировать соответствующим образом.
- Начинают приносить ионтофоретическая пипетки в свою окончательную позицию. Если более подробное описание того, как для успешного выполнения записи патч зажим необходимо, есть несколько превосходных руководящими принципами 18,19.
6. Поместите Iontophoretic пипетки и генерации Постсинаптические Iontophoretic Потенциальные
- В общем, ионтофоретическая события могут быть вызваны в определенных местах в зависимости от желаемого эксперимент, например, в колючих дендритов на глутамат микро-ионофорез, на дендритных вала, сома или аксон начальный сегмент для GABA микро-ионофореза.
- Подойдите к клетке примерно до 1 мкм расстоянии, не касаясь его. После достижения положения интерес очень важно, чтобы не нейромедиатора не утекает, и, что емкость пипетки компенсируется правильно.
- При приближении к камере с глутаматом заполнены ионтофоретическая pipettэлектронной вызывает обнаруживаемых деполяризации мембранного потенциала, отрегулируйте сохранить текущие если это возможно, или изменить пипетки.
- Применить короткие отрицательные импульсы тока, начиная с нуля и увеличить текущие систематически (например, 0,1 - 0,4 мс, 0,01 - 1 мкА импульсов). Это помогает выяснить, в каких диапазоне ионтофоретическая текущего вызывает нужной реакции в конкретной экспериментальной установки.
- Если нет ответа обнаруживается, поднимают пипетку несколько сотен микрометров и применяют сильную выброса тока (> 0,1 мкА) для очистки наконечника. Отрегулируйте емкости компенсации, подойти к клетке, и повторите попытку.
- Если до сих пор нет ответа, уменьшить сохранить существующих. Будьте очень осторожны с набором параметров, так как эта процедура может привести к неконтролируемому выбросу нейромедиатора. Таким образом, постоянно контролировать запись обнаружить соответствующие изменения мембранного потенциала.
- Если трудно обнаружить ГАМКергических событий, это может быть полезно использоватьN Внутренний композиционное решение уступая в высоком Cl - движущая сила. Для достижения этого необходимо снизить Cl - концентрации в растворе пипетки (см. раздел 2.6 протокола.). Это приведет к большей ГАМКергических событий на мембранный потенциал покоя из-за более высокой движущей силой.
- Кроме того, вводят длительном течении шаги в результате чего шансы мембранного потенциала от -100 мВ до -48 мВ (рис. 8С). С помощью этого протокола Cl - движущая сила увеличивается при гиперполяризованным потенциалов вызывает деполяризующие ГАМК ответа.
- Кроме того, можно использовать шаг текущего протокола инъекции, чтобы определить изменение потенциала вызывали события, которое помогает определить ГАМКергических характер событий. Утечка ГАМК труднее обнаружить, чем утечки глутамата. В этом случае постоянный мониторинг входного сопротивления может помочь, когда ГАМК заполнены пипетки подходили. Если входное сопротивление уменьшается, ток может сохранить Bэлектронной увеличена или другого пипетки должны быть использованы.
- В контрольных экспериментах на глутамат ионофорез, мы предлагаем Са 2 + визуализации эксперимент с использованием 200 мкМ OGB-1 и не EGTA в пипетку решение для визуализации местный приток кальция, которые могут быть вызваны утечки глутамата.
- В общем, для достижения стабильной ответ очень важно иметь механически стабильным пипетки, чтобы избежать дрейфа во времени. Дрейф может быть вызвана изменением температуры, поэтому рекомендуется для переключения на оборудовании по крайней мере, за полчаса до измерения, чтобы избежать теплового дрейфа. Обязательно используйте хорошее уплотнение картридж в держатель пипетки и наконечника действительно исправлена. Держатель само по себе может быть дополнительно зафиксирована с тефлоновой ленты, кроме того, убедитесь, что нет напряжения на кабели от Headstage или манипулятора, которая также является потенциальным источником дрейфа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Простой подход для определения пространственного распространения ионофореза втягивается ионтофоретической пипетки ступенчато от дендрита, сохраняя при этом выбрасывается глутамата постоянной. Мы обнаружили, что пространственные масштабы микро-ионтофоретическая стимуляции имели диаметр примерно 12 мкм (фиг.1, показывающее радиус). Как глубоко в ткани ионтофореза можно использовать, зависит от жесткости пипетки. Тем не менее, дл ионофореза пипетки необходимых для экспериментов в срезах (рис. 2), которые используются здесь, не являются ограничивающими глубину проникновения. Вместо оптической системы и уменьшения разрешения в глубине среза мозга является ограничивающим фактором. Для хорошего качества записи очень важно, что ни передатчика не утекает через пипетку. В случае глутамат, утечки могут быть определены, если есть внезапный деполяризации дендритов, когда подходили с кончика пипетки или если вдруг становится базовымнеустойчивым (рис. 5). После установления стабильного записи, можно вызвать ВПСП определенной амплитуды, дендритные шипы или потенциалов действия с этой техникой в любом месте в течение дендритных дерева (рис. 6). Применяя глутамата с быстрым микро-электрофорез, свойства ВПСП, их распространение и суммирование, одновременно в разных даже отдаленных местах, может быть исследована (фиг. 7). ГАМКергических события могут быть вызваны по отдельности или в дополнение к глутамат со второй пипетки, заполняя ионтофоретическая пипетки с высокой концентрации GABA решение (см.: Протокол раздел 2) и положительного выброса тока. Существует простой протокол для подтверждения ГАМКергическими характере событий и сделать ГАМКергическими событий легче обнаружить, если не используется высокая движущей силой внутреннего решения: Введите отрицательных токов (около 1 сек, амплитуда зависит от входного сопротивления клетки), в результате hyperpolarising VOltage шаги, начиная примерно -100 мВ, а затем увеличить в 5 мВ (рис. 8). При очень отрицательных потенциалов ГАМКергическими событий легче обнаружить, из-за более высокой движущей силой. И если сигналы обратной вокруг рассчитывается Cl - обратный потенциал для решений, это очень вероятно, что они ГАМКергическими в природе (рис. 8). С дополнительным ГАМК микро-ионтофоретическая пипетки, можно исследовать, например, действие ГАМК ингибирование глутаматэргическую события, такие как дендритные натрий / кальциевых шипы, за счет изменения относительной временной дендритных шип и ТПСП (рис. 9), относительное расположение обоих событий, или их амплитуды. (Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами уходу и использованию животных комитета Боннский университет, Немецкий центр нейродегенеративных заболеваний и состояния земли Северный Рейн-Вестфалия).
Рисунок 1. Пространственные масштабы iontophoretically выбрасывается глутамата определяется отвод пипетки. A) Максимальный вылет интенсивность двухфотонного изображения CA1 пирамидальных дендритов ячейку, заполненную 100 мкМ Alexa 594 и ионтофоретическая пипетки в исходном положении (масштаб 8 мкм). Врезках втягивание ионтофоретическая пипетки и соответствующие ионтофоретическая EPSP записал на сомы. Стрелка указывает позицию дл ионофореза кончика пипетки. B) Расстояние зависимость амплитуды ВПСП по отношению к начальной позиции дл ионофореза наконечник пипетки (≤ 1 мкм от дендритов, п = 6 ветвей). При этом мы могли бы оценить радиус глутамата распространяться посредством систематического втягивания пипетки. На врезке показано следы типичного примера. Ошибка бары представляютсреднее ± SEM. (Адаптировано из Müller и соавт. 9 2012, перепечатано с разрешения Elsevier).
Рисунок 2. Как ионтофоретическая пипетки должна выглядеть. А) Инфракрасное изображение CCD ионтофоретическая пипетки по сравнению с небольшим 5,5 МОм патч пипетки использованием 60X цели. B) Iontophoretic пипеткой со шкалой использованием 60X цели. Калибровка: наименьшее = 10 мкм.
Рисунок 3. Емкость компенсации ионтофоретическая пипетки с помощью встроенного тест-импульса (10 нА, 10 мс, НПИ электронные, Тамм,Германия). Важно, чтобы компенсировать емкость правильно следить за право сопротивление пипетки и обеспечить быстрое и точное нейротрансмиттеров приложения.
Рисунок 4. Принципы микро-ионофореза. А) Схематическое изображение CA1 пирамидальных нейронов в целой клетки патч-зажим конфигурации и ионтофоретическая пипетки заполнены глутамата. Глутамат отрицательный заряд, поэтому положительный ток, подаваемый на пипетку будет держать его утечки из пипетки: сохранить текущую положительна (слева). Чтобы извлечь глутамата из пипетки, применять отрицательный ток (правая панель). Таким образом, глутамат вытесняется из пипетки и может вызвать возбуждающих событий в постсинаптической клетки. Б) Схематическое изображение CA1 пирамидальных нейронов в целой клетки патч-зажим конфигурации и ионтофоретическая пипетки заполнены ГАМК. ГАМК является положительно заряженным при низких рН. Таким образом, отрицательный ток будет держать его утечки из пипетки (слева). Чтобы извлечь ГАМК применяются положительный ток (правая панель). Таким образом, ГАМК выходит из пипетки и может вызвать ингибирующее событий в постсинаптической клетки.
Рисунок 5. Хорошие и плохие ионтофоретическая пипеток. А) представитель пример ионтофоретическая глутаматэргическую ВПСП генерируется на дендритные ветви CA1 пирамидальных нейронов. B) представитель пример ионтофоретическая дендритных шип генерируется дендритные ветви в области СА1 гиппокампа с текущими мягкий утечки глутамата от кончика пипетки.
Рисунок 6. Представитель результаты одного глутамат микро-ионофореза. А) Схематическое изображение исправленная CA1 пирамидальных нейронов и ионтофоретическая пипетки заполнены глутамата. B) EPSP вызвали в CA1 пирамидальных нейронов с глутаматом ионофорез. C) дендритных Na + / Ca 2 + шип вызвали на проксимальных дендритом CA1 пирамидальных нейрон, нижний график показывает наклон напряжения следа, пик указывает на пик наклона дендритных шип. D) При увеличении тока, подаваемого на ионтофоретическая амплитуда ВПСП будет увеличиваться, пока она не пересекает потенциала действия порог.
"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Представитель результаты двойного глутамата микро-ионофореза в разных местах на дендритных дерева. А) Схематическое изображение исправленными CA1 пирамидальных нейронов и два ионтофоретическая пипетки заполнены глутамат, которые расположены на проксимальном и дистальном дендритов соответственно. B) Ионтофоретическое ВПСП вызывали на проксимальный дендрит из пирамидальных нейронов CA1 (1). С) Ионтофоретическое ВПСП вызывало у дистального дендритов (2).
Рисунок 8. Представитель результаты ГАМК микро-ионофореза. А) Схематическое изображение исправленная CA1 пирамидальных нейронов и ионтофоретическая пипетки заполнены ГАМК.B) Ионтофоретическое ТПСП вызывали на проксимальный дендрит из пирамидальных нейронов CA1. С) Длинные инжекции тока систематического изменения амплитуды в CA1 пирамидальных нейронов через патч пипетки, чтобы определить изменение потенциала вызвало событие (текущий инъекции от -400 пА до 0 Па). Артефакт указывает момент времени ГАМК ионофореза. Вызвала событие указывает изменение потенциала примерно -70 мВ (стрелка).
Рисунок 9. Представитель результаты одновременного глутамат и ГАМК ионтофорезом расследовать интеграции торможения и возбуждения. А) Схематическое изображение исправленная пирамидальных нейронов и одной пипетки заполнены глутамата (зеленый) и на с ГАМК (оранжевый). B) вызвали Iontophoreticallyдендритных шипов в одиночку, в последующих циклах, нижняя следы показывают DV / DT, пики указывают дендритных шипов. C) Iontophoretically вызвала IPSP одиночку. D) Оба, и глутаматергические ГАМКергическими события вместе.
| Расположение специфичность | Передатчик специфичность | Токсичность / побочные эффекты | Пресинаптическая стимуляции | Долгосрочный эксперимент | Затраты / сложности | |
| Micro-ионтофорезом | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-фотонной uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Synaptic стимуляции | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Таблица 1. . Сравнение различных методов Преимущества и недостатки методов, чтобы стимулировать нейроны по различным критериям (- = плохо, + = не является оптимальным, + + = хорошо, + + + = лучшая).
| Патч пипетки | Iontophoretic пипетки | |||
| Предварительно тянет P (A) односторонней | Последний тяги P (B) | Предварительно тянет P (A) односторонней | Последний тяги P (B) | |
| Тепло H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Сила тяги Предварительно F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Расстояние Пороговое значение S (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Задержка HEATSTOP T (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Расстояние HEATSTOP S (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Задержка F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Тяговое усилие 1 F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Расстояние Вытяните 2 S (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Тяговое усилие 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Отрегулируйте (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Таблица 2. Образцово съемника протокола. Для горизонтального съемника (DMZ-Универсальный съемник, Цайца-Instruments GmbH, Martinsried, Германия), используя GB150F-8П нитей (Наука Продукция, Hofheim, Германия) для патча и ионтофоретическая пипеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь объясняется, как применять быстрые микро-ионофореза нейромедиаторов расследовать синаптической интеграции на дендритов. Этот метод был успешно использован для исследования и глутаматергические ГАМКергическими синаптической передачи в различных регионах мозга в пробирке и в естественных 9,20-22. Micro-ионтофорезом была использована в течение более 60 лет, но в начале года было в основном используется для локально применять нейротрансмиттеров и наркотиков на медленных или промежуточные сроки 23 или для микроинъекции веществ в клетках 24.
Micro-ионтофорезом стал особенно интересным инструментом для изучения дендритных интеграция с момента введения усилители, которые оснащены быстрой компенсации емкости для высокого сопротивления электродов 10,11. При этом усовершенствование стало возможным применять краткое прямоугольной ионтофоретическая токов в результате постсинаптические реакции, которые RESEmbled более реалистично временной ход событий синаптической 10,25.
Каковы технические требования и трудности, чтобы иметь дело с, при создании микро-ионофореза? Ионтофоретическая усилитель необходима, что позволяет компенсировать высокую емкость тонкой ионтофоретическая пипеток. Точности настройки мощности компенсации очень важно, если высокую скорость работы в сочетании с высокой микроэлектродов сопротивление не требуется. Безвозмездное паразитные емкости заряжаются от ионтофоретическая тока, который подается от прибора, и, следовательно, замедляет приложения. Компенсация емкости важно правильно и подробно описан в видео. Кроме того, очень важно, что оптическая система дает хорошие флуоресцентное изображение дендритов и ионтофоретическая пипетки, не вызывая фото-повреждения ткани. Рекомендуется воспользоваться двухфотонные системы и снижения мощности лазера и живи раза больше, совместимая сдостойное качество изображения. Если более обычного источника света используется, чтобы убедиться уменьшить время экспозиции в максимально возможной степени, например, с помощью механических или электрических жалюзи запуска. Вероятно, наиболее критическая точка пипетки дизайн, который позволит в течение определенного и конкретного применения нейромедиатора использованы. Этот шаг требует некоторых усилий и времени, чтобы найти оптимальные настройки. Здесь мы приводим протоколы для глутамат и ГАМК ионофорез, если других нейротрансмиттеров, антагонисты или модуляторы используются, следует, что вещество имеет высокую концентрацию и что еще более важно, что он заряжен. Например, так как ГАМК имеет суммарный заряд нуля при рН 0, рН должен быть отрегулирован (см. Протокол раздел 2), в результате чего чистый положительный заряд.
Когда микро-ионофореза установлена, это обеспечит расширенные набор инструментов для изучения синаптической интеграции в нейронах. Это позволяет стимулирование синапсах интерес избирательночастности нейромедиатора. С использованием выбранного нейромедиатора на определенных местах, постсинаптическими токов и потенциалов и их распространение может быть исследовано. Кроме того, можно использовать несколько ионтофоретическая электродов одновременно исследовать интеграции нескольких глутаматэргическую входов или систематически изменения относительного времени или силы событий.
Некоторые общие критические точки должны быть рассмотрены при использовании микро-ионофореза. Профиля концентрации нейромедиатора после микро-ионофореза отличается от эндогенного. Murnick и др. 10 сообщили, что скорость высвобождения из ионофореза наконечник (около 1 мс), вероятно, будет значительно медленнее, чем синаптических освобождение от пузырьков, которое происходит в доли миллисекунды (0,2 мсек) 26. Кроме того, диффузия и из синаптической щели, вероятно замедление роста концентрации и распада iontophoretically применяется нейротрансмиттеров.Кроме того, объем выброшенного нейромедиатора, вероятно, будет выше, чем физиологически высвобожденных объемов, однако, с высоким сопротивлением электродов, один глутаматергические и ГАМКергические postsynapses может быть активирован с помощью микро-электрофорез 10-12. Пространственной избирательности в диапазоне от нескольких микрометров Кроме того, недавно было достигнуто за счет двухфотонного uncaging нейромедиаторов 3,4,27.
В то время как значительно более затратными, двухфотонные uncaging имеет несколько преимуществ по сравнению с микро-ионофореза. В частности, он может быть использован для высвобождения нейромедиаторов одновременно в нескольких местах синаптических и не требует точного позиционирования тонкий кончик электрода. Тем не менее, он также имеет некоторые существенные недостатки которые следует учитывать при выборе метода для конкретного эксперимента. Многие клетки соединения имеют нежелательные побочные эффекты, такие как блокада рецепторов нейротрансмиттера 28. Например, многие глутамат и ГАМК клеткибыли зарегистрированы вмешиваться ГАМКергическими торможения. Кроме того, относительно высокой мощности лазерного излучения требуется для двухфотонного uncaging может привести к фото-повреждения постсинаптического нейрона, особенно при стимуляции применяется неоднократно в течение нескольких минут. Кроме того, в то время как микро-электрофорез ограничен в количестве стимулировали сайтов, эти участки могут быть выбраны свободно на все дерево дендритных нейрона, например, на дистальной и базальные дендриты, чтобы имитировать слоистых синаптических входных различных областях головного мозга. Двухфотонные uncaging, так как он в настоящее время используется большинством групп, будет ограничено синаптической сайтов в частности фокальной плоскости и в поле зрения, которое зависит от цели использовали (как правило, 40X или 60X погружения в воду). Следует считать, что оба метода всегда приводит к активации внесинаптического рецепторов, что может сделать интерпретацию результатов более трудным.
Другим недостатком микро-электрофорез в том, что оолько postsynapse может быть активирована. Если пресинаптической функции и роль пузырька выпустила нейромедиатора должны быть установлены в экспериментальную направленность, местные электрические синаптической стимуляции могут быть методом выбора. Однако недостатки электрической синаптической стимуляции по сравнению с микро-электрофорез в неизвестном месте активированных синапсов и совместно активации аксонов из различных нейрональных популяций, потенциально принадлежащих другими системами нейромедиаторов (табл. 1).
В итоге самое важное преимущество микро-электрофорез, на наш взгляд, что можно использовать несколько различных нейротрансмиттеров и изучать их взаимодействие нейронов на отсеки, такие как дендриты 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Ханс Райнер Polder, Мартин Fuhrmann и Уокер Джексона за внимательное прочтение рукописи. Авторы получили финансирование, которое было предоставлено Министерством исследований MIWF государства Северный Рейн-Вестфалия (SR), BMBF Projekträger DLR-американо-германского сотрудничества в вычислительной неврологии (CRCNS; SR), центрами передового опыта при нейродегенеративных заболеваниях (COEN; SR) и Боннского университета очной программы финансирования (Бонфор; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
