Summary
En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.
Abstract
Uno de los intereses fundamentales de la neurociencia es entender la integración de entradas excitadoras e inhibidoras a lo largo de la muy compleja estructura del árbol dendrítico, que finalmente conduce a la producción neuronal de potenciales de acción en el axón. La influencia de diversos parámetros espaciales y temporales de entrada sináptica específica en la salida neuronal está actualmente bajo investigación, por ejemplo, la atenuación dependiente de la distancia de las entradas dendríticas, la interacción dependiente de la ubicación de las entradas espacialmente segregadas, la influencia de la inhibición GABAergig en la integración excitatorio, lineal y modos de integración no lineales, y muchos más.
Con micro-iontoforesis rápido de glutamato y GABA es posible investigar con precisión la integración espacial y temporal de la excitación glutamatérgica y la inhibición GABAérgica. Requisitos técnicos críticos son o bien una lámpara fluorescente activado, el diodo emisor de luz (LED), o una de dos fotones scanning microscopio para visualizar ramas dendríticas sin introducir significativa foto-daño del tejido. Además, es muy importante tener un amplificador de micro-iontoforesis que permite la compensación de capacitancia rápido de pipetas de alta resistencia. Otro punto crucial es que ningún transmisor se libera involuntariamente por la pipeta durante el experimento.
Una vez establecida, esta técnica dará señales fiables y reproducibles con una alta especificidad y neurotransmisor ubicación. En comparación con el glutamato y GABA uncaging, iontoforesis rápido permite el uso de dos transmisores en el mismo tiempo pero en lugares muy distantes sin limitación para el campo de visión. También hay ventajas en comparación con la estimulación eléctrica focal de axones: con micro-iontoforesis se conoce definitivamente la ubicación del sitio de entrada y es seguro de que sólo se libera el neurotransmisor de interés. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que sólo con micro-iontoforesis lapostsynapse se activa y aspectos presináptica de la liberación de neurotransmisores que no se resuelven. En este artículo se demuestra cómo crear micro-iontoforesis en experimentos de cortes de cerebro.
Introduction
Las neuronas en el sistema nervioso central reciben una variedad de entradas sinápticas en sus procesos dendríticos delgadas y ramificadas 1. Allí, la mayoría de las entradas excitadoras dendríticas están mediadas por las sinapsis glutamatérgicas. Estas sinapsis se pueden activar de una manera distribuida en el espacio, lo que resulta en la integración lineal postsináptica de los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP). Si las sinapsis se activan de forma simultánea y en proximidad espacial en la dendrita, estas entradas excitadoras pueden ser integrados supra-linealmente y generan picos dendríticas 2-5.
Además, la integración de entradas excitadoras depende de la ubicación de la entrada en el árbol dendrítico. Las señales que llegan a la región distal del mechón son mucho más atenuado que las entradas proximal por filtrado de cable 6. En el hipocampo, las entradas distantes a las dendritas apicales penacho se generan por una región del cerebro diferente que los de proximal dendriTES 7. Una cuestión interesante es por lo tanto, la forma de entrada sináptica es procesada por diferentes compartimentos dendríticas y si la integración dendríticas regula la influencia de estas entradas en capas sobre el disparo neuronal de diferentes maneras.
No sólo las propiedades funcionales, las características morfológicas de la dendrita, la ubicación y la agrupación de las entradas están afectando a la integración dendríticas de entradas excitadoras, también las entradas inhibidoras adicionales de terminales GABAérgicas crucial determinar la eficacia de las sinapsis glutamatérgicas 8,9. Estos diferentes aspectos de la integración sináptica pueden ser investigados utilizando idealmente neurotransmisor micro-iontoforesis, que permite la aplicación espacialmente definida de diferentes neurotransmisores a los dominios dendríticas. Estamos aquí demostrar la forma de establecer con éxito micro-iontoforesis de glutamato y GABA para investigar la integración de señales en las neuronas.
Para esta aplicación, de punta finase utilizan pipetas de alta resistencia llenos de soluciones concentradas de neurotransmisores. Estas pipetas están posicionados cerca de la membrana externa de la célula, donde se encuentran los receptores de los neurotransmisores. Es necesaria una buena visualización de las ramas dendríticas. Esto se logra mejor mediante tintes fluorescentes, que se introducen a través de la pipeta parche. A continuación, un impulso de corriente muy corto (<1 ms) (en el rango de 10 a 100 nA) se utiliza para expulsar las moléculas neurotransmisoras cargadas. Con estos pulsos cortos y compensación de capacitancia efectiva, potenciales o corrientes postsinápticas pueden ser evocados con alta precisión temporal y espacial, lo que significa que se conoce con precisión la ubicación de la entrada excitadora. El glutamato micro-iontoforesis puede activar sinapsis en un radio definido, que es menor que 6 m como se muestra aquí (Figura 1 9), pero también es posible llegar a resolución sinapsis única 10-12.
Heine, M., y col 13. Con micro-iontoforesis rápido que es fácilmente posible usar dos o más pipetas iontoforéticos y colocarlos en diferentes lugares, aunque distantes en el árbol dendrítico. De esta manera, la integración de eventos excitatorios, incluidos los de las diferentes vías, se puede investigar. También es posible utilizar un glutamato y una pipeta iontoforético lleno de GABA en el mismo tiempo. De esta manera el efecto de la inhibición GABAérgica en diferentes ubicaciones relativas a la entrada de excitación (en-camino, la inhibición de fuera de ruta) puede ser estudiada. Además, el impacto de la inhibición por interneuronas dirigidos dominios neuronales específicas, como las dendritas distales, soma o axones 14, puede ser investigada utilizando iontoforesis GABA. En las neuronas cultivadas, micro-iontoforesis rápido ofrece la oportunidad de investigate distribución de sinapsis individuales y los aspectos elementales de la comunicación sináptica en las neuronas de muchos más detalles 10,11.
En este artículo se demuestra en detalle la forma de establecer la iontoforesis glutamato y GABA para el uso en rodajas de cerebro de agudos, lo que permite que investigan la integración sináptica de entradas excitadoras e inhibidoras en dependencia de la ubicación de entrada, los puntos fuertes de entrada, y el momento, solo o en interacción. Vamos a señalar las ventajas y limitaciones de esta técnica y cómo solucionar con éxito.
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Protocol
1. Requisitos del sistema
- Sistema de microscopio: buena visualización de la dendrita es crucial. Si está disponible, utilice un sistema de microscopía de escaneo láser de dos fotones. En nuestros experimentos hemos utilizado un ámbito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania o un sistema Ultima IV, Tecnologías de la Prairie, Middleton, Wisconsin equipado con un Ti: Sapphire-pulsos láser ultrarrápidos (Camaleón Ultra II, coherente) y un objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar las dendritas que habíamos llenado con un colorante fluorescente a través de la pipeta parche. Aunque se cree que foto-daño a ser menos graves utilizando la exploración de 2 fotones, reducir la potencia del láser (por debajo de 8 mW en el tejido) y los tiempos de permanencia (por debajo de 1 microsegundos) o tanto como sea posible.
- Una segunda posibilidad es la de activar una fuente de luz de fluorescencia de campo amplio (LED o una lámpara fluorescente) sincrónicamente con la adquisición de reducir el tiempo de exposición tanto como sea posible. Hemos utilizado un monocromador con una fuente de luz integrada (TILLPhotónicos, Gräfelfing, Alemania) en un Zeiss Axioskop 2 FS microscopio vertical, que estaba equipado con iluminación infrarroja Dodt-contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Alemania). En nuestros experimentos tiempos de exposición variaron desde 10 mseg por lo general a máx. 30 mseg.
- Utilice un amplificador de micro-iontoforesis rápido, por ejemplo, un sistema de micro-iontoforesis de dos canales MVCS-C-02 (NPI electrónica, Tamm, Alemania) con compensación de capacitancia rápido. Los microelectrodos iontoforesis de punta fina tienen resistencias de 25 a 100 mW (fundamentalmente en función del tamaño de la punta y de la forma de pipeta) y tiempos de subida rápidos sólo pueden alcanzarse si la indemnización capacidad del amplificador de iontoforesis se ajusta de manera óptima. Esta compensación rápida es necesaria la aplicación de impulsos de corriente con un inicio breve y rápida en el rango de sub-milisegundos a la pipeta iontoforético y de ese modo para expulsar el transmisor con alta resolución espacial en tamaños de punto por debajo de 1 m 13. Amplificadores iontoforesis son allo disponible en varias otras empresas, que no hemos probado en nuestro laboratorio. Estos dispositivos son a nuestro conocimiento no está equipado con circuitos de compensación de capacitancia.
2. Preparar Soluciones
- Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y la solución interna, ya que se requiere para el diseño experimental. La única adición a la solución interna, que se requiere, es un colorante fluorescente de color rojo o verde (por ejemplo, 50 a 200 mM Alexa Fluor 488 o 594 hidrazida, Invitrogen), dependiendo del equipo óptico. Aquí un ejemplo para ACSF sacarosa que puede ser utilizado para la disección, en mM: NaCl 60, 100 de sacarosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 de CaCl 2, 5 MgCl2, 20 de glucosa, y para ACSF normales solución para los experimentos de patch-clamp en mM: NaCl 125, KCl 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl 2, 15 glucosa.
- Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) todas las soluciones extracelulares constantemente.
- Preparar la solución interna, por ejemplo, en mM: 140 K-gluconato, 7 KCl, 5 HEPES-ácido, 0,5 MgCl 2, 5 fosfocreatina, 0,16 EGTA; con 50 - 200 micras Alexa 488.
- Para glutamato micro-iontoforesis preparar una solución con 150 mM de ácido glutámico y ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Añadir 50 -200 mM Alexa Fluor 488 o 594 hidrazida (Invitrogen) para la visualización.
- Para iontoforesis de GABA preparar una solución 1 M de GABA y ajustar el pH a 5 con HCl 15. A este pH GABA está cargado, sólo entonces se puede aplicar el uso de la iontoforesis. Tenga en cuenta que el bajo pH en la solución expulsada al espacio extracelular podría afectar propia transmisión GABA 16,17.
Proteja la solución de GABA de la luz y con frecuencia preparar solución de GABA fresca, ya que la solución anterior puede perder su eficacia. - Si es difícil de ver eventos GABAérgicas, equipogh Cl - solución interna fuerza motriz, por ejemplo, dejando fuera de KCl, pueden ayudar a visualizar los eventos GABAérgicas para ver si la iontoforesis GABA está trabajando, sin embargo para investigar la integración sináptica una fuerza de conducción fisiológica podría ser recomendada. Para la detección general de pequeños eventos GABAérgicas, un protocolo se muestra en la Figura 8C puede ayudar.
3. Tire y probar las pipetas iontoforesis
- En general, tirando de las pipetas adecuadas es quizás el paso más importante para lograr la iontoforesis neurotransmisor controlada. Cuando se utiliza la iontoforesis en cultivo celular, es posible tirar de electrodos muy finos similares a microelectrodos afilados 10. En los experimentos de patch-clamp en rodajas agudas, sin embargo, estas pipetas muy finas se doblan sobre la superficie de corte cuando se bajan en el tejido con un ángulo, por lo que es imposible de alcanzar dendritas más profundas.
- Por lo tanto, tirar de una pipeta con una punta muy pequeña, por lo que no neurotransmitter puede salir, pero la punta tiene que ser lo suficientemente rígido como para penetrar en el tejido (Figura 2). Por ejemplo, usar 150 GB F 8P pipetas de clase (Science Products, Hofheim, Alemania) y un tirador horizontal (por ejemplo, un extractor DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Alemania, o un extractor de P-97, Sutter Instrument Company , Novato, CA) con varios pasos de tracción para lograr una pequeña abertura, sino también un corto Tapper con un ángulo pronunciado (Figura 2 y Tabla 2).
- También es posible utilizar pipetas de vidrio de cuarzo para tirar de pipetas iontoforéticos 10. Se supone que tiene mejores propiedades mecánicas y ser más confiable, sin embargo se requieren extractores especiales láser. Pero también es posible lograr buenos resultados con pipetas de vidrio normales, que por lo general se utilizan para tirar de pipetas de parche.
- Pon a prueba el rendimiento de pipeta y la resistencia en una cámara sin tejido, antes de utilizarlas por primeratiempo, ya que las fugas de glutamato podría dañar el tejido.
- Configure el amplificador iontoforesis correctamente. A continuación, llenar la pipeta con el neurotransmisor y la solución que contiene colorante y colocarlo en el baño (ACSF).
- Compensar la capacitancia (Figura 3). Por lo general, muy pipetas agudos tendrán una capacidad superior a los contundentes.
- Comprobar la resistencia de la pipeta: El amplificador de micro-iontoforesis utilizado aquí tiene una característica construir-en para la medición de la resistencia a la pipeta. Evoca impulsos de prueba rectangulares breves, que pueden ser controlados con un osciloscopio estándar o una tarjeta A / D conectado a un ordenador con el software de adquisición. Dependiendo de la forma y el tamaño de la punta, la punta debe tener una resistencia entre 25 a 90 mW.
- Centrarse en la punta con un objetivo de inmersión en agua de 60X o 40X y cambiar a imágenes fluorescentes y si es posible, agrandar Si hay una fuga de colorantes fluorescentes fuera de la punta de la pipeta, aplique una pequeña positivo (en el caso de gluTamate) o negativo (en el caso de GABA, Figura 4) actual conservan (<0,02 μA). Si eso no ayuda para cancelar la fuga, cambiar la pipeta.
- Aplicar una corriente de paso fuerte o usar el disparador manual y supervisar la punta en la imagen fluorescente para ver si la solución puede ser expulsado fuera de la pipeta. Como se mencionó anteriormente, la polaridad del impulso de corriente está en función de la carga de la molécula que se supone que ser expulsado. Para expulsar el glutamato es una corriente negativa y para GABA una corriente positiva (Figura 4).
- Las burbujas de aire en la pipeta que bloquean la expulsión de tinte y el transmisor, se puede borrar mediante la aplicación de un alto eyección actuales varias veces.
- Tomados en conjunto, si no hay fugas visibles y la eyección prueba fue exitosa, compensar la capacitancia e iniciar el experimento.
- Precaución: Dado que la compensación de capacitancia se consigue mediante un circuito de realimentación, este circuito puede oscilar sobreimpulso o si es overcompensated. Utilizar con cuidado el ajuste del dial de compensación de capacitancia.
- Dependiendo de la estabilidad extractor a veces es necesario para ajustar la configuración del extractor de tiempo en tiempo, ya que el filamento puede haber cambiado propiedades. Sin embargo, si una vez que una buena pipeta está diseñado, que puede ser utilizado para varios días. Por lo tanto, después de terminar el experimento iontoforético almacenar la pipeta en un recipiente cerrado sin dañar la punta.
- Para el siguiente experimento llenar la pipeta con la solución de neurotransmisor, se aplican varios pulsos expulsan fuertes para limpiar la punta y luego comprobar si las propiedades (por ejemplo, resistencia) el cambio de manera significativa. Entonces compensar la capacitancia y utilizar la pipeta de nuevo. No use una sola pipeta con diferentes soluciones de neurotransmisores.
4. Preparar las rodajas de cerebro
- Si micro-iontoforesis se utiliza por primera vez sin duda preparar las rodajas después de establecer un programa extractor de funcionar de forma fiable. <procedimientos li> Perform anestesia y la decapitación de acuerdo a las pautas de cuidado de animales de su institución o de la autoridad local.
- Después de la eliminación del cerebro, la transferencia a hielo frío ACSF sacarosa (véase el Protocolo 2.1).
- Cortar la región de interés en rodajas de grosor adecuado (por ejemplo, 300 micras).
- Incubar las rebanadas en ACSF sacarosa a 35 ° C durante 30 min. Posteriormente, transferirlos a una cámara de retención sumergida que contiene ACSF normal a temperatura ambiente.
- A lo largo de la preparación y la experimentación carbogenize la ACSF que rodea las rebanadas con 95% O 2, 5% de CO 2.
5. Establecer una grabación de células enteras
- Coloque la pipeta iontoforesis (s) ya cerca de la superficie de corte antes de parchear una celda, para evitar el posicionamiento de larga duración, después de establecer el modo de célula completa.
- Tire una resistencia baja parche pipeta (3-5 mW), llenarlo con la dvosotros que contiene solución interna y aplicar presión positiva a la pipeta (30 - 60 mbar).
- Ingrese el baño y el enfoque de la celda bajo la guía visual (dos imagen contraste gradiente fotón contraste o Dodt infrarrojos).
- Vigilar la resistencia pipeta con un pulso de prueba (por ejemplo, -10 mV, 20 ms) en el modo de fijación de voltaje. Al tocar el tejido corregir el potencial de compensación.
- Acércate a la célula y empuje suavemente la punta de la pipeta en ella hasta que un "hoyuelo" se puede ver claramente. Inmediatamente liberar la presión de la pipeta, se aplican 40 - 60 mbar de presión negativa y cambiar el potencial de membrana de -65 mV.
- Cuando la corriente de mantenimiento alcanza valores por debajo de 100 pA, liberar la presión negativa.
- Después de establecer un sello giga (resistencia> 1 GΩ), la ruptura de la membrana con un corto, fuerte succión a la pipeta o breve exceso de compensación del circuito de compensación de capacitancia.
- Dependiendo del modo (abrazadera de tensión o de corriente) que se requierepara el diseño experimental, compensar apropiadamente.
- Iniciar para traer la pipeta iontoforético en su posición final. Si es necesaria una descripción más detallada de cómo llevar a cabo con éxito grabaciones de patch clamp, hay varias directrices excelentes disponibles 18,19.
6. Coloque la pipeta iontoforética y generar un potencial iontoforética Postsináptica
- En general, los acontecimientos iontoforéticos pueden ser evocados en lugares definidos dependiendo del experimento deseada, por ejemplo, en una dendrita espinosa para el glutamato micro-iontoforesis, en el eje dendríticas, soma o segmento inicial del axón para GABA micro-iontoforesis.
- Acércate a la célula hasta aproximadamente 1 m distancia sin tocarlo. Después de alcanzar la posición de interés es crucial que no neurotransmisor se está filtrando y que la capacitancia de la pipeta esté bien compensada.
- Si se aproxima la célula con un glutamato llena pipetee iontoforéticoe provoca la despolarización detectable del potencial de membrana, ajuste la corriente conservan si es posible, o cambiar la pipeta.
- Aplicar impulsos de corriente negativos cortos, a partir de cero y aumentar la corriente de forma sistemática (por ejemplo, desde 0,1 hasta 0,4 mseg, 0,01 a 1 μA pulsos). Esto ayuda a saber en qué rango de la corriente iontoforética evoca las respuestas deseadas en el experimental específica puesta a punto.
- Si no hay ninguna respuesta detectable, levante la pipeta varias cientos de micrómetros y aplicar una fuerte corriente de expulsión (> 0,1 μA) para limpiar la punta. Ajuste la compensación de capacitancia, acercarse a la célula, y vuelva a intentarlo.
- Si aún no hay respuesta, reducir la corriente de retener. Tenga mucho cuidado con los ajustes de la carátula ya que este procedimiento puede causar la liberación de neurotransmisores incontrolada. Por lo tanto, vigilar constantemente el control para detectar los cambios respectivos en el potencial de membrana.
- Si es difícil de detectar eventos GABAérgicas, puede ser útil usar unn composición de la solución interna de rendimiento en un alto Cl - fuerza motriz. Para lograr esto, reducir la concentración de Cl - en la solución de la pipeta (véase la sección 2.6 del protocolo.). Esto dará lugar a acontecimientos GABAérgicas más grandes en el potencial de membrana en reposo debido a una fuerza de conducción más alta.
- Alternativamente, inyecte medidas actuales largos resultan en la membrana potenciales posibilidades de -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Con este protocolo el Cl - motor se incrementa a potenciales hiperpolarizados causan una respuesta GABA despolarización.
- También es posible utilizar el protocolo de inyección de corriente de paso para determinar el potencial de inversión de los acontecimientos evocados, lo que ayuda a determinar la naturaleza GABAérgica de los eventos. La fuga de GABA es más difícil de detectar que las fugas de glutamato. En este caso, un control constante de la resistencia de entrada puede ayudar, cuando se acercó a la pipeta llena de GABA. Si la resistencia de entrada disminuye, la corriente puede retener be incrementa o una pipeta diferente se debe utilizar.
- En los experimentos de control para iontoforesis glutamato, sugerimos una Ca 2 + experimento de imágenes, utilizando 200 mM OGB-1 y no EGTA en la solución de la pipeta para visualizar la entrada de calcio local que puedan ser causados por fugas de glutamato.
- En general, para lograr una respuesta estable es muy importante tener una pipeta mecánicamente estable para evitar la deriva con el tiempo. La deriva puede ser causado por cambios de temperatura, por lo tanto, se recomienda conectar el equipo por lo menos media hora antes de las medidas para evitar la deriva térmica. Asegúrese de utilizar buenos cierres de cartucho en el soporte de la pipeta y la punta está muy fijo. El titular de la misma puede ser, además, fijado con cinta de teflón, por otro lado, estar seguro de que no hay tensión en los cables de la headstage o manipulador, que también es una fuente potencial de la deriva.
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Representative Results
Un enfoque simple para determinar la extensión espacial de la iontoforesis es para retraer la pipeta iontoforético paso a paso de la dendrita, mientras se mantiene constante la glutamato expulsado. Hemos encontrado que la extensión espacial de una estimulación de micro-iontoforético tenía un diámetro de aproximadamente 12 micras (Figura 1 que muestra radio). ¿Qué tan profundo en el tejido de la iontoforesis se puede utilizar depende de la rigidez de la pipeta. Sin embargo, las pipetas iontoforéticos necesarios para los experimentos en rebanadas (Figura 2), que se utilizan aquí, no están limitando la profundidad de penetración. Más bien, el sistema óptico y la resolución en la disminución de la profundidad de la rebanada de cerebro es el factor limitante. Para una grabación de buena calidad es fundamental que ningún transmisor tiene una fuga de la pipeta. En el caso de glutamato, una fuga se puede identificar si hay una despolarización repentina cuando la dendrita se aborda con la punta de la pipeta o si la línea de base se convierte de repenteinestable (Figura 5). Después de establecer una grabación estable, es posible para evocar EPSP de amplitudes definidas, espigas dendríticas o potenciales de acción con esta técnica en cualquier lugar en todo el árbol dendrítico (Figura 6). Mediante la aplicación de glutamato con micro-iontoforesis rápido, las propiedades de EPSP, su propagación y la suma, al mismo tiempo en diferentes lugares, incluso distantes, pueden ser investigados (Figura 7). GABAérgicas eventos pueden ser evocados por separado o junto con el glutamato con una segunda pipeta de llenado por la pipeta iontoforético con una solución altamente concentrada de GABA (ver: sección Protocolo 2) y una corriente de expulsión positiva. No es un protocolo simple para confirmar la naturaleza GABAérgica de los eventos y para hacer que los acontecimientos GABAérgicas más fácil de detectar, si no se usa una solución interna elevada fuerza de conducción: Inyectar corrientes negativas (aprox. 1 seg; la amplitud depende de la resistencia de entrada de la celular), resultando en hyperpolarising vopasos ltaje, a partir de alrededor de -100 mV y luego aumentar en 5 etapas mV (Figura 8). A potenciales muy negativos los eventos GABAérgicas son más fáciles de detectar, debido a la fuerza de conducción más alta. Y si las señales de marcha atrás alrededor de la Cl calculado - potencial de inversión para las soluciones, es muy probable que sean GABAérgica en la naturaleza (Figura 8). Con una pipeta de micro-iontoforético GABA adicional, es posible investigar, por ejemplo, el efecto de la inhibición GABAérgica en eventos glutamatérgicas, como espigas de sodio / calcio dendríticas, mediante la variación de la temporización relativa de pico dendríticas y IPSP (figura 9), la ubicación relativa de los dos eventos, o sus amplitudes. (Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices del Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Bonn, el Centro Alemán de Enfermedades Neurodegenerativas y el estado de Renania del Norte-Westfalia).
Figura 1. Extensión espacial de glutamato iontoforéticamente expulsado determina mediante una pipeta retracción. A) Intensidad máxima de la proyección de una imagen de dos fotones de una dendrita de células piramidales CA1 llena con 100 mM Alexa 594 y la pipeta iontoforético en la posición inicial (barra de escala 8 micras). Recuadro muestra la retracción de la pipeta iontoforesis y la EPSP iontoforético correspondiente registrado en el soma. La flecha indica la posición de la punta de la pipeta iontoforesis. B) Dependencia Distancia de EPSP amplitudes respecto a la posición inicial de la punta de la pipeta iontoforesis (≤ 1 m de distancia de las dendritas, n = 6 sucursales). Con esto se podría estimar el radio de la glutamato extendido mediante la retracción de forma sistemática la pipeta. El recuadro muestra ejemplos de trazas representativas. Las barras de error representanmedia ± SEM. (Adaptado de Müller et al. 9 2012, reimpreso con permiso de Elsevier).
Figura 2. Cómo una pipeta iontoforético debe ser similar. Una imagen) infrarrojo CCD de una pipeta de iontoforesis comparada con un pequeño 5,5 mW parche pipeta utilizando un objetivo de 60X. B) pipeta iontoforético con escala utilizando un objetivo de 60X. Calibración: pequeños = 10 micras.
Figura 3. Compensación de capacitancia de la pipeta iontoforesis utilizando la construcción en la prueba de impulso (10 nA, 10 ms, npi electrónico, Tamm,Alemania). Es importante para compensar la capacitancia correctamente para controlar la resistencia a la pipeta de la derecha y para asegurar la aplicación neurotransmisor rápida y precisa.
La Figura 4. Principios de micro-iontoforesis. A) Dibujo esquemático de una neurona piramidal CA1 en toda configuración de patch-clamp de células y una pipeta de iontoforético lleno de glutamato. El glutamato está cargado negativamente, por lo tanto, una corriente positiva aplicada a la pipeta evitará que se escape de la pipeta: El conservan corriente es positivo (panel de la izquierda). Para expulsar de glutamato de la pipeta, aplicar una corriente negativa (panel derecho). De esta manera glutamato es forzado a salir de la pipeta y puede evocar eventos excitatorios en la célula postsináptica. B) Dibujo esquemático de CNeurona piramidal A1 en su totalidad la configuración de patch-clamp celular y una pipeta de iontoforesis lleno de GABA. GABA está cargado positivamente a un pH bajo. Por lo tanto, una corriente negativa evitará que se salga de la pipeta (panel izquierdo). Para expulsar GABA se aplica una corriente positiva (panel derecho). De esta manera GABA sale de la pipeta y puede evocar eventos inhibitorios en la célula postsináptica.
Figura 5. Buenas y malas pipetas iontoforesis. A) Ejemplo representativo de un EPSP glutamatérgico iontoforético generado en una rama dendrítica de una neurona piramidal CA1. B) Ejemplo representativo de un dendríticas iontoforético pico generado una rama dendrítica en el área CA1 del hipocampo en curso con fugas glutamato suave de la punta de la pipeta.
La Figura 6. Los resultados representativos para sola glutamato micro-iontoforesis. A) Dibujo esquemático de un parcheado piramidal CA1 neurona y una pipeta de iontoforético llenos de glutamato. B) EPSP evocado en una neurona piramidal CA1 con iontoforesis glutamato. C) dendríticas Na + / Ca2 + pico evocados en una dendrita proximal de un piramidal CA1 neurona, trazo inferior muestra la pendiente de la curva de voltaje, pico indica la pendiente máxima de la espiga dendríticas. D) Cuando el aumento de la corriente aplicada a la iontoforético la amplitud del EPSP aumentará hasta que cruza el umbral del potencial de acción.
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Figura 7. Los resultados representativos de doble glutamato micro-iontoforesis en diferentes ubicaciones en el árbol dendrítico. A) Dibujo esquemático de un parcheado piramidal CA1 neurona y dos pipetas iontoforéticos lleno de glutamato, que se coloca en un extremo proximal, y una dendrita distal, respectivamente. B) EPSP iontoforética evocado en una dendrita proximal de una neurona piramidal CA1 (1). C) EPSP iontoforética evocada en una dendrita distal (2).
Figura 8. Los resultados representativos para GABA micro-iontoforesis. A) Esquema de un parche CA1 neurona piramidal y una pipeta de iontoforesis lleno de GABA.B) IPSP iontoforética evocada en una dendrita proximal de una neurona piramidal CA1. C) la inyección de corriente de larga cambiando sistemáticamente amplitudes a una neurona piramidal CA1 a través de la pipeta de parche, para determinar el potencial de inversión del evento evocado (inyecciones actuales desde -400 pA a 0 Pa). Artefacto indica el tiempo del punto de la iontoforesis GABA. El evento evocado indica un potencial de inversión de aproximadamente -70 mV (flecha).
La Figura 9. Los resultados representativos de glutamato simultánea y iontoforesis GABA para investigar la integración de la inhibición y de excitación. A) Esquema de una neurona piramidal remendado y una pipeta llena de glutamato (verde) y con GABA (naranja). B) iontoforéticamente evocadaespigas dendríticas solos, en redadas posteriores, las huellas inferiores muestran dV / dt, picos indican espigas dendríticas. C) iontoforéticamente IPSP evocados sola. D) Ambos eventos, glutamatérgicas y GABAérgicas juntos.
| Ubicación especificidad | Especificidad transmisor | Toxicidad / efectos secundarios | Estimulación presináptica | Experimento de larga duración | Costos / complejidad | |
| Micro-iontoforesis | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2 fotones uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Estimulación Synaptic | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabla 1. . Comparación de diferentes técnicas Ventajas y desventajas de las técnicas para estimular las neuronas de acuerdo a diferentes criterios (- = malo, + = no es óptima, + + = bueno, + + + = el mejor).
| Parche pipetas | Pipetas iontoforéticos | |||
| Pre-tira de P (A) de un solo polo | Última tracción P (B) | Pre-tira de P (A) de un solo polo | Última tracción P (B) | |
| Heat H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Fuerza Pre tracción F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Distancia Umbral s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Delay Heatstop t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Distancia Heatstop s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Retardo F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Fuerza de tracción 1 F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Distancia de arrastre 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Fuerza de tracción 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Ajuste (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabla 2. Ejemplarmente protocolo extractor. </ Strong> Para un tirador horizontal (DMZ-Universal Extractor, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Alemania), utilizando filamentos GB150F-8P (Science Products, Hofheim, Alemania) para ambos parches y pipetas iontoforesis.
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Discussion
Aquí le explicamos cómo aplicar micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores para investigar la integración sináptica en las dendritas. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la transmisión sináptica glutamatérgica y GABAérgica en diferentes regiones del cerebro in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-iontoforesis se ha utilizado durante más de 60 años, pero en los primeros años, se utiliza sobre todo para bien aplicar localmente neurotransmisores y fármacos en escalas de tiempo lento o intermedio 23 o para la microinyección de sustancias en las células 24.
Micro-iontoforesis se convirtió en una herramienta particularmente interesante para el estudio de la integración dendrítico desde la introducción de los amplificadores, que están equipadas con una compensación de capacitancia rápido para electrodos de alta resistencia 10,11. Con esta mejora se hizo posible aplicar breves corrientes iontoforéticos rectangulares resultantes en las respuestas postsinápticas, que Resembled más realista la evolución temporal de los eventos sinápticos 10,25.
¿Cuáles son los requisitos técnicos y las dificultades para hacer frente, al establecer micro-iontoforesis? Se necesita un amplificador de iontoforesis que permite la compensación de la alta capacidad de las bellas pipetas iontoforesis. El ajuste correcto de la compensación de la capacidad es muy importante si se requiere un funcionamiento de alta velocidad en conjunción con microelectrodos de alta resistencia. Capacidades parásitas no compensados pagan de la corriente iontoforética que es suministrada por el instrumento, y por lo tanto ralentiza la aplicación. Compensación de la capacitancia adecuada es crucial y se explica en detalle en el video. Además, es fundamental que el sistema óptico da una buena imagen fluorescente de la dendrita y la pipeta iontoforético sin inducir foto-daño del tejido. De manera óptima, utilizar un sistema de dos fotones y reducir la potencia del láser y los tiempos de permanencia tanto como compatible conuna calidad de imagen decente. Si se utiliza una fuente de luz más convencional, asegúrese de reducir el tiempo de exposición tanto como sea posible, por ejemplo, mediante el uso de obturadores mecánicos o activación eléctrica. Probablemente el punto más crítico es el diseño de pipeta, lo que permitirá una aplicación definida y específica del neurotransmisor utilizado. Este paso requiere un poco de esfuerzo y tiempo para encontrar los ajustes óptimos. A continuación, presentamos protocolos para iontoforesis glutamato y GABA, si se utilizan otros neurotransmisores, bloqueadores o moduladores, es necesario que la sustancia está muy concentrado y aún más importante que la que se carga. Por ejemplo, desde GABA tiene una carga neta de cero a un pH de 0, el pH tiene que ser ajustada (ver sección Protocolo 2), lo que resulta en una carga neta positiva.
Cuando se establece micro-iontoforesis, que proporcionará un conjunto de herramientas extendida para estudiar la integración sináptica en las neuronas. Se permite estimular las sinapsis de interés selectivamente conun neurotransmisor en particular. El uso de un neurotransmisor seleccionados en ubicaciones definidas, las corrientes postsinápticas y potenciales y su propagación puede ser investigado. Además, es posible utilizar varios electrodos iontoforéticos simultáneamente para investigar la integración de varias entradas glutamatérgicas o cambiar sistemáticamente el tiempo relativo o la fuerza de los acontecimientos.
Algunos puntos críticos en general tienen que ser considerados cuando se utiliza micro-iontoforesis. El perfil de la concentración de neurotransmisores después de micro-iontoforesis es diferente de la liberación endógena. Murnick y otros 10 informaron de que es probable que sea significativamente más lenta que la liberación sináptica de las vesículas, lo que ocurre en fracciones de un milisegundo (0,2 mseg) 26 la velocidad de liberación de la punta iontoforesis (alrededor de 1 mseg). Además, la difusión hacia y desde la hendidura sináptica está desacelerando probable aumento de concentración y la decadencia de los neurotransmisores aplicados por iontoforesis.Por otra parte, es probable que sea mayor que los volúmenes depurados fisiológicamente, sin embargo, con electrodos de alta resistencia, de un solo glutamatérgicas y GABAérgicas postsynapses el volumen de neurotransmisor expulsado puede ser activado utilizando micro-iontoforesis 10-12. Una selectividad espacial en el intervalo de unos pocos micrómetros, recientemente, también ha sido alcanzado por uncaging de dos fotones de los neurotransmisores 3,4,27.
Aunque considerablemente más coste intensivo, uncaging de dos fotones tiene varias ventajas sobre los micro-iontoforesis. En particular, se puede utilizar para la liberación de neurotransmisores simultáneamente en múltiples sitios sinápticos y no requiere el posicionamiento preciso de una punta de electrodo fina. Sin embargo, también tiene algunas desventajas importantes a considerar al seleccionar un método para un experimento particular. Muchos compuestos enjaulados tienen efectos secundarios no deseados, tales como el bloqueo de receptores de neurotransmisores 28. Por ejemplo, muchos glutamato y GABA jaulasse ha informado de interferir con la inhibición GABAérgica. Además, la potencia relativamente alta de láser requerida para uncaging de dos fotones puede resultar en foto-daño de la neurona postsináptica, en particular cuando la estimulación se aplica repetidamente durante varios minutos. Por otra parte, mientras que micro-iontoforesis está limitada en el número de sitios estimulados, estos sitios pueden ser elegidos libremente en todo el árbol dendrítico de una neurona, por ejemplo, en las dendritas distales y basal, al simular la entrada sináptica en capas de diferentes regiones del cerebro. Dos fotones uncaging, ya que se utiliza actualmente por la mayoría de los grupos, se limitará a los sitios sinápticos en un plano focal particular, y en el campo de visión, que depende del objetivo utilizado (típicamente 40X o 60X inmersión en agua). Se tiene que tener en cuenta que ambas técnicas siempre conducen a la activación de los receptores de extrasinápticos, lo que puede hacer más difícil la interpretación de los resultados.
Otra desventaja de las micro-iontoforesis es que oólo el postsynapse puede activarse. Si la función presináptica y la función de la vesícula-lanzado neurotransmisor necesario establecer en el enfoque experimental, la estimulación sináptica eléctrica local puede ser un método de elección. Sin embargo, las desventajas de la estimulación sináptica eléctrica en comparación con micro-iontoforesis son la ubicación desconocida de las sinapsis activadas y la co-activación de los axones de diferentes poblaciones neuronales, potencialmente pertenecientes a otros sistemas de neurotransmisores (Tabla 1).
En resumen, la ventaja más importante de micro-iontoforesis es, en nuestra opinión, que es posible utilizar varios neurotransmisores diferentes y estudiar su interacción en compartimentos neuronales como dendritas 9.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Hans Reiner pólder, Martin Fuhrmann y Walker Jackson para leer detenidamente el manuscrito. Los autores recibieron financiación que fue proporcionada por el Ministerio de Investigación MIWF del estado de Renania del Norte-Westfalia (SR), el BMBF-Projekträger DLR colaboración entre Estados Unidos y Alemania en neurociencia computacional (CRCNS, SR), Centros de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas (COEN; SR), y la Universidad del programa de financiación habitual Bonn (BONFOR; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
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