Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

Summary

We beschrijven een analysemethode om de levensduur van glutamaat schatten op astrocytaire membranen van elektrofysiologische opnames van glutamaat transporter stromingen in astrocyten.

Abstract

De hoogste dichtheid van glutamaat transporters in de hersenen wordt gevonden in astrocyten. Glutmaattransporters paar de beweging van glutamaat door het membraan met de co-transport van 3 Na ⁺ en 1 H ⁺ en de contra-transport van 1 K ^+. De stoichiometrische huidige gegenereerd door het transport proces kan worden bewaakt met whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten. Het tijdsverloop van de opgenomen stroom wordt gevormd door het tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel die astrocyten worden blootgesteld, de kinetiek van glutamaattransporters en de passieve eigenschappen van elektrotone astrocytaire membranen. Hier beschrijven we de experimentele en analytische methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaattransporter stromen in astrocyten registreren en isoleren het tijdsverloop van glutamaat toestemming van alle andere factoren die de vorm van de golfvorm van astrocytaire transporter stromen. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om een ​​schatting van de levensduur of flash-Uncaged en synaptically-uitgebracht glutamaat bij astrocytaire membranen in elke regio van het centrale zenuwstelsel tijdens gezondheid en ziekte.

Introduction

Astrocyten een van de meest voorkomende soorten cellen in de hersenen met stervormige morfologie en fijne membraan uitsteeksels die zich uitstrekken over de hele neuropil en bereiken naburige synaptische contacten ^1,2. Celmembraan van de astrocyten 'is boordevol glutamaat transporter moleculen ^3. Onder fysiologische omstandigheden glutmaattransporters snel glutamaat binden aan de extracellulaire zijde van het membraan en overbrengen naar het cel cytoplasma. Door dit te doen, de vervoerders te handhaven lage de basale concentratie van glutamaat in de extracellulaire ruimte ^4. Glutamaat transporters in fine astrocytaire processen grenzend aan synapsen prikkelende zijn ideaal gepositioneerd om glutamaat vrijkomt tijdens synaptische gebeurtenissen als het verspreidt weg van de synaptische spleet te binden. Door dit te doen, de vervoerders beperken ook glutamaat spillover naar peri-en extra-synaptische regio's en op naburige synapsen, het verminderen van de ruimtelijke verspreiding van prikkelende signaals in de hersenen ^5-7.

Glutamaat transport is een elektrogene proces stoichiometrisch gekoppeld met de beweging van 3 Na ⁺ en H ⁺ 1 langs hun elektrochemische gradiënt en de contra-transport van 1 K ^{+ 8.} Glutamaat transport wordt geassocieerd met (maar niet stoichiometrisch gekoppeld aan) een anionisch geleidbaarheid permeabel voor SCN ^- (thiocyanaat)> NO ₃ ^- (nitraat) ≈ ClO ₄ ^- (perchloraat)> I ^-> Br ^-> Cl ^-> F ^-, niet tot CH ₃ SO ₃ ^- (methaansulfonaat) en C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- (gluconaat) ^9-11. Beide stromingen (stoichiometrische en niet-stoichiometrische) kan worden opgenomen door het verkrijgen van whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten, visueel geïdentificeerd onder Dodt verlichting of voor infrarode differentieel interferentie contrast (IR-DIC) in acute hersenplakjes ^12. De stoichiometrische component van de huidige in verband met glutamaat transport over het membraan kan worden geïsoleerd door CH ₃ SO ₃ ^-, of C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- gebaseerde intracellulaire oplossingen en kunnen worden opgeroepen door flash-uncaging glutamaat op astrocyten ^13,14, of door het activeren van glutamaat afgifte van naburige synapsen, die elektrisch ¹² of met een gerichte optogenetic controle.

Het tijdsverloop van de stoichiometrische component van de huidige transporteur wordt gevormd door de levensduur van de glutamaatconcentratie profiel op astrocyten membranen (bijvoorbeeld glutamaat klaring), de kinetiek van glutmaattransporters, passief membraan eigenschappen van astrocyten en tijdens synaptische stimulaties de synchroniciteit van de afgifte van glutamaat in de geactiveerde synapsen ^13. Hier beschrijven we in detail: (1) een experimentele approach de stoichiometrische component van glutamaattransporter stromen van whole-cell patch-clamp van astrocyten in acute muis hippocampale plakken als voorbeeld experimenteel isolaat preparaat, (2) een benadering tot de tijdsduur van glutamaat klaring ontlenen deze opnamen ^{13, 14.} Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het opnemen en analyseren glutamaattransporter stromen van astrocyten in gebieden van het centrale zenuwstelsel.

Protocol

1. Slice Voorbereiding

1. Bereid 500 ml snijden / storage oplossing die (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 _CaCl2, 1,3 _MgSO4 · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26.2 _NaHCO3 1 NaH ₂ PO ₄ en 22 glucose, 320 mOsm, pH 7,4
2. Gebruik een bekerglas van 250 ml een onderdompeling kamer voor te bereiden op de schijfjes, vul het met 200 ml slicing / storage-oplossing, opwarmen in een waterbad bij 34 ° C en bel het met 95% O _2, 5% CO _2.
3. Houd de resterende slicing / storage oplossing in een glazen fles bij 4 ° C.
4. Gebruik een cyanoacrylaat lijm op een klein agar blok (6%, bereid in ACSF) bevestigen op de vibratome monsterhouder en bewaard bij 4 ° C.
5. 30 min voor aanvang van snijden, plaatst u de glazen flacon met het snijden / storage-oplossing in een emmer gevuld met ijs en bel het met 95% O _2, 5% CO _2.

6. Verdoven van de muis (P14-21, C57BL / 6) met halothaan / isofluraan (isofluraan is gemeld aan astrocytaire opname glutamaat verbeteren ^15), onthoofden, en dompel de kop in een bekerglas van 50 ml bevat zuurstofrijk, koude slicing / storage-oplossing.
7. Voer de dissectie van de hersenen op ijs omwikkeld met papieren handdoeken en opgeslagen bij -20 ° C.
8. Gebruik een scalpel om een ​​mid-sagittale incisie in de huid aan de dorsale zijde van het hoofd te maken, van de frontale aan het caudale einde, en bloot de schedel.
9. Plaats de onderste schaarblad van een klein paar van chirurgische schaar in de occipitale opening en maak twee sneden, naar links en aan de rechterkant (hoek van 45 °).
10. Snijd de schedel langs de mid-sagittale lijn, van de staartwervels tot de frontale einde.
11. Verwijder de hersenen met een spatel en dompel het in zuurstofrijk, koude slicing / opslag solutiop.
12. Met een scalpel, maken vijf bezuinigingen op: (1) Verwijder de olfactorische bollen en de frontale cortex, (2) verwijder de kleine hersenen, (3) verwijder de linker-en (4) rechter temporale kwabben; (5) scheiden de twee hersenhelften met een mid-sagittale snede.
13. Dep de twee delen van de hersenen met papieren handdoeken om alle overmaat oplossing te verwijderen.
14. Lijm het mantelvlak van elke sectie hersenen naar de koude vibratome voetplaat de dorsale kant van de hersenen moet naar de vibratome blade, de ventrale kant van de hersenen moet in contact met de agar blok verwijderd van de vibratome mes.
    Opmerking: de hoogste kwaliteit segmenten verkrijgen, is het belangrijk dat de twee delen van de hersenen stevig vastgelijmd aan de vibratome basisplaat. Om dit te doen, gebruik dan een cyanoacrylaat lijm die is niet te vloeibaar en die niet droogt te snel uit.
15. Beveilig de vibratome bodemplaat om het ontleden kamer, zet de slice steickness tot 250 urn en aanpassen van de breedte van het blad run. Ga verder met snijden.
    Opmerking: Als alles goed georiënteerd is, dient de vibratome te snijden parasagittal segmenten van de dorsale en ventrale richting van de mediale naar de zijkant van de hersenen.
16. Als het mes door de cortex en de hippocampus is gepasseerd, gebruik een scalpel aan de cortex / hippocampus van de middenhersenen gesneden en leg elke plak in de onderdompeling kamer bij 34 ° C.
17. Gooi de eerste paar plakjes. Meestal kan 12 plakjes (250 micrometer dik) worden verkregen uit een P14-21 hersenen van muizen.
18. Houd de schijfjes bij 34 ° C gedurende 30 minuten en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat ze voor de elektrofysiologie opnames.

2. Astrocyten Identificatie en Recordings

1. Bereid een interne oplossing die (in mM): 120 KCH ₃ SO _3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0,2 NaGTP,5 QX-314Br en 5 NaCl, 290 mOsm, pH 7,2.
2. Bereid een extracellulaire oplossing die (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 _CaCl2, 1,3 _MgSO4 · 7H ₂ O, 1 _MgCl2, 26.2 _NaHCO3 1 NaHPO ₄ en 22 glucose, 300 mOsm, pH 7,4 , verzadigd met 95% _O2, 5% _CO2.
3. Voeg de volgende geneesmiddelen de extracellulaire oplossing, tot activering van gluA, Glun, mGluRII, mGluRIII, GABA _A GABA _B en A1 adenosine receptoren (in uM) blokkeert: 10 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [ƒ] chinoxaline-7-sulfonamide dinatriumzout (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1-fosfonzuur (CPP), (2S )-2-Amino-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-yl] -3 - (Xanth-9-yl) propaanzuur-natriumzout (LY341495), 100 (R, S)-α- methylserine-O-fosfaat (SOIC), 100 picrotoxine, 5 3 - [[(3,4-dichloorfenyl) methyl] amino] propyl] diethoxymethyl) fosfinzuur (CGP52432), 18-cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX).
4. Stel de temperatuur van de oplossing in de extracellulaire opname kamer, typisch temperaturen tussen 34 - 36 ° C.
5. Bereid patch-clamp elektroden van borosilicaatglas haarvaten (R ≈ 2,5 MQ) met een dual-stage, glazen micro-pipet trekker.
6. Neem een ​​van de plakjes en leg deze in de opname kamer. Houd deze ingedrukt met een metalen harp gemaakt met platina draad en nylon snaren.
7. Inspecteer de sneetjes onder Dodt verlichting of IR-DIC. Astrocyten kunnen worden geïdentificeerd door hun kleine cellichaam (Ø = 10 urn) en prominente nucleus (Figuur 1).
8. Voor synaptische stimulaties, plaats een bipolaire RVS electrode, ~ 100 micrometer uit de buurt van de astrocyten die u van plan bent om te patchen.
9. Patchen van de astrocyten en breken in het whole-cell configuratie door het toepassen van een zeer zachte zuigkracht.
   Opmerking: Astrocytes hebben meestal een lage input resistance (~ 10 MQ), hyperpolarized rustmembraanpotentiaal (~ -90 mV), en geen vuren activiteit. De astrocyten worden bewaard in de rust membraanpotentiaal gedurende de experimenten in de voltage-clamp-modus (dwz de houdstroom moeten lezen 0 pA). Vóór elke stimulatie, wordt een 10 ms hyperpolarizing spanning stap (-3 mV) gebruikt om de serie en input weerstand van de astrocyten te controleren.
10. Gooi de opnamen als de serieweerstand veranderingen> 20% of indien de membraanpotentiaal van de astrocyt wordt gedepolariseerd. De membraanpotentiaal van de astrocyt direct worden gemeten door het overschakelen van voltage-clamp bij lopende-clamp modus. Alternatief, terwijl in voltage-clamp mode, de membraanpotentiaal kan worden gevolgd door het lezen van de waarde van de met potentieel resulteert in 0 pA houdstroom.
11. Als synaptische stimulaties in dienst zijn, afwisselend enkele en gekoppelde stimuli (bv. 100 msec uit elkaar), elke 10 - 20 sec.
12. Voor UV fotolyse experimouders, sluit u een uncaging Xe lamp aan de epifluorescente poort van de microscoop en voeg de gekooide verbinding aan de extracellulaire oplossing. Transporter stromingen van ~ 100 pA amplitude kan worden verkregen bij het ​​flash-uncaging 100 uM MNI-L-glutamaat in het hele gezichtsveld (Ø = 662,5 urn bij het ​​gebruik van een 40x doelstelling ^14). Alternate stimulaties met het lichtpad open en geblokkeerde, elke 10 - 20 sec.
13. Roepen glutamaat transiënten en opnemen transporter stromen onder controle condities en in aanwezigheid van een sub-verzadigende concentratie van de breed-spectrum glutamaattransporter antagonist D, L-threo-β-Benzyloxyaspartic acid (TBOA, 10 uM) aan de transporteur stroomamplitude verminderen ten minste 30% van de controlewaarde (zie hoofdstukken 4, 5) of in de aanwezigheid van een hoge concentratie TBOA (50 - 100 uM) aan transporter stromen volledig te blokkeren en te isoleren ^+-stroom de aanhoudende K (zie sectie 3) .

3. Pharmacsche Isolatie van de Sustained K ^+-stroom

1. Noteer astrocytaire stromen onder controle condities en in aanwezigheid van een hoge, verzadigende concentratie TBOA (50 - 100 uM).
2. Gemiddeld ten minste 20 veegt TBOA (50 - 100 uM).
3. Breng de gemiddelde sporen verkregen in 3.2 met de functie:
   
   Opmerking: de TBOA-ongevoelige component (dwz degene die is opgenomen in de aanwezigheid van TBOA (50 - 100 uM)) vertegenwoordigt ^+-stroom de aanhoudende K. Het tijdsverloop hiervan wordt benaderd door de mono-exponentiële functie hierboven beschreven.
4. Herhaal deze fit over verschillende astrocyten en ontlenen een gemiddelde waarde van Τ _stijging (dwz de gemiddelde stijgtijd van de aanhoudende K ^+-stroom (zie paragraaf 5)).

4. Ikvertroosting van het vereenvoudigde Gedeelte van synaptically-Activated Transporter Currents (fSTCs)

1. Gemiddeld ten minste 20 sweeps verkregen met gepaarde stimulaties, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM) (Figuur 2a links).
2. Gemiddeld een identiek aantal sweeps verkregen met enkele stimulaties, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM) (Figuur 2a midden).
3. Vergelijk de amplitude van de gemiddelde stroom reactie op de -3 mV spanning stap in de vier sporen gemiddelde (control pulslengte control gepaarde pulsen TBOA pulslengte TBOA gepaarde pulsen).
4. Als de amplitude van de huidige reactie is hetzelfde in alle vier de sporen, gaat u naar stap 4.7.
5. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom respons verschillend in elk van de vier sporen of alle afzonderlijke sporen dient te worden opgenomen in het gemiddelde.
6. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom verschilt in elk van de vier sporen, maar individu sporen geschikt worden opgenomen in de gemiddelde, toe dat op elk spoor van de grootte van de FSTC schalen lineair met de grootte van de huidige reactie op de testspanning stap. Als dit het geval is, schalen alle sporen ten opzichte van elkaar zodat de stroom reacties op de testspanning stap allemaal gelijk in amplitude.
   Opmerking: In de opname-omstandigheden hier beschreven (dwz intracellulair CH ₃ SO ₃ ^- of C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), synaptische stimulatie van prikkelende axonen genereren astrocytaire stromingen met complexe golfvormen bestaande uit een snel stijgende voorbijgaande innerlijke stoichiometrische stroom en een langzame -stijgende, opgelopen naar binnen K ^+-stroom reflecterende K ⁺ re-evenwicht in de extracellulaire ruimte na actiepotentiaal voortplanting langs naburige axonen. Het is cruciaal om deze aanhoudende K verwijderen ^+-stroom, als elke reststroom zou leiden tot eenoverschatten van glutamaat leven.
7. Trek de gemiddelde trace verkregen met enkele prikkeling van de gemiddelde trace verkregen met gepaarde prikkeling (Figuur 2a rechts). Deze stap maakt het isoleren van de stoichiometrische en de aanhoudende K ^+-stroom opgewekt door de tweede stimulus.
8. Verschuiving van de gemiddelde trace met enkele stimulaties verkregen door een tijdsinterval dat overeenkomt met het interval tussen pulsen gebruikt om gepaarde-pulsen (dwz 100 msec) (Figuur 2b) te leveren.
9. Trek de tijd verschoven gemiddelde respons verkregen met enkele prikkeling van de gemiddelde respons op de tweede stimulus verkregen in 4.7 (figuur 2c). Deze stap isoleert het vergemakkelijkt gedeelte van de vervoerder huidige opgeroepen door de tweede stimulus (de FSTC).
10. In de meeste gevallen, de vorige stap verwijdert volledig de aanhoudende K ^+-stroom. Als dit het geval is, de isolatie van de FSTC is voltooid en u kunt proceed met de deconvolution analyse en ontlenen het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten. In sommige gevallen echter, een kleine aanhoudende K ^+-stroom is nog steeds aanwezig is (figuur 2d) en verdere analyse nodig is (zie hoofdstuk 5).
    Opmerking: vergeet niet dat het in 4,7-4,10 beschreven analyses moeten worden uitgevoerd op de gemiddelde sporen verkregen in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).

5. Aftrekken van de resterende zdustained K ^+-stroom van fSTCs

1. Meet de amplitude van de aanhoudende K ^+-stroom overblijft na het uitvoeren van de in hoofdstuk 4 beschreven analyse.
2. Schaal de amplitude van de mono-exponentiële functie 3.3 de amplitude van de resterende aanhoudende K ^+-stroom gemeten in 5.1 (figuur 2d links en midden). Om dit te doen, in vergelijking 3.3, stelt de term A is gelijk aan de amplitude van de aanhoudende K ^+-stroom measured in 5.1 en de term Τ _stijging is gelijk aan de gemiddelde waarde van Τ _stijging geraamd in 3.4.
3. Trek de resulterende mono-exponentiële functie van de FSTC en aanhoudende K ^+-stroom verkregen in 4.10 (figuur 2d rechts). Deze stap voltooit het isolement van de FSTC.

6. Isolatie van Flash-geactiveerde Transporter Currents (FTCs)

1. Gemiddeld ten minste 20 sweeps verkregen met het licht pad geopend, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
2. Gemiddeld een identiek aantal sweeps verkregen met het lichtpad gesloten, in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
3. Vergelijk de amplitude van de stroom reactie op de -3 mV spanning stap in de vier sporen gemiddelde (control pulslengte control gepaarde pulsen TBOA pulslengte TBOA gepaarde pulsen).
4. Als de amplitude van de huidige reactie is hetzelfde in alle vier de sporen, gaat u naar stap 6.7.
5. Indien de amplitude van de gemiddelde stroom verschilt in elk van de vier sporen, maar alle individuele sporen geschikt worden opgenomen in de gemiddelde, toe dat op elk spoor van de lichtbundel lineair opent de grootte van de FTC schalen met de grootte van de huidige reactie op de testspanning stap. Als dit het geval is, schalen alle sporen ten opzichte van elkaar zodat de stroom reacties op de testspanning stap allemaal gelijk in amplitude.
   Opmerking: in de opnameomstandigheden hier beschreven (dwz intracellulair CH ₃ SO ₃ ^- of C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), flash stimuli genereren astrocytaire stromingen alleen bestaat uit het snel stijgende voorbijgaande stoichiometrische innerlijke stroom.
6. Trek de gemiddelde trace verkregen met het licht path geblokkeerd uit de gemiddelde trace verkregen met het lichtpad geopend. Deze stap maakt het verwijderen van de stimulus artefact en het isoleren van de FTCs.
   Opmerking: de in 6.7 beschreven analyses moeten worden uitgevoerd op de gemiddelde sporen verkregen in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).

7. Deconvolution analyse

1. Breng de transporteur huidige (FSTC of FTC) opgenomen in controle omstandigheden (figuur 3a links) en in TBOA (10 uM) (Figuur 3a rechts) en geïsoleerde zoals beschreven in paragraaf 4 - 6, met de multi-exponentiële functie:
   
2. Maak een ogenblikkelijk stijgende functie die vergaat mono-exponentieel afhankelijk van de functie:
   
   endie het beste de rottende fase van de vervoerder huidige opgenomen in TBOA (10 uM) (Figuur 3b).
   Opmerking: de functie 7,2 (ie H (t)) beschreven geeft het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten in aanwezigheid van TBOA (10 uM).
3. Deconvolve de mono-exponentiële functie verkregen 7,2 (figuur 3b en 3c midden) van de fit van de huidige transporteur opgenomen TBOA (10 uM) verkregen 7,1 (fig. 3a rechts, links c).
   Opmerking: deconvolutie is een wiskundige bewerking opgenomen in vele analyse software pakketten zoals (bv. Matlab, Python). In IgorPro, de programmeercode die we doorgaans gebruiken om dergelijke analyses uit te voeren, de deconvolutie bewerking efficiënt worden berekend zoals hieronder beschreven, door discrete Fourier transformaties. Gebruik eerst de FFT operatie om de di berekenenscrete snelle Fourier-transformatie van het mono-exponentiële functie verkregen in 7.2 en de pasvorm van de huidige transporteur opgenomen in TBOA verkregen 7.1. Vervolgens gebruikt de IFFT operatie om de inverse discrete snelle Fourier transformatie van de verhouding van de twee functies FFT berekenen. De resulterende functie I (t) kan als volgt worden omschreven:
   
   De in stap 7.3 beschreven kan afleiden van de filter van de huidige transporteur in TBOA (10 uM) (figuur 3c rechts). Het filter vertegenwoordigt de vervorming factoren die de levensduur van glutamaat te converteren in astrocytic membranen in de transporter huidige geïsoleerd in secties 4-6 (dwz de FSTC of FTC).
4. Deconvolve het filter (figuur 3c rechts, figuur 3d midden) van de fit van de transporter stroom in controle omstandigheden (figuur 3a figuur 3d links).
   Opmerking: deze stap kan afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten in controle omstandigheden (figuur 3d rechts). De veronderstelling achter deze deconvolution stap is dat het tijdelijke profiel van het filter ongewijzigd blijft in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM).
5. Een kwantitatieve schatting van de totale tijdsverloop van glutamaat verklaring te verkrijgen, berekent het zwaartepunt (<t>) van de golfvorm verkregen in stap 7.4. Dit wordt gedaan door berekening <t> als:
   
   waarin G (t) is de golfvorm verkregen in stap 7.1. In de hierboven beschreven vergelijking, de term t is de tijdspanne waarover het raam integraal berekend.
   Opmerking: wanneer de methode voor het eerst werd vastgesteld,<t> werd berekend over tijdvensters die overgebleven waren ongedwongen ^13. Deze benadering kan worden gebruikt zolang als het venster integratie wordt ingesteld groter dan de duur van glutamaat en de goedkeuring golfvorm vervalt weer helemaal baseline. Indien dit niet het geval is, deze wijze van schatten <t> ontmoet enkele beperkingen. Als bijvoorbeeld de golfvorm speling niet precies terug wegsterft basislijn, dan <t> toeneemt met de breedte van het venster integratie. Om potentiële bron van onnauwkeurigheid van de schatting van <t> voorkomen, berekenen we nu het over een tijdsinterval dat overeenkomt met 10% van de piek van de huidige transporteur, vóór en na het begin ^14. De laatste benadering verbetert de consistentie waarmee <t> wordt gemeten over cellen. Dit is handig vooral bij de analyse van kleine effecten van farmacologische behandelingen op het tijdsverloop van klaring.

Representative Results

Het succes van de analytische benadering hier beschreven kritisch is afhankelijk van het verkrijgen van hoge kwaliteit elektrofysiologische opnames van transporter stromen van astrocyten in elke regio van het centrale zenuwstelsel. In acute muis hippocampale plakken, kan astrocyten gemakkelijk worden geïdentificeerd onder Dodt verlichting of IR-DIC vanwege hun kleine cellichaam (Ø = 10 micrometer) en prominente nucleus (Figuur 1). De onderscheidende stervormige morfologie worden gesteld met epifluorescentie, confocale of twee-foton laser scanning microscopie, bij aanbrenging van een fluorofoor zoals Alexa 594 (50 uM) aan de intracellulaire oplossing (figuur 1). Op de elektrofysiologie niveau worden astrocyten gekenmerkt door lage input weerstand, hyperpolarized membraanpotentiaal (~ -90 mV) en het onvermogen om actiepotentialen te genereren. Astrocytes genereren stromen in reactie op elektrische of optogenetic stimulatie van aangrenzende neuronen en UV fotolyse van caged verbindingen zoals MNI-L-glutamaat.

Astrocytaire transporter stromen kunnen worden opgenomen met Cs ⁺ of K ⁺ gebaseerde interne oplossingen. Merk op dat Cs ^+, een populaire K ⁺ vervanger, ondersteunt glutamaat vervoer, maar vertraagt ​​de glutamaat transporter fietsen tarief ^16,17 (omdat glutamaat transporters bind-en / of verplaatsen Cs ⁺ over de membraan langzamer dan K ^+). Als Cs ⁺ vermindert aanzienlijk het aantal vervoerders beschikbaar voor binding glutamaat, het leidt ook tot kleinere / langzamere transporter stromen dan die opgenomen zijn met K ⁺ gebaseerde interne oplossingen ^16,17.

Bij gebruik _CH3 SO ₃ ^- of C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- de belangrijkste intracellulaire anion, de stroom die glutamaattransporters in astrocyten komt door de stoichiometrisch gekoppelde beweging van glutamaat 1, 3 Na + en K ⁺ 1 over het membraan. Dit stoichiometrische stroom is de enige opgenomen van astrocyten in fotolyse experimenten en we verwijzen naar het als de FTC. Bij het uitvoeren van fotolyse experimenten, is het aanbevolen om alternatieve UV stimulaties verkregen met het lichtpad open en geblokkeerd. De sporen verkregen met het lichtpad geblokkeerd zijn nuttig om de stimulus artefact gegenereerd door de flitslamp en kan worden afgetrokken van degenen verkregen met het lichtpad open voor perfect isoleren van de FTC te isoleren.

De stroom die in astrocyten bij oproepen synaptische afgifte van glutamaat een complexer golfvorm. Het bestaat uit een snel stijgende, voorbijgaande actieve bestanddeel door de stoichiometrisch gekoppelde glutamaattransporter stroom boven beschreven. Bovendien omvat een langzaam stijgende, duurzame actieve K ^+-stroom door instroom van K ⁺ verzameld in de extracellulaire ruimte na actiepotentiaalvoortplanting langs naburige axonen. Een farmacologische benadering kan worden gebruikt om de stroom van de transporter aanhoudende K ^+-stroom isoleren en vereist het gebruik van hoge concentraties van de breed-spectrum glutamaattransporter antagonist TBOA (100 uM) aan het eind van het experiment ^12. De hier beschreven methode wordt een zuiver benadering tot de glutamaattransporter stroom van de aanhoudende K ^+-stroom en dus maakt kortere experimenten (figuur 2) te isoleren.

Als eerste stap, interleaven we een-en gepaarde-pulse synaptische stimulaties (100 msec uit elkaar), elke 10 - 20 seconden, en gemiddeld een gelijk aantal van de sweeps verkregen met enkel-en gepaarde-pulse stimuli. De amplitude van de eerste stroom opgewekt door de gepaarde stimuli moet overeenkomen met de amplitude van de stroom opgewekt door de interne stimulus. We beginnen deze analyse door het aftrekken van de huidige opgeroepen door de enkele stimulans van die opgeroepen worden doorde gekoppelde stimuli. Het aftrekken kan isoleren van de reactie op de tweede stimulus, die eveneens bestaat uit een snel stijgende, voorbijgaande glutamaattransporter stroom en een langzaam stijgende, aanhoudende K ^+-stroom (figuur 2a rechts). Next, we verschuiven de reactie op de interne stimulus een tijdinterval dat overeenkomt met het interval tussen pulsen van de gepaarde stimuli, zodat het tijdstip van aanvang van de responscode die overeenkomt met het tijdstip van aanvang van de tweede reactie hierboven geïsoleerd (Figuur 2b ). Door het aftrekken van deze twee stromingen, isoleren we de vergemakkelijkt gedeelte van de vervoerder stroom, die hier noemen we FSTC (figuur 2c). De kinetiek van de FSTC lijken op de kinetiek van het synaptisch-geactiveerde transporter stroom (STC) farmacologisch die met hoge concentraties glutamaat transporter antagonist TBOA (100 uM) ^13. Om deze reden en voor de eenvoud, in eerder werk noemden we het FSTCals STC ^13,14. Ondanks het feit dat stromingen met vergelijkbare eigenschappen, fSTCs en STC's zijn niet dezelfde stroom. Om deze reden en op juistheid, in dit werk, zullen we expliciet verwijzen naar hen als fSTCs en STC's. De aftrekken hier beschreven methode een accurate isolatie van fSTCs de meeste opnames. Echter, in sommige gevallen, een resterende aanhoudende K ^+-stroom nog aanwezig. In dit geval moet de voortdurende isoleren K ^+-stroom in afzonderlijke experimenten met hoge concentraties TBOA (50 - 100 uM). Het tijdsverloop van de farmacologisch geïsoleerde aanhoudende K ^+-stroom kan worden beschreven door een mono-exponentiële functie in de vorm:

Door het opnemen van astrocytaire stromingen in verschillende cellen, schatten we de gemiddelde waarde van Τ _stijgen. We volgende createa mono-exponentiële functie zoals hierboven beschreven, waarbij Τ _aanleiding overeenkomt met de gemiddelde waarde van Τ _stijging experimenteel gemeten in verschillende astrocyten en A overeenkomt met de amplitude van de resterende aanhoudende K ^+-stroom die we willen verwijderen (figuur 2d ).

De methode die we zojuist beschreven om fSTCs isoleren werkt goed wanneer het oproepen van glutamaat afgifte van het faciliteren van synapsen en kan ook gebruikt worden om afgifte van glutamaat uit synapsen die gepaarde-pulse depressie ondergaan studeren. Het is echter van weinig nut als de glutamaat synapsen onder studie geen enkele duidelijke vorm van kortlopende facilitatie of depressie niet tonen. In dit geval, de farmacologische isolatie van transporter stromen met hoge concentraties TBOA (100 uM) blijft de meest haalbare oplossing voor het isoleren stoichiometrisch-gekoppelde, synaptisch geïnduceerde glutamaattransporter stroom.

(dwz zonder blokkeren geheel). Het doel hier is om te vertragen aanzienlijk het tijdsverloop van de vervoerder stroom zonder verlies van de mogelijkheid om het te onderscheiden van het lawaai van de opnames. Uitgangspunt is dat de aanwezigheid van een kleine concentratie van TBOA, wanneer de opnamecapaciteit van astrocyten is verminderd, de belangrijkste bepalende factor het verval van de huidige transporteur de geleidelijke afname van de glutamaat concentratie astrocytic het membraan ^12,18. We passen de vervoerder stroom in controle omstandigheden en in TBOA (10 uM) met de multi-exponentiële functie:

(Figuur 3a). We benaderen de glutamaat speling in TBOA (10 uM) met een direct-stijgende functie met mono-exponentieel verval (figuur 3b) en we deconvolve het van de multi-exponentiële functie beschrijven van de huidige vervoerder in TBOA (10 uM; figuur 3c). De resulterende golfvorm is de "filter", en vertegenwoordigt de combinatie van factoren die vervormen (dwz filter) de glutamaat concentratie profiel in de transporter huidige (figuur 3c). Deconvolving het filter van de multi-exponentiële fit van de transporter stroom in controle omstandigheden maakte het mogelijk de tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel wordt opgenomen astrocyte in controle omstandigheden (figuur 3d). Hiervoor deconvolutie analyse veronderstellen we dat de kinetiekvan het filter zijn niet gewijzigd in de afwezigheid en in de aanwezigheid van TBOA (10 uM). Dit is een redelijke veronderstelling omdat alle factoren die bijdragen aan het filter (dwz transporter kinetiek, elektrotone filtering en tijdens synaptische stimulaties asynchrone afgifte van glutamaat over synapsen) waarschijnlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van TBOA, een verbinding die het aantal vermindert van vervoerders beschikbaar voor binding glutamaat.

We gebruiken het zwaartepunt (<t>) als maat voor de glutamaat levensduur tot astrocyten membranen in verschillende cellen. <t> Vertegenwoordigt het "zwaartepunt" van de golfvorm klaring, en gevoelig voor veranderingen in zowel de stijgtijd en verval van de glutamaat klaring golfvorm. Het zwaartepunt wordt uitgedrukt als:

class = "jove_content"> Er zijn twee manieren om het tijdsinterval waarover we kunnen de integralen te berekenen op de teller en de noemer van deze uitdrukking te beslissen. Omdat de golfvorm klaring stijgt van en vervalt terug naar nul, wanneer de methode voor het eerst werd vastgesteld, was er geen specificatie gemaakt over hoe het venster integratie gezet, en in feite was dit nogal losjes ¹³ gedaan. Een manier om dit probleem is om het venster integratie ¹⁴ te beperken tot de tijd die het kost om een willekeurig deel van de FTC / FSTC top te bereiken, bijvoorbeeld 10%. Deze eenvoudige criterium kan consequent het uitvoeren van deze analyse in verschillende cellen, verbetert de nauwkeurigheid van de schattingen van <t> wanneer de golfvorm speling niet volledig verval tot nul, en verbetert de gevoeligheid van de analyse van kleine verschillen in klaring golfvormen die misschien voorkomen in verschillende groepen cellen.

e 1 "fo: content-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figuur 1. Identificatie van astrocyten in acute hippocampus plakjes. (Ab) Dodt beelden van hippocampus astrocyten in CA1 stratum radiatum. Onder Dodt verlichting en IR-DIC, kunnen astrocyten worden geïdentificeerd door hun kleine cel lichaam en prominente kern. De rode pijlen wijzen naar meerdere astrocyten die in preparaat plakjes kunnen worden geïdentificeerd. De gele pijl geeft astrocyte dat is genaaid en gevuld met een fluorescente kleurstof (zie hierna). (Cd) Overlaid Dodt beeld van de hippocampus plakjes en twee-foton van de gepatchte astrocyten, gemarkeerd met een gele pijl in (ab). Voor dit experiment werden astrocyten hersteld en gevuld met een KCH ₃ SO ₃ - gebaseerde interne oplossing toegevoegd met Alexa 594 (50 uM). De astrocytaire processen uit te breiden enkele tientallen micrometer weg van thij lichaamscel. De annotaties van de linker bepalen de drie belangrijkste cellulaire lagen van het hippocampale CA1 formatie die kan worden opgenomen in de segmenten.

Figuur 2. Isolatie van fSTCs uit synaptically-geactiveerde transporter stromen opgenomen in astrocyten. (Ac) Schema van de analytische stappen die nodig zijn om de fSTCs isoleren van synaptically-geactiveerde transporter stromen opgenomen in astrocyten. (D) Analytische benadering gebruikt om de resterende aanhoudende K ^+-stroom te verwijderen uit de fSTCs (zie hoofdstuk 5). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

ent-width = "6,5 in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
Figuur 3. Deconvolutie analyse gebruikt om het tijdsverloop van glutamaat klaring afgeleid van astrocyten (a) mono-exponentiële fit van de FSTC / FTC die in controle omstandigheden (links) en in aanwezigheid van TBOA (10 uM, rechts).. (B) Het tijdsverloop van glutamaat klaring in TBOA (10 uM) wordt benaderd door een ogenblikkelijk-stijgende functie met mono-exponentieel verval. (C) Deconvolving het tijdsverloop van glutamaat klaring in TBOA (10 uM) van de multi-exponentiële fit van de transporter stroom in TBOA (10 uM) maakte het mogelijk de filter. (D) Deconvolving het filter van de multi-exponentiële fit van de transporter stroom in controle omstandigheden maakte het mogelijk de tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocyten in controle omstandigheden.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussion

Een experimentele benadering voor elektrofysiologische opnames te verkrijgen van astrocyten Hier beschrijven wij, een analytisch protocol om glutamaattransporter stromingen isoleren in astrocyten en een wiskundige methode voor het afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocytische transporter stromingen.

Het succes van de analyse is gebaseerd op de mogelijkheid om hoge-kwaliteit patch clamp verkrijgen van astrocyten en de nauwkeurigheid van de fitting algoritme gebruikt om de transporter stromingen beschrijven. De deconvolutie analyse voert de volgende twee hypothesen. (1) De verschillende processen die het tijdsverloop van glutamaat speling in de experimenteel opgenomen transporter stroom verstoren kan worden weergegeven als een lineair systeem. Hoewel in absolute zin veel van de factoren die vorm transporter stromingen zijn niet-lineaire systemen (in principe glutamaat binding en transport kan zowel ondergaan verzadiging), experimenteel bewijs indicates dat hun lineaire regime is breed. Dienovereenkomstig, het tijdsverloop van transporter stromingen en van glutamaat klaring gelijk blijft over een breed scala van stimulus sterkte, vrijlating waarschijnlijkheid, en glutamaat concentraties ^13,14,18. Hoewel deze benadering lijkt gerechtvaardigd dat onze experimentele omstandigheden, moet worden gevalideerd voordat men deze analyse in verschillende experimentele preparaten. (2) de eigenschappen van het filter worden niet beïnvloed door de aanwezigheid van TBOA (10 uM). Deze veronderstelling lijkt redelijk omdat alle factoren die bijdragen aan het filter (dwz transporter kinetiek, elektrotone filtering en tijdens synaptische stimulaties asynchrone afgifte van glutamaat over synapsen) waarschijnlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van TBOA.

Door het afleiden van de glutamaat goedkeuring waveform fSTCs en FTCs, krijgen we twee verschillende soorten informatie. Door het analyseren van fSTCs, wij de tijd te meten die astrocytic membranen worden blootgesteld aan glutamaat vrijgelaten uit synapsen. Door het oproepen van FTCs met volledige veld UV-belichting (dwz door uncaging glutamaat over het gehele astrocytaire oppervlak), meten we de tijd die astrocytic membranen worden blootgesteld aan Uncaged glutamaat. In deze uncaging Alle experimenten glutamaat moleculen vrijkomen (dwz uncaged) tegelijkertijd en alle transporteurs geactiveerd tegelijkertijd door dezelfde glutamaatconcentratie. Daarom is door het analyseren FTCs, we kunnen een indirecte uitlezing van de astrocytaire glutamaat opname capaciteit te verkrijgen.

Het is belangrijk op te merken dat de hier beschreven methoden kunnen schatten het tijdsverloop van glutamaat speling, niet de werkelijke waarde van de glutamaat concentratie doet denken aan de transporter stromen. De geschatte cursus is een gemiddelde maat voor het tijdsverloop van glutamaat speling op alle gebieden van de astrocytaire membraan waarop we elektrofysiologische toegang: het is geent gevoelig voor heterogeniteit in glutamaat opname op verschillende locaties binnen de astrocytic membraan ^19. Deze informatie zal eerder verkrijgbaar hoge-resolutie microscopie van glutamaat-gevoelige fluorescente reporters ^20. Echter, de momenteel beschikbare glutamaat-gevoelige verslaggevers vertonen relatief klein dynamisch bereik. Deze kunnen niet-lineaire distorsies tussen de glutamaatconcentratie profiel en het fluorescentiesignaal, waarbij de toepassing van deze probes aan temporele informatie halen over de glutamaatconcentratie voorbijgaande. Daarom is het waarschijnlijk door het combineren van al deze verschillende benaderingen die de meest uitgebreide kennis van de dynamica van glutamaat signalen astrocytaire membranen kunnen krijgen.

Samengevat kunnen de methoden die hier gepresenteerd worden gebruikt om de klaring tijdsverloop van synaptically-vrijgegeven of flash-Uncaged glutamaat bij astrocytische membranen te schatten. Zij bieden waardevolle tools die can gebruikt worden om de levensduur van glutamaat in de extracellulaire ruimte te schatten in verschillende ontwikkelingsstadia ¹³ in verschillende diersoorten ¹⁴ en hersengebieden onder fysiologische en pathologische omstandigheden ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics