Summary

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

Published: August 07, 2013
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה אנליטית להעריך את החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic מהקלטות אלקטרו של זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים.

Abstract

הצפיפות הגבוהה ביותר של מובילי גלוטמט במוח נמצאת בהאסטרוציטים. כמה מובילי גלוטמט התנועה של גלוטמט על פני הקרום עם שיתוף ההובלה של 3 Na + ו 1 + H ונגד התחבורה של K + 1. יכול להיות במעקב הנוכחי stoichiometric הנוצרים בתהליך ההובלה עם הקלטות תיקון-מהדק כל התא מתאים כוכביים. כמובן הזמן הנוכחי נרשם מעוצב על ידי את מהלך הזמן של פרופיל גלוטמט הריכוז כדי שהאסטרוציטים חשופים, קינטיקה של מובילי גלוטמט, ואת מאפייני electrotonic הפסיביים של קרומי astrocytic. כאן אנו מתארים את השיטות הניסיוניות ואנליטי, שניתן להשתמש כדי להקליט זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ולבודד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מכל הגורמים האחרים המעצבים את צורת הגל של זרמי טרנספורטר astrocytic. השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את החיים oF פלאש ברח מכלוב וsynaptically-שוחרר גלוטמט בממברנות astrocytic בכל אזור במערכת העצבים המרכזית בבריאות ובחוליים.

Introduction

האסטרוציטים הם אחד מסוגי התאים הנפוצים ביותר במוח עם מורפולוגיה בצורת כוכב ובליטות בממברנה עדינות שמרחיבות לאורך neuropil ולהגיע 1,2 קשרים סינפטיים השכן. קרום התא של האסטרוציטים הוא ארוז בצפיפות עם מולקולות טרנספורטר גלוטמט 3. בתנאים פיסיולוגיים, מובילי גלוטמט במהירות לאגד גלוטמט בצד החוץ התאי של הממברנה ולהעביר אותו אל הציטופלסמה התא. בעשותם כך, מובילי לשמור על ריכוז הבסיס הנמוך של גלוטמט ב4 השטח תאי. מובילי גלוטמט בתהליכי astrocytic משובחים סמוכים לגירוי הסינפסות ממוקמים באופן אידיאלי כדי לאגד גלוטמט שוחרר במהלך אירועים סינפטיים כפי שהוא מפזר ממרווח הסינפטי. בעשותם כך, מובילי גם להגביל גלישת גלוטמט כיוון ו- פרי אזורים נוסף סינפטי ועל הסינפסות שכנות, צמצום הפער המרחבי של אות מעוררתים במוח 5-7.

גלוטמט תחבורה היא תהליך electrogenic stoichiometrically מצמידים את התנועה של 3 Na + ו + 1 H לאורך השיפוע אלקטרוכימי שלהם וללוחמה בהובלה של 1 K + 8. התחבורה גלוטמט קשורה (אבל לא stoichiometrically מצמידים) מוליכות anionic חדירים לSCN (thiocyanate)> מס '3 (ניטראט) ≈ CLO 4 (פרכלורט)> אני -> Br -> Cl -> F -, לא לCH 3 SO 3 (מתאן sulfonate) ו-C 6 H 11 O 7 (גלוקונאט) 9-11. שני הזרמים (stoichiometric ולא stoichiometric) ניתן להקליט על ידי קבלת הקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים, שזוהו תחת תאורת Dodt או התערבות ההפרש לעומת זאת אינפרא אדום (IR-DIC) חזותי בacutדואר פרוסות מוח 12. מרכיב stoichiometric של הנוכחי קשורים לתחבורת גלוטמט על פני הקרום יכול להיות מבודד באמצעות CH 3 SO 3 -, או ג 6 11 7 O H פתרונות תאיים מבוסס ויכול להיות עורר על ידי גלוטמט פלאש משחררות רפרוף על האסטרוציטים 13,14, או על ידי הפעלת שחרור גלוטמט מהסינפסות שכנות, או חשמלי 12 או עם שליטה ממוקדת optogenetic.

מהלך הזמן של רכיב stoichiometric של נוכחי טרנספורטר מעוצב על ידי חיים שלמים של פרופיל ריכוז הגלוטמט בממברנות astrocytic (אישור גלוטמט כלומר), קינטיקה של מובילי גלוטמט, את מאפייני הקרום הפסיביים של האסטרוציטים, ובמהלך הגירויים הסינפטי, על ידי סינכרוניזציה של שחרור גלוטמט פני סינפסות הופעלה 13. כאן אנו מתארים בפירוט מלא: (1) appr ניסיוניתאוח לבודד את מרכיב stoichiometric של זרמי טרנספורטר גלוטמט מהקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים באמצעות פרוסות בהיפוקמפוס חריפות עכבר כהכנה ניסיונית דוגמה, (2) גישה אנליטית לגזור את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהקלטות אלה 13, 14. שיטות אלה יכולים לשמש כדי להקליט ולנתח זרמי טרנספורטר גלוטמט מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית.

Protocol

1. הכנת פרוסה הכן 500 מיליליטר חיתוך פתרון / אחסון המכיל (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl 2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26.2 NaHCO 3, 1 אא 2 PO 4, וגלוקוז 22, 320 mOsm, pH 7.4 השתמש בכוס 250 מ&q…

Representative Results

ההצלחה של הגישה אנליטית שתוארה כאן באופן ביקורתי תלויה בהשגת הקלטות אלקטרו באיכות גבוהה של זרמי טרנספורטר מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית. בחתכי היפוקמפוס עכבר חריפים, האסטרוציטים ניתן לזהות בקלות תחת Dodt תאורה או IR-DIC בגלל הגוף שלהם תאים הקטן (O מיקרומט…

Discussion

כאן אנו מתארים גישה ניסויית להשיג קלטות אלקטרו מהאסטרוציטים, פרוטוקול אנליטי לבודד את זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ושיטה מתמטית כדי להפיק את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מזרמי טרנספורטר astrocytic.

ההצלחה של הניתוח מסתמכת על היכ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ תכנית מחקר עירונית (NS002986). AS כתב את כתב היד ויישם את ניתוח deconvolution. JSD פיתחה את הגרסה הראשונית של ניתוח deconvolution והגיב על הטקסט.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

References

  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
  3. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  4. Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
  5. Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
  6. Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
  7. Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
  8. Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
  9. Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
  10. Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
  11. Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
  12. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
  15. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
  16. Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
  17. Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
  18. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
  19. Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
  20. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
  21. Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).

Play Video

Cite This Article
Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

View Video