3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개
Summary
이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
세포 이동은 전통적으로 2D 기판에서 공부하고있다. 그러나, 그것은 더 나은 문제의 생리적 인 과정의 차원과 유사 더 적절한 3D 환경에서 세포의 이동을 연구 할 필요가 있다는 것을 점점 더 분명하게되었다. 철새 세포는 실질적으로 그들이 2D 또는 3D 기판에 이동 여부에 따라 그 형태와 마이그레이션 모드에서 다를 수 있습니다. 대부분의 표준 프로토콜, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조 및 기능 분석과 기술적 인 문제와 비 호환성으로 인해 여전히 드문 남아있다. 이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 우리는 내가 상온에서 중합 찬란 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화를 촉진하기 위해 표시 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐을 사용합니다. 이 작품은 protoc를 포함내인성 세포의 세포 뼈대의 3D 면역 형광 라벨링 OL. 우리는 분자 구성, 지역화, 그리고 3 차원 세포 구조의 기능을 잘 설명에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다 이러한 프로토콜을 사용.
Introduction
세포 이주의 필드는 새로운 세 번째 차원의 세계로 용감하게 맞서는되었습니다. 그것은 가장 밀접하게 생리 한 유사하고, (3D) 따라서, 입체 환경에서 세포의 이동을 연구하는 직관적이다. 그러나, 기술적 한계로, 대부분의 세포 이동 연구는 치료 또는 적합한 세포 외 기질 (ECM) 단백질을 코팅하거나, 딱딱한 두 개의 차원 (2D) 기판을 통해 세포의 움직임을 분석 해본 적이있다.
입체 콜라겐 격자에서 세포의 이동에 전념 첫 번째 연구 20 년 1-3에 돌아갑니다. 그러나, 지난 5 년 동안 그것은 철새 세포가 실질적으로 자신의 형태와 기질의 차원에 따라 마이그레이션 모드에서 다를 수있는 것이 분명되고있다. 2D로, 세포에만 넓은 평지 돌출의 형성 (lamellipodia)의 결과로, 초점 유착을 사용하여 복부 표면과 기판 연락자신의 앞 가장자리에 내장 된 손가락 같은 돌기 (filopodia). 이러한 구조는 함께 후행 가장자리 셀 앞을 연결 스트레스 섬유, 2D로 세포 이동에 중요한 것으로 생각된다. 3D 매트릭스에서 세포 형성과 이러한 구조의 많은 기능 관련에 상당한 변화를 일으키는, ECM 문의 전체 세포 표면으로, 일반적으로 더 연장됩니다. 반대로, 다른 세포의 기능은 ECM 개조 4에 관련된 핵 변형 및 구조와 같은 3D 이주 관련을 얻을 수 있습니다.
이러한 알려진 형태 변경뿐만 아니라 ECM과 세포 유형, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조와 기능 분석에 따라 달라질 수 있습니다 5-7 마이그레이션 모드의 차이에도 불구하고 여전히 드문 남아있다. 두께와 밀도 차원 행렬로 작업 기술 등의 고해상도 현미경 이미징 어려움, 대부분의 역에 호환성을 수행ndard 프로토콜은 내인성 단백질의 면역 형광 라벨처럼, 2D 문화에 최적화. 3D 매트릭스의 사용은 비교적 새로운 접근 방식이기 때문에 또한, 연구자들은 여전히 밀접하게 같은 다른 조직 기관의 정상적인 기질 아키텍처 나 종양 주변의 ECM 조직과 생체 내 상황에서 특정 닮은 최적의 조건을 조사하고 있습니다. 관련된 다른 그룹에 의한 결과 차이는, 예를 들어, 암 세포 이주의 모드 나 초점 유착의 존재는, 약간의 논쟁 8 생성 한. 많은 노력이 최근 ECM 화학적 특성, 기공 크기, 섬유 두께, 매트릭스 강성의 측면에서 합의에 도달하기 위해 최선을 다하고있다. 3D ECMs의 많은 다른 유형은 현재 세포 유래 행렬에서 시판 리겔, pepsinized 소 콜라겐 I, 또는 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐 I.이 행렬의 각 특정 물리적, 화학적 특성을 가지고 있으며, RELA 한 요구에 다양한 사용됩니다TE는 생리적 과정의 선택의 행렬이 연구되고있다. 또한, 기공 크기 및 섬유의 두께는 pH와 온도 9,10 등의 중합 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 유리와 같은 딱딱한 기판에서와 거리 바인딩도 행렬 10,11의 탄성 속성을 변경할 수 있습니다.
이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 구형 체를 만들기위한 방법은 이전에 매달려 드롭 방식 12,13와 아가로 오스 코팅 플레이트 방식 14되는 가장 인기있는 것들을 설명하고있다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 난 방 온도에서 중합 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐은 2 밀리그램 / ML에서 사용됩니다. Nonpepsinized 산 추출 된 콜라겐 쥐의 꼬리에서 I는 모두 N-및 C-말단 telopeptides, 기본 콜라겐 intermolec에 대한 책임 콜라겐 분자의 nonhelical 부분을 유지ular 가교 fibrilar 안정성 15. 함께, 이러한 조건에 가장 가까운 생체 10에서 관찰 된 것과 유사하는 콜라겐 네트워크를 형성 할 수 있습니다. 고정 및 생활 문화 모두에서 콜라겐 섬유의 시각화를 허용하려면, 자세한 프로토콜은 찬란 5를 사용 관내 10 콜라겐 레이블을 제공 – (및 6) carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 석신 에스테르. 이 프로토콜은 Baici 등에서 적응되었습니다. 형광 이소 티오 시아 네이트는 수용성 콜라겐 분자의 레이블을 지정하는 데 사용되는 16, 17,. 형광으로, TAMRA는 N-말단에서 무료 아미노 그룹과, 더 중요한 것은, 라이신의 측면 아미노 그룹으로 단백질의 nonprotonated 지방족 아미노 그룹과 반응하여 아미노 반응 형광 염료이다. 라이신 아미노산 그룹 nonprotonated 형태에있을 때이 반응은 기본적인 pH에서 발생합니다. TAMRA가에 형광보다 더 안정되고 이외에시간은 그것의 방출 스펙트럼은 유용 GFP – 태그 단백질의 라이브 셀 이미징 결합 될 수 레드 / 오렌지 범위 (예 / EM = 518분의 555 nm의)에 빠진다. 아미노 반응성 염료와 수용성 콜라겐라는 분자를 사용하여 중합 공정이나 밀도, 기공 크기 및 콜라겐 매트릭스 10,16,18,19의 가교 상태에 영향을주지 않습니다.
이 프로토콜은 또한 더 골격이나 골격 관련된 단백질을 라벨에 최적화 된 내인성 단백질의 3 차원 면역 형광 표시하는 방법을 포함하고 있습니다. 이 프로토콜의 마지막 초점은 콜라겐 매트릭스 장력 경질 유리 커버 슬립의 감소 공헌 공 촛점 현미경을 사용하여 3D 문화의 고해상도 영상을 획득하는 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 찬란 나는 561 nm의 레이저가 장착 된 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 콜라겐 네트워크 조직을 쉽게 시각화 할 수 있도록하는 훌륭한 방법을 제공 TAMRA를 사용하여 콜라겐 레이블을 여기에 설명. 반사 공 촛점 현미경에 비해이 기술의 장점은 3D 매트릭스에 깊이 이미지 콜라겐 섬유의 기능입니다. 섬유 반사 강도와 대비 레이저 광 흡수와 산란에 의한 깊이를 실질적으로 감소. 섬유는 영…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기꺼이 이미지는 그림 3과 PICT-IBISA 이미징 시설 (연구소 퀴리)에서 수집하고 처리 박사 바실리 Gurchenkov (문화원 퀴리)을 인정합니다. 체외 세포 모델에서 콤플렉스 -이 작품은 ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 및 PIC 3D에 의해 지원되었다.
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
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