在3D揭示侵入性癌症细胞骨架组织
Summary
本文提出了一种荧光标记的胶原蛋白，可以进一步用于修复和实时成像的三维细胞培养的方法。我们还提供了一个可视化优化的协议在3D的环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。
Abstract
在传统上一直在2D基板研究细胞迁移。然而，它已成为越来越明显的是，需要研究更合适的3D环境，更好地类似于维度的生理过程中细胞迁移。游走细胞实质上的不同，其形态和模式的迁移取决于他们是否正在2D或3D基板上。由于与大多数标准协议，细胞内嵌入3D矩阵的结构和功能分析的技术困难和不兼容性仍然屡见不鲜。本文介绍了编制和成像3D细胞培养的方法，无论是作为单细胞或球体。肿瘤细胞迁移作为一个适当的细胞外基质底物，我们使用nonpepsinized的大鼠尾I型胶原在室温下聚合，荧光标记，以方便使用标准的共聚焦显微镜的可视化。这项工作还包括一个协议传输醇三维免疫荧光标记的内源性细胞骨架。使用这些协议，我们希望能有助于更好地描述的分子组成，定位，细胞结构和功能在3D。
Introduction
细胞迁移的领域已经进入全新的第三维世界冒着。它是最近似于生理的一个，因此，三维（3D）的环境中，直观地研究细胞迁移。然而，由于技术的限制，大多数细胞迁移的研究已被被分析细胞的运动刚性的两维（2D）基板之间，未经处理或涂以适当的细胞外基质（ECM）蛋白。
第一个致力于研究细胞迁移的三维胶原蛋白晶格回去1-3超过20年。然而，仅在过去的5年中，它已成为游走细胞实质上的不同，其形态和模式的迁移取决于基材的维。在2D中，细胞只接触基底腹面使用焦距粘连，从而形成了宽阔平坦的突起（lamellipodia上）与嵌入式的指状突起（丝状伪足），他们的领先优势。这些结构中，一起连接的单元的从前至后缘的应力纤维，被认为是在2D细胞运动的关键。在三维基质中，细胞通常是更细长，与整个细胞表面接触的ECM，许多这些结构的形成和功能的相关性造成了相当大的变化。相反，其他细胞的功能，获得相关的三维偏移，如参与ECM重塑4核变形和结构。
尽管这些已知的形态学改变，以及迁移模式5-7，可取决于对ECM和类型的细胞，嵌入在三维基质中的细胞的结构和功能的分析的差异仍然不寻常的。又浓又密的3D矩阵进行技术困难，如高分辨率的显微成像和不兼容性与大多数站优化的ndard协议为2D的文化，如内源性蛋白免疫荧光标记。此外，因为使用的3D矩阵是一个相对较新的方法，研究人员仍在调查酷似具体在体内的情况，如不同的组织器官或ECM肿瘤组织周围的正常基质结构的最佳条件。在结果中关于不同群体的差异，例如，肿瘤细胞迁移模式或粘着斑的存在，产生了一些争议8。很多努力，最近一直致力于ECM化学性质，孔径，纤维厚度和刚度矩阵方面达成了共识。三维的ECM的许多不同类型的当前使用，不同，从细胞衍生的矩阵市售基质胶，pepsinized牛胶原I或nonpepsinized鼠尾胶原一，这些矩阵中的每一个都具有特定的物理和化学性质，并需要相对德选择矩阵的生理过程正在研究中。此外，孔径和纤维厚度可以依赖于聚合条件下，如pH值和温度9,10。的绑定和距离，可从硬质基材，例如玻璃，也可以改变基体10,11的弹性性能。
本文介绍了编制和成像3D细胞培养的方法，无论是作为单细胞或球体。使肿瘤细胞球粒的方法前面已经描述的，最流行 的是悬滴法12,13和琼脂糖涂层板的方法14。肿瘤细胞迁移作为一个适当的细胞外基质底物，nonpepsinized大鼠尾I型胶原聚合在室温，用2毫克/毫升。 Nonpepsinized酸提取胶原蛋白我从鼠尾保留N和C-末端的端肽，的nonhelical部分负责天然胶原intermolec的胶原蛋白分子ular的交联和fibrilar的的稳定性15。总之，这些条件允许的情况下形成的胶原网络10 在体内观察到的那些最相似的。一个详细的协议，以允许可视化的胶原纤维，无论是在固定和活的文化，提供荧光标记胶原蛋白在体外 10，使用5 – （6） -羧基四甲基罗丹明（TAMRA），琥珀酰亚胺基酯。该协议是改编自拜辞等。16,17，用来标记异硫氰酸荧光素可溶性胶原蛋白分子。 ，TAMRA荧光素反应，质子化脂族氨基基团的蛋白质，如上面的N-末端的自由氨基基团，而更重要的是，侧氨基的赖氨酸的氨基的反应性荧光染料。该反应只发生在碱性pH值下，当赖氨酸的氨基质子化的形式。除了TAMRA更稳定，比荧光时间的推移，其发射光谱落在范围橙/红（EX / EM = 555/518纳米），它可以有效地活细胞成像GFP标记的蛋白质相结合。使用与氨基反应性染料的水溶性胶原蛋白标记的分子不影响聚合反应的过程中，还是的密度，微孔尺寸和胶原基质的交联状态10,16,18,19。
此协议还包括一个三维的内源性蛋白，其已被进一步优化标记细胞骨架或细胞骨架相关蛋白的免疫荧光标记的方法。此协议的最终焦点是获得高分辨率图像，利用共聚焦显微镜的3D文化与刚性盖玻片贡献减少胶原基质张力的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议，我使用TAMRA提供了一个很好的方法，让简单的可视化的胶原网络组织，通过使用标准的配备了一个561 nm激光共聚焦显微镜，荧光标记胶原蛋白。这种技术的一个优点，相对于反射率的共聚焦显微镜图像的胶原纤维深入到3D矩阵的能力。纤维反射的强度和对比度显着衰退的深度，由于激光的光吸收和散射。此外，胶原纤维的方向可以是一个主要的障碍时使用反射共焦显微镜中，…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者非常感谢，博士：瓦西里Gurchenkov（居里研究所）图像采集和处理在图3和PICT-IBISA的成像设备（居里研究所）。支持这项工作是由ANR-09-JCJC0023 01，ARC SFI20111203863和PIC 在体外细胞模型的3D -复杂。
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
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