Summary
以保留神经流程超微结构分析，我们描述了一种协议，用于在电子显微镜网格后用快速冷冻原代神经元的电镀，得到的样品悬浮在一层玻璃的冰。这些样本可以检查与一个低温电子显微镜可视化结构在纳米尺度。
Abstract
突起，无论是树突和轴突，是神经元细胞过程，使电脉冲的神经元之间的传导。定义突起的结构是如何理解这些过程动议，支持突触宣传材料和信号的关键。电子显微镜（EM）传统上被用来评估突起内的超微结构特征，但是，接触有机溶剂的脱水和树脂的嵌入过程中，可能会扭曲结构。一个重要的未满足的目标是有关程序，以便不被这种假象影响结构性评估的制定。在这里，我们已经建立了种植和速冻对整个电子显微镜网格其次是他们检查与低温电子断层扫描（冷冻ET）不同的主神经元的轴突详细的和可重复的协议。这种技术允许冷冻，水合突起在纳米级分辨率的三维可视化，便于ASSEssment他们的形态差异。我们的协议产生背根神经节（DRG）突起，和海马神经突在他们接近天然状态的可视化前所未有的看法。因此，这些方法为未来在正常的神经元和那些由神经系统疾病影响的突起研究奠定了基础。
Introduction
神经元建立复杂的电路必需的中枢和周围神经系统的通过阐述树突接收信息和轴突，往往是相当冗长的，与下游神经元进行通信的功能。神经突增生起到胚胎发育和神经细胞的分化和维持轴突的过程中的基础性作用支持神经系统的审慎的功能。神经炎过程还具有批判性的神经损伤和再生，以及神经系统疾患。神经元结构的研究是至关重要的了解双方的正常和病变的大脑。幸运的是，生理有关的神经元细胞培养系统存在，可以概括复杂和异构的细胞结构。基于坚实的实验平台，有效的可视化策略，使神经元形态的定性和定量分析的澄清是必要的。特别有用会是一个详细的方法，提供了用于可视化的神经突，既轴突和树突在纳米尺度一致的平台。
传统的电子显微镜需要脱水和树脂包埋过程中使用有机溶剂，可以从自己的真实状态引起扭曲的标本。迄今为止，在纳米尺度结构最大表征是基于较大的细胞或组织所承受这样苛刻的化学物质-从而限制的结果4,9,25解释。此外，对于电子束的穿透，切片所需的生物体或细胞的突起呈现的厚度大于1微米的12。最后，切片或磨碎的组织结果集合中的离散量特定的数据集，使突起的细长的特点繁琐的定义。即使冷冻电镜，其中切片冷冻水合的样品是可能的，该方法引入了压缩ARTIF使徒行传1。
近年来，研究人员已经学会了如何直接在EM电网和速冻它们在液态乙烷采用低温ET 8,10,18,23随后可视化轴突生长的海马神经元。然而，这些研究要么使用一个特制的装置10,23，或对产生足够薄玻璃冰常规可视化8,18的印迹步缺乏细节。例如，一项研究建议使用30-40秒，吸干了EM网格10，但是，这个值进行了优化不能用于一般用途，但具体是对于定做暴跌冷冻设备。使用一个特制的设备，而不是市售17保持湿度暴跌冻结的样品前可能构成障碍的广泛的可重复性。
虽然这些研究已经破土动工了冷冻ET可视化突起，我们已经迈出了一步，探讨AP冷冻的ET plicability各种神经元标本（海马及背根神经节神经元）的。此外，我们将讨论这两种最优和次优的结果，以及人们可以利用冷冻ET此类标本遇到潜在的文物。
定义一个详细的技术维护和在纳米尺度可视化整个轴突在接近本机的状态将加强开展超微结构研究的能力，更多的研究者。为此，我们使用市售设备来制备未定影的，未染色的神经元来可视化突起描述一种有效和详细的协议。这是迈向健康的详细轴突的超微结构，并奠定基础，了解什么是结构上的差异存在于神经系统疾病模型的重要的第一步。因为冷冻的ET能在纳米尺度解决在3-D未定影的，未染色的神经突的特点，该方法将使得能够作为永远脱颖而出定义神经炎架构12。
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Protocol
1。准备菜肴与EM网格的镀初级神经元
- 检查使用光学显微镜在至少25倍的放大倍率黄金EM网格多孔碳的完整性。确保碳孔> 98％不变。
- 电镀初级神经元，用本生灯火焰灭菌的EM网格和并行使其亲水性。使用镊子拿起EM网格的边缘，而不是中心网格区域。注意：切勿将点燃的本生灯无人值守，并且不使用手套或镊子塑料组件，同时执行这些步骤：
- 前点燃本生灯，设置空气和气体调整到最小开启位置。
- 用一个前锋火石或丁烷打火机点燃本生灯。
- 修改空气和煤气的调整来实现一个蓝色的小内内的高，淡蓝色/紫色火焰的火焰。内焰的尖端是火焰的最热的部分。下旋钮照耀在燃烧器调节气体进入燃烧器管的数量，而在燃烧器的桶可以被打开以调节空气进入燃烧器的数量。转动空气调节顺时针方向减小（导致火焰呈紫色）的空气和逆时针方向增加（导致黄色火焰）的空气。
- 使用金属镊子（无塑料件）举行了EM网格，通过火焰迅速传递给它的两倍，面对碳的一面朝上。碳侧将出现更多的磨砂（少光泽），并与带有灰色色调的比另一侧。
- 紧接在网格（碳的一面朝上）转移到玻璃底培养皿放置在10厘米本生灯的中心。使用每皿1 EM网格（ 图1）。仅使用玻璃底菜被预消毒， 即通过γ射线照射。
- 使用光学显微镜，同时仍保持了EM网格玻璃博特内检查电网的完整性（碳孔完好）OM菜（以避免污染）。当施加任何物质上的网格或任何会与神经元接触，用消毒程序和无菌移液器吸头。
- 在使用过程无菌组织培养罩，慢慢地，仔细地应用于250微升合适的涂布物质在培养皿的中央玻璃面积。确保适当的涂布物质覆盖了整个电磁网格。
- 对海马神经元，可使用聚-L-赖氨酸（PLL，1毫克/毫升）作为涂层物质，如先前所描述的19制备。请注意，250微升每有EM电网需要，每皿，所以应相应批次。对于背根神经节（DRG）神经元，使用凝胶状蛋白混合物通过Engelbreth - 霍尔姆 - 群（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌（见表材料和试剂）作为涂布物质，准备如下。请注意，250微升每有EM电网需要，每皿，所以应相应批次。
- 解冻股票瓶凝胶状蛋白混合物通过Engelbreth - 霍尔姆 - 群（EHS）小鼠肉瘤细胞在4℃过夜分泌的
- 保持冷的凝胶状蛋白混合物通过Engelbreth -霍尔姆-群（EHS）小鼠肉瘤细胞，并用于制造解决方案的所有组件， 即通过保持他们在冰上分泌。
- 而在冰上，在Neurobasal培养基稀释此胶状蛋白质混合物以得到1:20稀释（ 即稀释500μl的胶状蛋白质的混合物到10ml的Neurobasal的）。
- 将稀释后的凝胶状的蛋白混合物为1毫升分装，并立即在-20℃存放任何额外等份℃。
- 每个应用EM电网250微升，每皿，如1.4节所述。
- 对海马神经元，可使用聚-L-赖氨酸（PLL，1毫克/毫升）作为涂层物质，如先前所描述的19制备。请注意，250微升每有EM电网需要，每皿，所以应相应批次。对于背根神经节（DRG）神经元，使用凝胶状蛋白混合物通过Engelbreth - 霍尔姆 - 群（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌（见表材料和试剂）作为涂布物质，准备如下。请注意，250微升每有EM电网需要，每皿，所以应相应批次。
- 盖培养皿，其顶部和孵化（无论是与锁相环（PLL）海马标本，或用胶状蛋白质混合物DRG标本）1小时在室温下在组织培养罩。
- ASPI评价所有PLL（海马标本），或从菜品的胶状蛋白质混合物（DRG标本）。要做到这一点，使用真空系统在组织培养罩。使用附连到真空管中的无菌移液管尖端。避免与EM电网直接接触。
- 使用可调节的空气位移移液管小心地应用250微升无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）中的EM网格中的每个培养皿的中心玻璃区域，从而使得EM网格被完全覆盖的PBS中。然后，从每个培养皿中吸出PBS中。重复3次。
- 允许与EM网格的菜组织培养罩15分钟下干燥。确保它们是由光学显微镜的组织培养室检查下完全干燥。请确保在电网无气泡的水分。如果是的话，小心吸旁边的EM网格来消除这种额外的水分。该涂层电网应立即用于电镀的神经元。
2。准备和排位ATING初级神经元上的EM网格
- 到板原代神经元，第一解剖，胰蛋白酶消化（用2.5％胰蛋白酶）和磨碎以解离的海马（或18日龄的大鼠胚胎背根神经节）成单个细胞，如先前所描述的19。
- 磨碎是使用神经生物学家描述细胞团块离解成单个细胞，特别是使用了火抛光尖玻璃吸管的一种常见的术语。其结果是通过移液管小心缓慢地拉伸和释放细胞，向上和向下，多次（〜30）来实现。
- 遵循如前对背根神经节解剖和细胞分离24所述的方法，注意到使用0.25％胰蛋白酶（在HBSS中）以分离的大鼠DRG神经元，而不是使用提出的酶（木瓜蛋白酶，胶原酶/分散酶），它们更适合于鼠标DRG神经元。
- （ 即使用血细胞计数）计算分离的神经元的数量并使用该值来计算细胞的适当体积要应用于每个培养皿以达到每个培养皿50000个细胞/ ml的浓度。申请量最大为250微升。请注意，这只是填充中央玻璃面积，而不是整个菜。
- 孵化菜在CO 2培养箱中30分钟，在37℃下让细胞恢复和坚持。
- 慢慢加入1.5毫升回暖媒体到每一道菜，小心不要打扰了EM网格。媒体的类型依赖于细胞类型（海马或DRG）。
- 准备适当的媒体要么海马神经元19或背根神经节神经元24，这是在使用前37℃水浴中预热。孵育隔夜菜中的CO 2培养箱中培养。
- 对于海马神经元，第二天更换介质。改变一半的媒体，每两天以后的14天。温暖的媒体在使用前37℃水浴。 对背根神经节神经元中，以下夹层/电镀当天，制备的介质与抗有丝分裂剂（尿苷和5'-氟-2'-脱氧尿苷），使各10mM的储备溶液，单独一个新鲜的库存;使用最终10μM的每种浓度。除去一半的DRG媒体（875微升）中，并加入875微升新鲜培养基与抗有丝分裂剂。
- 对于DRG神经元，每两天进行的第一周，交替变化介质抗有丝分裂的媒体和标准DRG媒体之间。对于第二个星期，改变标准DRG媒体每两天。
3。在EM网格玻璃化神经元
- 准备设备和材料全部冻结和存储黄金的EM电网在低温下：配有湿度室17玻璃化设备，细点专业镊子液氮的玻璃化机，长平点镊子，杜瓦（S）（LN 2），Coolant容器，EM格收纳盒，无钙滤纸。
- 开始玻璃化装置。湿度设定为100％和温度为32℃。在“控制台”部分，设置印迹时间为零秒。这允许手动穿过玻璃化机器的湿度腔室的侧面窗口印迹。
- 处理好与手套的无钙滤纸，分层他们这样三个文件堆叠。切堆栈成宽约0.5厘米的条是〜2厘米。弯曲它们以90°角，使得纸张的一面具有0.5厘米×0.5厘米面（ 图2）。使用镊子，取出中间纸并将其放置在另一个无钙滤纸直到使用。
- 把网格存储按钮，在按钮持有人的玻璃化冷冻室中。充满液氮的冷却剂容器的内室中，并等待直至完全蒸发。填写日的外腔用液氮冷却剂ë容器，直到达到稳定的温度下进行到下一个步骤。用高纯度的气态乙烷，将冷凝成液体状态的冷却腔中填充内腔。
- 从孵化器移动盘（ES）到大100毫米聚苯乙烯菜运到玻璃化冷冻室，如果不是在附近。使用专业的玻璃化镊子从菜仔细挑选了EM网格。注意哪个方面的神经元生长的EM网格;的位置将重要的一个步骤。请使用镊子黑色滑锁牢固地锁定在EM网格镊子。
- 插入镊子进入玻璃化机对EM网格使得侧上的神经元被附着面的左侧，远离玻璃化机器的侧面开口的孔。缩回专业镊子放入玻璃化机。
- 放置冷却剂容器中的相应夹持器玻璃化机。它应该充满2足够LN和液态乙烷。使用玻璃化机器的适当屏幕的命令，提高冷却剂腔室向上，直到它的刷新的湿度室的底部。
- 与扁平点镊子，把握滤纸，使得短边（0.5厘米×0.5厘米面）垂直于所述镊子的一个边缘。这张脸会接触到电磁电网直接接触印迹（ 图2B）。小心地将滤纸放入侧孔的玻璃化冷冻机的恒温恒湿试验箱（ 图2A）。稳定地保持对EM网格纸（面朝远离试样）为10秒。丢弃的文件之后，立即使用玻璃化冷冻机的自动化暴跌，冻结试样在液体乙烷。
- 仔细的1的冷冻水合EM网格转移到时隙中的一个网格存储按钮。重复此过程，以获得更多的EM网格的菜肴。在这些实验中使用了EM网格存储按钮可以存储多个冷冻水合EM网格。
4。图像采集，处理和注释
- 进行收集的2-D型电子显微镜照片和/或使用低剂量条件下的低温电子显微镜的神经突的三维倾斜系列5。的2-D图像的目的是要评估网格的质量在冰厚度和可能的领域而言是对3-D倾斜系列有用。
- 在这种情况下，使用连接到配备有一个倾斜液氮冷冻传输座200千伏电子显微镜，在20K显微镜的放大倍率在目标underfocus的7微米和4.4采样一个集成的4K x 4K CCD摄像头采集的所有图像/像素。
- 取得的样品的三维断层图像，采取了一系列的投影图像的同时逐步倾斜的样品人透射电子显微镜（TEM）的翁一根轴。由于倾斜角度等实验设置，有可用的自动采集倾斜系列5几种不同的软件。这里显示的3-D倾斜系列采用半自动化的倾斜系列采集软件26在一个范围-60°〜5°增量60°，〜60 E / A 2的累积剂量收集在同一个显微镜。
- 重建倾斜系列使用先前用于其他样品5,29描述的图像处理软件21的突起的。
- 由第一分割的断层图像，并使用3-D图像处理软件，如前所述5创造表面模型的颜色标注的突起的三维特征。
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Representative Results
在此之前通过低温冷冻ET和成像，光学显微镜图像应采取的EM网格上的神经元生长。突起应清晰可见，但不与另一个显著重叠。在图3A中的着色方块表示被放大的显示在图3B中，其中，突起在网格的格子延伸更高倍率的区域。每个网格正方形是由支撑的神经元及其突起一个多孔碳片。这些漏洞是显而易见的在4K放大，这表明神经元的身体作为一个比较大的，黑暗的，电子致密物（ 图3C），从轴突向外项目采取了低剂量的冷冻电镜图像。
神经突起休息以上的碳孔的一部分被选中在图3C的彩色方块，放大的在更高的放大倍率（20K） 图3D。在这个放大倍率，清晰的内部蜂窝结构，包括微管，囊泡，线粒体应该是显而易见（ 图3D），特别是在优化薄冰按照本协议所产生。暗黑色的结构，在图像的中心（ 图3D）是被认为是污染和通常应避免六角形冰颗粒，但是，因为它们是非常稀疏，突起本身以外，只要不与干扰重建和颜色注释进行分析和解释（ 图4）的内部结构。另一个低剂量，低放大率图像示于图5中 ，从其中一个突起可以位于，在这之后几个2-D图像可以采取与数字缝合在一起，使用图像处理软件来生成一蒙太奇（ 图6）。
初始关于EM网格神经元的低浓度镀（每板50,000个细胞/毫升）允许被间隔足够远，以确保清晰的突起（ 图3C）的可视化的神经元;浓度高于建议（> 50,000个细胞/每毫升板）可能会导致拥挤的突起，很难追查或属性的细胞成分（ 图7B和7C）的次优的图像。
图1。计划在上玻璃底菜EM电网日益增长的神经元。（A）玻璃底菜都显示，部分填充细胞介质（粉红色）。 （二）每道菜都包含一个金色的EM网格，作为一个近距离观察揭示。的E（C）涂层米网格与多聚赖氨酸被示为一个卡通侧切口。在玻璃底培养皿由被连接到一个塑料培养皿中，覆盖的圆形开口，最初切出底部的底部的正方形玻璃盖玻片。这些玻璃底菜是伽玛射线消毒和商业上买的预制。 点击这里查看大图 。
图2。原理图的EM手动印迹网格与神经元的坚持（A）特写玻璃化机器的滑动输入插槽（黑色箭头）对湿度/印迹室，其中镊子将被插入到手动涂抹标本。 （B）中展示如何在无钙滤纸（0.5厘米×0.5厘米面）应采用平点镊子处理，并通过进气道插入玻璃化机恒温恒湿试验箱用于印迹的EM网格卡通计划在其上的神经元附着（粉红细胞介质的液滴示出）。对EM网格是由湿度室内细点专业镊子举行。 点击这里查看大图 。
图3。在10倍的放大倍率EM网格上的大鼠原代神经元已经GRO中心区的黄金电子显微镜（EM）电网可视化冷冻，水合神经元（A）光学显微镜图像机翼为2周。 （B）放大视图中（A）所示的水产箱，其中神经元及其轴突的预测是可见的（粉红色箭头）。 （C） 的电子显微镜照片在4K倍率的神经突的神经元体（红色箭头）向外凸出的。示意性地对应于一区域（ 即红色框）内的（B）中所示的网格正方形中的一个。蓝盒子被视为近距离的（D），其中突起的内部功能都清晰可见20K的放大倍率（绿色箭头线粒体;橙色箭头的微管;囊泡蓝色箭头）。 点击这里查看大图 。
图4。三维重建大鼠背根神经节轴突断层和注解（A）在从一个DRG轴突不同的倾斜角度拍摄的图像的重建堆栈断层片。 （B）对应同一轴突的3-D标注。 点击这里查看大图 。
图5。大鼠背根神经节神经元（中间偏左）与轴突的预测（红色框）在4K倍率的2-D冷冻电镜图像。 点击这里查看大图 。
图6。单大鼠背根神经节轴突四个2-D冷冻电镜图像蒙太奇。每幅图像拍摄于20K的放大倍率。 点击这里查看大图 。
图7。突起的2-D冷冻电镜图像。（A）的大鼠背根神经节轴突成像接近接近胞体。 （B，C）过度拥挤的突起由于对EM网格神经元的高浓度电镀的例子。所有轴突都镀上黄金的EM网格后快速冷冻两个星期。所有图像均于20K;放大点击这里查看大图 。
图8。三维重建大鼠海马神经突断层和注解（A）断层片在从一个海马神经突起不同倾斜角度拍摄的图像的重建堆栈。 （B）对应同一轴突的3-D标注。 点击这里查看大图 。
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Discussion
我们证明了大鼠胚胎神经元（背根神经节和海马）可以生长在金电子显微镜（EM）的网格，并冻结在玻璃冰足够薄，其轴突使用2-D冷冻电镜和3-D冷冻待成像ET。虽然海马神经元突起先前已使用冷冻ET 8,10,18,23成像，协议使用市售的设备一直缺乏足够详细的成功复制。此外，虽然他们的研究已经率先使用冷冻ET的可视化海马突起，我们的研究探讨低温ET的适用性，以不止一种类型的神经元标本。
在这里，我们描述了一个详细的协议准备的EM网格与任何海马及背根神经节（DRG）神经元，印迹他们实现最佳的薄冰，并投身冻结他们的影像通过Cryo-ET。最佳杂交时间为1而不会导致冰太厚的电子束穿透，也不要太薄的玻璃体出现冰从多孔碳的边缘明显不同梯度的多孔碳的最里面。此外，通过使用玻璃化冷冻机17实现最佳薄冰可能会略有不同，每个项目，和强大的冷冻使用玻璃化冷冻机需要一个学习曲线。
虽然以前的研究都集中在海马神经元，在这里也探讨了在我们的研究中，我们已经走了进一步的背根神经节（DRG）的完好，冷冻水合整个轴突的纳米尺度，以显示图像，成像从未使用前冷冻EM或冷冻ET。背根神经节细胞被选择，因为它们的（相对于海马神经元）是专用于轴突34产生。一种协议，由cryo-EM/cryo-ET成像他们可能是为那些有兴趣来演绎轴突超微结构，即在感觉神经元是有用的。我们还提出并讨论两者的最佳和最理想的结果，以及因为，人们可以利用冷冻ET此类标本遇到潜在的文物。
在适当的细胞浓度（每皿50,000个细胞/毫升）中，神经元的间距是这样的突起允许优良接入使用光镜和电镜（ 图3A和3B）被一个或两个神经元出现的每个网格正方形（ 图3B） 。使神经元之间有足够的分离是必要的轴突通过冷冻电镜清晰的可视化（ 图3C和3D）。的神经元及其突起是在金网格的多孔碳膜支持的，如在冷冻电镜图像（ 图3C和3D）清楚地看出。神经元组织，这可以从〜15-50微米的海马神经元和背根神经节（DRG）神经元30,33太厚利用冷冻电镜成像和显示全黑的有所不同，因为是典型的为V红霉素电子致密物和厚的样品，相对于突起的相对较薄的凸起（不超过直径1微米）从它们的辐射（ 图3C和图5）。
树脂包埋的3-D的脑组织不显露突起是完全圆形的横截面14，实际上，它们的形态是可变的。因此，人们不知道，如果突起的非圆形状是自然的或试样制备神器。在背根神经节轴突（ 图4）上生长的TEM网格的测量厚度，印迹和成像，如本研究是在z方向上0.32微米（在玻璃体冰的深度）和在0.53微米的平均宽度在xy平面内。海马神经突的测得的厚度（ 图8）上生长的TEM网格，印迹和成像，如本研究是在z方向上0.50微米（在玻璃体冰的深度）和一个平均的在xy平面0.72微米。如本文中所描述的杂交过程可以弄平突起尽管它们印迹和切入式冷冻处理的整个过程中保持水合的在其原始缓冲液中。
由cryoET如所观察到的网格突起的微小变平似乎不影响其内部成分，如囊泡的结构如本文所示的，这是几乎完美的圆形，并显示脱水的迹象。与此相反，在“传统”的EM制剂，尤其是化学固定用戊二醛和多聚甲醛进行脱水的乙醇，常用的化学过程导致不可控的组织收缩。遇到这样的破坏性影响细胞的潜力，我们在我们的手稿提呈cryoET的方法被淘汰。
此外，我们的突起样品立即切入式冷冻在液态乙烷，导致我nstant在玻璃体冰'嵌入'。被冻结在玻璃态组织中出现更类似于生理状态比其他技术。超微结构的详细程度是不是使得我们的协议描述的技术是有价值的神经科学的研究人员的唯一方面。对新兴市场不断增长的网格神经元的方法，立刻印迹/暴跌冻结他们在一个玻璃态保存筛选/成像由cryoET是一个有吸引力的技术，因为它开辟了在不同研究神经元超微结构的可能性遗传，化学或环境强调没有潜在脱水文物的关注。
该印迹条件之前，冷冻，如在本协议详述，是重要的，以产生冰足够薄为可视化的超微结构特征，包括内部部件，如线粒体，囊泡和微管（ 图4，图6通过冷冻ET， 7A）。线粒体，例如，可以在我们的制剂鉴定，因为它们出现在结构上类似于已见于细胞（小鼠胚胎成纤维细胞的边缘），通过低温电子断层扫描20。它们还显示嵴，它可以在存在于该手稿的3-D彩色标注的图像可以看出。次优的图像可能会导致从厚厚的冰层中的冷冻电镜图像出现普遍不透明，阻止成功识别等功能为一体的轴突中线粒体和微管。缺乏足够的细节制备这样的标本，特别是关于如何产生最佳的薄冰，几乎可以肯定有助于定义突起8,10,17,23超微结构的有限的成功。
次优的图像也可以从网格上镀过多导致的神经元（> 50,000每皿细胞/ ml），其导致轴突（ 图过分拥挤0; 7B和7C）。模糊的图像可能是不正确的散焦的结果，必须进行调整，在这里示出的图像的散焦是采取7μm的针对性underfocus。图像被收集在该散焦，以确保更高的对比度和超微结构特征的可见性，但是，较低的失焦（ 即 2-3微米）也可用于获得这些特征的更高分辨率的详细信息。
其他因素可以导致次优的图像。例如，尽管它可能是诱人使用玻璃化机，特别是半自动化印迹特征，而不是本文所述的手工杂交的其它特征，这给了不希望的结果。双面印迹使用这种半自动化的特征初步尝试，其中，所述玻璃化机（而不是用户）吸油样品直接使用这些参数作为指定由用户印迹时间和污点的数量。然而，自动对焦之三成像这样的样本，发现所有的神经元已经溶解开，溅出的内容（多泡体等 ）。因此，玻璃化冷冻机是最适合用来在这种情况下，它的温度可控湿度室中，样品暴跌冻结前涂抹。保持在这样一种状态下的样品（湿度设定为接近100％）制备过程中最大限度地减少水的损失，并有助于确保最佳玻璃体冰后冷冻3,7。
理想情况下，以减少神经元暴露于外部干扰，应在CO 2培养箱（温度设定为37℃）接近室内的玻璃化机，和用于该装置的温度下生长，应被设置为37°C前闪冻结了EM网格的神经元。每个人都应该避免暴露神经元印迹前大幅波动的温度。在这份报告中，温度设定为32°C用于印迹的目的;神经元生长在不同的建筑物及〜10分钟的时间间隔进行的神经元的板从一个房间到另一个之间发生。小心以保护样本中的抗水，半绝热容器的运输过程中。在温度和CO 2浓度的类似变化（如所经历之前印迹/直进冷冻的神经元）发生的神经元的每〜2天当神经元被取出的孵育室的生物安全下被改变他们的媒体油烟机，作为典型的做法是对神经细胞。这是没有看到导致毒性作用的细胞。
至于什么似乎是电子致密的轴突'线粒体内颗粒的存在，有几个相互矛盾的报道存在。这种颗粒被发现在各种不同的组织，没有特别的神经元细胞。它们被认为是该规范的内部离子阳离子的水槽连接vironment的线粒体。他们似乎也创造线粒体内外膜中的酶能有效运作16之间的接触部位。
实验研究表明，钙和其它二价阳离子积聚在线粒体中，当这些离子存在于该流体浴要么分离线粒体或完整的细胞。似乎可能的是，离子被有机地结合到预先存在的内线粒体颗粒。有人建议，因此，这些颗粒被链接到线粒体31的内部离子环境的调节。
此外，在我们准备的神经元培养的EM网格为14天，其中的时机是典型的目的轴突生长15,36，在成像前通过冷冻蚀刻电镜/ ET。据报道，有老年的神经元相比，渊急剧增加细胞内钙浓度克神经元32。因此，我们有理由认为在这些年龄神经元的轴突线粒体就会显示线粒体颗粒不一定是紧张的前兆，而是因为他们拥有细胞内钙离子的存在较高。
电子致密颗粒线粒体还报道了在生长于培养并通过在我们的手稿20所使用的相同技术（低温电子断层扫描）成像的小鼠胚胎成纤维细胞。这些细胞没有表现出超微结构改变的典型模式与细胞损伤有关，例如细胞质的细胞骨架破坏和空泡形成。同样，我们的轴突内，通过可视化cryoET，我们没有观察到，否则会与细胞毒性有关的破坏细胞骨架。鉴于以上的考虑，我们得出结论，在我们的制剂中的神经元不显示线粒体颗粒作为应力或毒性的结果。
内容“>要消毒的EM网格表面，以防止污染的神经元，并且还关于EM网格到的聚-L-赖氨酸可以附着产生有利的，亲水性的表面，燃烧对EM网格电镀神经元之前被发现是有利的。紫外线杀菌未选择的，因为它需要电网的照射一段较长的时间（ 例如 20-30分钟），在生物安全罩，然后，网格将需要再次重新暴露在环境中存在的辉光时放电为目的的亲水化网格的表面。辉光放电网格可确保随后的多聚赖氨酸涂层会有效地“粘”到电网。燃烧的网格的技术是有利的，因为它结合了亲水化步骤和灭菌步中之一。初级神经元被称为是比肿瘤系的细胞系更敏感和关键的是要保持它们的环境（网格，培养皿）的无菌越好。图3C和图5），它覆盖了网格区域的目的选择的其中神经突向图像。然后，二维冷冻电镜图像可以采取在间隔时间和数字缝合在一起成一蒙太奇（ 图6）。这种技术可以用于超微结构特征，如微管组织有用的，在比单个冷冻电镜图像的更大的区域。
服用低剂量，低倍率的图像（ 图3C和图5），也是有用的识别是在跨越多孔碳膜直径一致的（无论是在孔和过碳），因此更理想的用于成像的神经突的区域和后续分析。轴突在碳膜孔扩常见于较大的neurITES（ 图5）比薄突起（ 图3C）显然更多的内部材料。这种现象被认为是发生由于缺乏在碳薄膜的孔的物理支持。当EM网格是由在其中神经元生长的培养皿取出，并随后从背面弄脏，突起与多个内部质量（ 图5）比其他的（ 图3C）有扩大的趋势和/或凹陷入孔。虽然这似乎是一件神器，它有一个好处，以更清楚地显示了突起的内部成分。利用覆盖在这个多孔碳薄膜连续的碳膜可能有助于在未来的研究中回避了这个问题。这种设置是最初尝试，但导致玻璃体冰太厚成像。不同厚度的连续的碳覆盖在EM网格随后的审判可能需要进一步的调查。
一个impor当前方法的TANT好处是，轴突内细胞成分的空间组织可以在纳米尺度，采取单个神经突数2-D图像以不同的倾斜角度，并且这堆的图像重建到的断层图像进行可视化。个别的结构特征可以然后使用适当的软件来手动注释的三维堆叠的每个二维切片在不同的颜色（见表材料与试剂的），如对于大鼠E18背根神经节轴突（DRG）神经细胞（ 图4）和大鼠E18海马神经元的神经突（ 图8）。
通过选择倾斜系列期间拍摄图像每隔5度，而不是1或2度，更少的图像被收集的，但是更高的电子剂量可以每幅图像被使用。这将导致更高的对比度和原始图像噪音更少。这是为了重建（排列由互相关为一体ST更好 EP）和随后的断层图像的注释，是由手的每个图像包括在z方向上的断层图像的堆栈完成。选择一个增量大小还取决于样品的大小，不同倾斜角之间，较大的标本将不会发生变化一样多。在这种情况下，使用较大的增量大小（5°）被认为是更合适的，由于突起的相对大的样本大小。
此外，如果需要增加基准金标记的EM电网将有助于精细图像对齐。基准标记都没有使用，因为该样品是比较大的相对于其他冷冻电镜样品（在隔离的病毒或蛋白质）和显示高对比度的各种结构特征，可以用来为每个2-D图像中的正确对准（包括3-D堆栈）通过互相关。所得到的图像堆栈中使用这种方法的良好对准，并且可供日后的3-D色彩注解。
ENT“>对于未来的研究中，用显微镜与能量过滤器可以减少因非弹性散射电子，但是这样的功能可能不容易可在大多数电子显微镜设备噪音。我们的程序，显示的图像可能会导致从标准的200千伏显微镜什么没有能量过滤器，这可能是更常用的神经科学社区。这里描述的协议进行了优化编制和可视化两种大鼠胚胎背根神经节轴突和轴突海马使用市售设备冷冻电镜和冷冻ET。一个该技术的主要优点在于，它产生从整个突起的结构信息，而不是切片，以查看他们的超微结构研磨或通过各种化学试剂处理。我们已经证明了冷冻ET是如何在神经元的超微结构将来分析用在贴近原生状态检查的影响，特别优秀的方法对轴突结构的神经系统疾病。
是因为本文报道的3-D断层图像的电子显微镜数据银行登录号如下：对于大鼠海马神经突起的EMDB在图8和主视频（从8:45-9:01），如图保藏号是EMD-5887。对大鼠背根神经节轴突如图4和在主视频（来自9:02-9:15），则EMDB保藏号是EMD-5885。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项研究已经由美国国立卫生研究院资助（PN2EY016525和P41GM103832）的支持。二手烟是由来自WM凯克中心对墨西哥湾沿岸财团（美国国立卫生研究院批准号：T32EB009379）的跨学科生物科学训练的纳米生物学跨学科研究生培养方案的研究奖金支持。
SHS解剖，成长和陶瓷DRG和海马细胞;收集的冷冻电镜和背根神经节和海马轴突冷冻 - 经济数据，重建和颜色标注的倾斜系列。 MRG解剖和MNR的实验室提供的海马细胞。资深大律师协助的倾斜系列注释。二手烟是如何解剖和神经生长训练的CW。 SHS，WCM和厕所构思的实验。自蔓延高温合成制备的手稿与其他作者的输入。
这部影片的拍摄地在该中心为t的Biozentrum的细胞成像和NanoAnalytics（C-CINA）他巴塞尔大学。 C-CINA集成部的苏黎世联邦理工学院，位于巴塞尔，瑞士的生物系统科学与工程（D-BSSE）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al.
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al.
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al.
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G.
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al.
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
