Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Udarbejdelse af Primary neuroner til visualisering neurites i frossen hydreret tilstand vha. Cryo-Electron Tomography

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/50783
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2, 3, 4
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

For at bevare neuronale processer til ultrastrukturelle analyse beskriver vi en protokol til galvanisering af primære neuroner på elektronmikroskopi gitre efterfulgt af flash frysning, hvilket giver prøver suspenderet i et lag af glasagtig is. Disse prøver kan undersøges med en cryo-elektron mikroskop til at visualisere strukturer på nanometer skala.

Abstract

Neurites begge dendritter og axoner, er neuronale cellulære processer, der muliggør overledning af elektriske impulser mellem neuroner. Definere strukturen i neurites er afgørende for at forstå, hvordan disse processer flytter materialer og signaler, der understøtter synaptiske kommunikation. Elektronmikroskopi (EM) traditionelt har været anvendt til at vurdere de ultrastrukturelle funktioner inden neuritter, men kan eksponeringen for organisk opløsningsmiddel under dehydrering og harpiks indlejring fordreje strukturer. Et vigtigt udækket mål er udarbejdelse af procedurer, der giver mulighed for strukturelle evalueringer ikke påvirket af sådanne artefakter. Her har vi etableret et detaljeret og reproducerbar protokol for voksende og flash-frysning hele neurites af forskellige primære neuroner på elektronmikroskopi gitre efterfulgt af deres eksamen med cryo-elektron tomografi (cryo-ET). Denne teknik giver mulighed for 3-D visualisering af frosne, hydreret neurites på nanometer opløsning, lette Assessment af deres morfologiske forskelle. Vores protokol giver en hidtil uset udsigt over Dorsalrodsganglieceller (DRG) neuriter, og en visualisering af hippocampus neurites i deres nær-native tilstand. Som sådan disse metoder skaber et fundament for fremtidige undersøgelser af neuritter på både normale neuroner og dem påvirket af neurologiske lidelser.

Introduction

Neuroner etablere komplekse kredsløb afgørende for funktionen af ​​det centrale og perifere nervesystem ved at udarbejde dendritter at modtage oplysninger og axoner, ofte ganske langvarige, til at kommunikere med downstream neuroner. Neuritudvækst spiller en afgørende rolle under fosterudviklingen og neuronal differentiering og vedligeholdelse af neuritter understøtter kritisk funktionen af ​​nervesystemet. Neuritisk processer også kritisk i neuronal skade og regenerering, samt sygdomme i nervesystemet. Studiet af neuronal arkitektur er afgørende at forstå både den normale og sygdomsramte hjerne. Heldigvis findes fysiologisk relevante neuronale cellekultur systemer, der kan gentage komplekse og heterogene cellulære strukturer. Baseret på opklaringen af ​​solide eksperimentelle platforme, effektive visualisering strategier, der muliggør kvalitative og kvantitative analyser af neuronal morfologi er nødvendige. Især nyttigt villevære en detaljeret metode, der giver en ensartet platform til visualisering neurites, både axoner og dendritter på nanometer skala.

Traditionel elektronmikroskopi kræver brug af organiske opløsningsmidler under dehydrering og harpiks indlejring, hvilket kan fremkalde fordrejninger i prøver fra deres sande tilstand. Til dato, er de fleste strukturelle karakteriseringer på nanometer skala baseret på større celler eller væv, der udsættes for sådanne skrappe kemikalier - og dermed begrænser fortolkningen af resultaterne 4,9,25. Desuden, for elektronstråle penetration, er sektionering kræves for organismer eller cellulære fremspring udviser en tykkelse større end 1 um 12. Endelig snit eller sleben væv resulterer i samling af diskrete skive-specifikke datasæt, hvilket gør besværlig definitionen af ​​det aflange element i neuritter. Selv for cryo-EM, hvor sektionering en frossen hydreret eksemplar er muligt metoden introducerer kompression Artifretsakter 1..

I de senere år har forskere lært at dyrke hippocampusneuroner direkte på EM net og flash-frysning dem i flydende ethan efterfølgende visualisere neurites hjælp cryo-ET 8,10,18,23. Sådanne undersøgelser, enten Dog bruge en specialfremstillet anordning 10,23, eller mangel detaljer om blotting trin til at generere tynd nok glasagtige is til rutinemæssig visualisering 8,18. For eksempel er en undersøgelse anbefaler brug af 30-40 sek duppe EM gitteret 10, men er denne værdi optimeres ikke til almindelig brug, men er specifik for at skræddersyet dyk-frysning enhed. Ved hjælp af en skræddersyet enhed snarere end en kommercielt tilgængelig en 17 for at opretholde fugtighed før at styrte-frysning af prøven kan udgøre en forhindring for udbredt reproducerbarhed.

Mens disse undersøgelser er banebrydende i at visualisere neurites ved cryo-ET, har vi taget et skridt videre for at udforske APplicability af cryo-ET til en række af neuronale prøver (hippocampus og Dorsalrodsganglieceller neuroner). Derudover diskuterer vi både optimale og suboptimale resultater, såvel som de potentielle artefakter, som man kan støde på ved hjælp af cryo-ET for sådanne prøver.

Definition af en detaljeret teknik til konservering og visualisere hele neurites på nanometer skala i en nær-indfødt stat ville forbedre muligheden for flere forskere til at udføre ultrastrukturelle studier. Til dette formål beskriver vi en effektiv og detaljeret protokol under anvendelse af kommercielt tilgængeligt udstyr til fremstilling af fikserede ufarvede neuroner til at visualisere neuritter. Dette er et vigtigt første skridt i retning af detaljering ultrastruktur sunde neurites og at lægge fundamentet for at forstå, hvad strukturelle forskelle er til stede i nervesystem modeller. Da cryo-ET kan løse ufikserede, ufarvede neuritlængder funktioner i 3-D på nanometer skala, vil metoden gøre det muligt, da aldrig værederfor at definere neuritisk arkitektur 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forberedelse Retter med EM Grids til galvanisering Primære neuroner

  1. Undersøg integritet vandudtryk carbon på guldet EM net ved hjælp af et lysmikroskop ved en forstørrelse på mindst 25X. Sørg for, at kulstof huller er> 98% intakt.
  2. For plating primære neuroner bruge en bunsenbrænder for ild-sterilisere EM net og samtidig gøre dem hydrofile. Brug en pincet til at afhente EM gitter ved sin kant, ikke det centrale inddelte areal. ADVARSEL: Lad aldrig en tændt bunsenbrænder uden opsyn, og ikke bruger handsker eller pincet med plastkomponenter mens de udfører disse trin:
    1. Før belysning bunsenbrænder, indstille luft og gas justeringer et minimalt åben position.
    2. Tænd bunsenbrænder ved hjælp af en angriber flint eller butan lighter.
    3. Ændre justeringerne luft og gas for at opnå en lille, blå indre flamme i en højere, lysere flamme blå / violet. Spidsen af ​​den indre flamme er den varmeste del af flammen. Drejeknappen underneath brænderen justerer mængden af ​​gas ind i brænderrøret, mens cylinderen af ​​brænderen kan drejes for at justere mængden af ​​luft ind i brænderen. Drejning justering luft uret formindsker luften (hvilket resulterer i en lilla flamme) og mod uret øger luften (hvilket resulterer i en gul flamme).
    4. Ved brug af metal pincet (ingen plastik dele) til at holde EM nettet, passere det hurtigt gennem flammen to gange, står kulstof-side op. Carbon side vil fremstå mere mat (mindre skinnende) og flere af en grålig nuance end den anden side.
    5. Umiddelbart overføre gitteret (carbon opad) i midten af ​​glasbund skålen placeres inden for 10 cm af bunsenbrænder. Brug en EM gitter pr fad (Figur 1). Brug kun glasbund retter, der er præsteriliserede, nemlig via gammastråling.
  3. Brug en lys mikroskop for at kontrollere nettet integritet (kulstof huller intakt), mens den stadig beholder EM gitter inde i glas bottabout skålen (for at undgå forurening). Ved anvendelse af ethvert stof på nettet eller noget, der kommer i kontakt med de neuroner, brug steril procedure og sterile pipettespidser.
  4. I en vævskultur hætte anvendelse af sterilt ansøge 250 pi af den passende belægning stof langsomt og forsigtigt til den centrale glasareal af petriskålen. Sørg for passende belægning stof dækker hele EM nettet.
    1. For hippocampusneuroner bruge poly-L-lysin (PLL, 1 mg / ml) som coating-stof, fremstillet som tidligere beskrevet 19. Bemærk, at der er behov for 250 ul pr EM nettet, pr fad, så skalere partiet i overensstemmelse hermed. For Dorsalrodsganglieceller (DRG) neuroner, brug en gelatinøse proteinblanding udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarcomaceller (se tabel af materialer og reagenser) som belægning stof, forberede som følger. Bemærk, at der er behov for 250 ul pr EM nettet, pr fad, så skalere partiet i overensstemmelse hermed.
      1. Optø en bestand flaskeDen gelatinøse proteinblanding udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarcomaceller natten over ved 4 ° C.
      2. Opbevares koldt gelatinøse proteinblanding udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarkomceller og alle komponenter, der anvendes til at gøre opløsningen, dvs ved at holde dem på is.
      3. Mens på is, fortyndes denne gelatinøs proteinblanding i Neurobasal medium til opnåelse af en 1:20 fortynding (dvs. fortyndes 500 ul af gelatinøse proteinblanding i 10 ml Neurobasal).
      4. Divide fortyndet gelatinøse proteinblanding i 1 ml portioner og straks gemme eventuelle ekstra alikvoter ved -20 ° C.
      5. Påfør 250 ul pr EM nettet, pr fad, som beskrevet i afsnit 1.4.
  5. Dæk petriskål med sin top og inkuberes (enten med PLL for hippocampus prøver, OR med det gelatinøse proteinblanding for DRG enheder) i 1 time ved stuetemperatur i vævskultur hætte.
  6. ASPIsats alle PLL (for hippocampus prøver) eller gelatinøse protein blanding (for DRG prøver) fra servicet. For at gøre dette, skal du bruge vakuum system i vævskultur hætte. Brug en steril pipettespids fastgjort til vakuumrør. Undgå direkte kontakt med EM nettet.
  7. Brug en justerbar air-forskydning pipette til nøje at anvende 250 ul sterilt PBS (phosphatpufret saltvand) til EM nettet i det centrale glasareal af hver petriskål, således at EM nettet er fuldt dækket af PBS. Derefter aspireres PBS fra hver skål. Gentag 3x.
  8. Lad det med EM net til tørre under vævskultur hætte i 15 min. Sørg for, at de er helt tørre ved at kontrollere under lysmikroskop i vævskultur værelse. Sørg for, at der ikke er bobler af fugtighed i gitteret. Hvis ja, forsigtigt aspireres ved siden af ​​EM gitter for at fjerne denne ekstra fugt. Den coatede gitteret skal straks anvendes til udpladning af neuroner.

2. Forberedelse og Plating Primær Neuroner på EM Grids

  1. Til pladen primære neuroner, første dissekere, Trypsinisér (under anvendelse af 2,5% trypsin) og tritureres at dissociere hippocampi (eller Dorsalrodsganglieceller 18 dage gamle rottefostre) i individuelle celler, som tidligere beskrevet 19.
    1. Triturat er en fælles betegnelse af neurobiologer at beskrive dissocierende klumper af celler i de enkelte celler, især ved brug af et glas pipette med en brand-poleret spids. Resultatet opnås ved forsigtigt og langsomt trække og slippe cellerne op og ned, flere gange (~ 30) via pipette.
  2. Følg procedurerne som tidligere beskrevet for DRG dissektion og celleisolering 24, der tager til efterretning at bruge 0,25% trypsin (i HBSS) at isolere rotte DRG neuroner, frem for at bruge enzymer foreslået (papain, collagenase / dispase), som er mere egnet til mus DRG-neuroner.
  3. Beregn antallet af isolerede neuroner (dvs. ved hjælp af et hæmocytometer)og bruge denne værdi til at beregne den passende mængde af celler til anvendelse til hver skål for at opnå en koncentration på 50.000 celler / ml pr fad. Den maksimale lydstyrke til at anvende er 250 ul. Bemærk, at dette kun fylder den centrale glasareal, ikke hele skålen.
  4. Inkubér skålene i 30 minutter i en CO2-inkubator ved 37 ° C. Tillad celler til at komme sig og overholde.
  5. Langsomt tilsættes 1,5 ml opvarmet medier til hver skål, pas på ikke at forstyrre EM nettet. Den medietype afhænger af celletype (hippocampus eller DRG).
    1. Forbered relevante medier for enten hippocampusneuroner 19 eller Dorsalrodsganglieceller neuroner 24, som er at være varmet i et 37 ° C vandbad før brug. Inkuber retter natten over i CO 2 inkubator.
    2. For hippocampusneuroner ændre medierne den næste dag. Skift halvdelen af ​​mediet hver to dage videre i 14 dage. Varm medierne i et 37 ° C vandbad før brug. For DRG-neuroner, dagen efter dissektion / udpladning forberede en ny bestand af medier med et anti-mitotisk middel (uridin og 5'-fluor-2'-deoxyuridin) at en 10 mM stamopløsning af hver særskilt anvende en endelig koncentration på 10 uM for hver. Fjern halvdelen af ​​DRG-medier (875 ul), og der tilsættes 875 ul frisk medium med anti-mitotisk middel.
      1. For DRG neuroner, hver to dage til den første uge, skiftevis skiftende medier mellem anti-mitotiske medier og standard DRG medier. For anden uge, ændre standard DRG medier hver to dage.

3. Sintringsmidlet Neuroner på EM Grids

  1. Forbered udstyr og alle materialer til frysning og opbevaring af guld EM gitre ved kryogen temperatur: en vitrifikation enhed med et fugtigt kammer 17, fin-punkts specialiserede pincet til forglasningen maskine, lang flad punkt pincet, Dewar (e) af flydende nitrogen (LN 2), coolant beholder, EM gitter opbevaringsboks, calcium filtrerpapir.
  2. Start forglasning enhed. Indstille fugtigheden til 100% og temperaturen til 32 ° C. I "Console" sektionen, sæt blottet tid til nul sekunder. Dette giver mulighed for manuel blotting gennem side-vinduet af forglasningsanlæg maskinens fugtighed kammer.
  3. Håndter calcium filtrerpapir med handsker, lagdeling dem sådan, at tre papirer er stablet. Skær stakken ind 0,5 cm brede strimler, der er ~ 2 cm lang. Bøje dem i en 90 ° vinkel, således at den ene side af papiret har en 0,5 cm x 0,5 cm ansigt (figur 2). Ved hjælp af en pincet fjerne den midterste papir og placere den på en anden calcium filtrerpapir indtil brug.
  4. Sæt knappen gitter opbevaringsboks i knappen holderen inden forglasningen kammeret. Fyld det inderste kammer i kølevæske beholder med flydende nitrogen og vente, indtil fuldstændig fordampning. Fyld det ydre kammer af the kølevæske beholder med flydende nitrogen, indtil det opnår stabil temperatur for at gå videre til næste trin. Fyld det inderste kammer med høj renhed gasformig ethan, der vil kondensere til en flydende tilstand i den afkølede kammer.
  5. Flyt skålen (r) fra inkubatoren til en stor 100 mm polystyren skål for transport til forglasning rum, hvis ikke i umiddelbar nærhed. Brug de specialiserede vitrificeringsmidler pincet til forsigtigt at plukke EM nettet fra fadet. Bemærk hvilken side neuroner vokser på EM nettet; positionen vil noget til det næste trin. Brug den sorte glidende lås på pincet til sikkert låse pincet på EM nettet.
  6. Sæt pincet til forglasning maskine såsom den side af EM gitter, hvor neuronerne er klæbet flader til venstre væk fra sideåbning hul forglasning maskinen. Træk de specialiserede pincet til forglasning maskinen.
  7. Placer kølevæske beholder i den relevante holderaf forglasning maskinen. Det skal fyldes med tilstrækkelig LN 2 og flydende ethan. Anvendelse af den passende skærmkommando af forglasning maskine, hæve kølevæske kammer opad, indtil det er skyllet med bunden af ​​fugtigt kammer.
  8. Med de flade punkt pincet, gribe en kant af filteret papir, således at den korteste side (de 0,5 cm x 0,5 cm ansigt) er vinkelret på pincetten. Dette ansigt kommer i direkte kontakt med EM nettet for blotting (figur 2B). Sæt forsigtigt filteret papir i side-hul forglasningsanlæg maskinens fugtighed kammer (figur 2A). Stabilt holde papiret mod EM nettet (den side, der vender væk fra prøven) i 10 sek. Kassér papiret bagefter og straks styrte-fryse modellen i den flydende ethan ved hjælp af forglasning maskinens automatisering.
  9. Overføre forsigtigt din frosne hydreret EM nettet til en af ​​spalterne i en af ​​degrid storage knapper. Gentag processen for yderligere EM gitre i skålene. EM grid opbevaringskasser knapper, der bruges i disse eksperimenter kan gemme flere frosne hydreret EM net.

4.. Billede indsamling, behandling, og Annotation

  1. Fortsæt at indsamle 2-D elektronmikrofotografier og / eller 3-D tilt series 5 af neuritter ved hjælp af en cryo-elektronmikroskop under en lav dosis tilstand. De 2-D billeder havde til formål at vurdere kvaliteten af ​​nettet i form af isens tykkelse, og de mulige områder at være nyttige for 3-D tilt-serien.
    1. I dette tilfælde blev alle billeder indsamlet ved hjælp af et 4k x 4k CCD kamera knyttet til en 200 kV elektronmikroskop udstyret med en enkelt holder tilt flydende nitrogen cryo overførsel, på 20k mikroskop forstørrelse på et mål underfocus på 7 m og prøvetagning på 4,4 Å / pixel.
    2. For at opnå en 3D tomogram af prøven, tage en serie af projektion billeder, mens trinvist vippe prøve along ene akse transmissions elektron mikroskop (TEM). I betragtning af de tilt vinkler og andre eksperimentelle indstillinger, der er flere forskellige software til rådighed til automatisk at indsamle tilt serie 5.. 3-D tilt-serie vist her blev indsamlet på samme mikroskopet med halvautomatisk tilt serie erhvervelse software 26 over et område på -60 ° til 60 ° ved 5 ° intervaller med en kumulativ dosis på ~ 60 e / A 2.
  2. Genskab tilt-serie i neurites hjælp billedbehandling software 21 som tidligere beskrevet for andre prøver 5,29.
  3. Color-anmærke 3-D funktioner i neuritter ved først at segmentere tomogram og skabe en overflade model ved hjælp af en 3-D billedbehandling software som tidligere beskrevet 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forud for frysning og billedbehandling via cryo-ET bør lysmikroskop billeder tages hensyn til EM gitter, hvor neuroner vokser. Neurites bør klart være synlig uden betydelig overlapning med hinanden. En farvet boks i figur 3A repræsenterer et område, der zoomes ind for at vise en større forstørrelse i figur 3B, hvor neurites strækker sig over gitterværk af nettet. Hvert gitter-kvadrat er sammensat af en med huller forsynet carbonfilm, der understøtter neuroner og deres neuritter. Disse huller er synlige i en lav dosis cryo-EM billede taget på 4k forstørrelse, som viser neuron krop som en forholdsvis stor, mørk, elektron-tætte objekt (figur 3C), hvorfra neurites projekt udad.

En del af neurit hviler over et hul i carbon er valgt i et farvet felt i figur 3C, og zoomet ind på en højere forstørrelse (20k) i figur 3D. På denne forstørrelse, bør klare interne cellulære strukturer, herunder mikrotubuli, vesikler og mitokondrier være tydeligt (figur 3D), især i de optimalt tynd is som genereres efter denne protokol. De mørke sorte strukturer i midten af billedet (Figur 3D) er sekskantede is partikler, der betragtes som forurening og bør typisk undgås, men da de er meget sparsomme og uden for neuritter selv, at de ikke griber ind i genopbygning og farve-kommentering af de interne strukturer for analyse og fortolkning (Figur 4). En anden lavdosis lav forstørrelse billede er vist i figur 5, hvorfra en neurit kan placeres, hvorefter en række 2-D billeder kan tages og digitalt syet sammen ved hjælp af billedbehandling til at generere en montage (figur 6).

Den indledendelav koncentration plating (50.000 celler / ml per plade) af neuroner på EM-net giver mulighed for neuroner, der sidder langt nok fra hinanden til at sikre en klar visualisering af deres neuritter (figur 3C), højere koncentration end anbefalet (> 50.000 celler / ml per plade ) kan resultere i suboptimale billeder af overfyldte neurites, der er vanskelige at spore eller attribut cellulære komponenter (figur 7B og 7C).

Figur 1
Figur 1. Ordning for dyrkning neuroner på EM-gitre inden glasbund retter. (A) glasbund retter er vist delvist fyldt med celle medier (lyserød). (B) Hver skål indeholder en guld EM gitter, som et tættere billede afslører. (C) Coating af EM gitter med poly-lysin er vist som en tegneserie side cutaway. Glasbund skålen består af en firkantet dækglas, der er fastgjort til bunden af ​​en plast dyrkningsskål, der dækker en cirkulær åbning, der oprindeligt blev skåret ud af bunden. Disse glasbund retter er gammasteriliseret og kommercielt købt som premade. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. Skematisk for manuel blotting af EM net med neuroner overholdes. (A) Close-up af forglasningen maskinens glidende indgang slot (sort pil) til fugt / blotting kammer, hvor pincet vil blive indsat for at udviske prøven manuelt. (B)Cartoon-ordningen viser, hvordan calcium-filtrerpapir (0,5 cm x 0,5 cm ansigt), skal håndteres ved hjælp af de faste punkt pincet og indsættes gennem posten slot i fugtighed kammer forglasningsanlæg maskine til duppe EM gitter på hvilke neuroner overholdes (dråbe af lyserøde cellemedier vist). EM gitter holdes af fine-punkts specialiserede pincet inde i fugtigt kammer. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. Visualisering frosset, hydratiserede neuroner på guld-elektronmikroskopi (EM) net. (A) Lysmikroskop billede ved 10X forstørrelse af det centrale område af en EM-gitter, som rotte primære neuroner har været Grokanten i 2 uger. (B) indzoomet betragtning af aqua boksen vist i (A), hvor neuroner og deres neurit fremspring er synlige (lyserøde pile). (C) Electron micrograph på 4K forstørrelse af et neurit rager udad fra neuron legeme (rød pil). Skematisk svarer til et område (dvs. den røde boks) inden for et af de netkvadrater vist i (B). Blå boks ses nærbillede i (D), hvor neurit interne funktioner er tydeligt på 20k forstørrelse (grøn pil mitokondrier, orange pil mikrotubuli, vesikel blå pil). Klik her for at se større billede .

Figur 4
Figur 4.. 3-D rekonstruktion og kommentering af en rotte DRG Axon tomogram. (A) Tomografisk skive fra en rekonstrueret stak af billeder taget ved forskellige tilt vinkler på én DRG Axon. (B) Tilsvarende 3-D annotation af samme Axon. Klik her for at se større billede .

Figur 5
Figur 5. 2-D cryo-EM billede af en rotte DRG neuron (centrum-venstre) med axonale fremskrivninger (rød kasse) på 4k forstørrelse. Klik her for at se større billede .

Figur 6 Figur 6. Montage af fire 2-D cryo-EM billeder af en enkelt rotte DRG Axon. Hvert billede blev taget på 20k forstørrelse. Klik her for at se større billede .

Figur 7
Figur 7. 2-D cryo-EM billeder af neuritter. (A) en rotte DRG Axon afbildet tættere nærhed til celle soma. (B, C) ​​Eksempler på over-crowding af neuritter på grund af høj plating koncentration af neuroner på EM net. Alle neurites var flash-frosne to uger efter, plating på guld EM net. Alle billeder blev taget på 20k;. Forstørrelse Klik her for at se større billede .

Figur 8
Figur 8. 3-D rekonstruktion og kommentering af en rotte hippocampus neurite tomogram. (A) Tomografisk skive fra en rekonstrueret stak af billeder taget ved forskellige tilt vinkler på én hippocampus neurite. (B) Tilsvarende 3-D annotation af samme neurite. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi viser, at rotte embryonale neuroner (Dorsalrodsganglieceller og hippocampus) kan dyrkes på guld-elektronmikroskopi (EM) net og frosset i glaslegemet is tynd nok for deres neuritter, der skal afbildes ved hjælp af 2-D cryo-EM og 3-D cryo- ET. Mens hippocampus neurites tidligere har været filmede med cryo-ET 8,10,18,23, en protokol detaljeret nok for en vellykket replikation ved hjælp kommercielt tilgængelige enheder har manglet. Desuden mens deres forskning har været banebrydende brug af cryo-ET til at visualisere hippocampus neurites, vore studier undersøge anvendeligheden af ​​cryo-ET til mere end én type af neuronale eksemplar.

Her beskriver vi en detaljeret protokol forbereder EM gitre med enten hippocampus og Dorsalrodsganglieceller (DRG) neuroner, blotting dem med at opnå optimalt tynd is, og styrte-frysning dem til billeddannelse ved cryo-ET. Optimal blotting, er ét, der ikke resulterer i is for tyk til elektronstrålen at trænge ind,eller for tynd, at den glasagtige is vises med markant anderledes gradient fra kanten af ​​Holey kulstof til det inderste af Holey kulstof. Desuden kan opnå optimalt tynd is ved at bruge en forglasningsanlæg maskine 17 være lidt anderledes for hvert projekt, og robust frysning ved hjælp af forglasning maskinen kræver en indlæringskurve.

Mens tidligere forskning har fokuseret på hippocampusneuroner, også udforsket her i vores studier, er vi gået videre til at vise billeder på nanometer skala af intakte, frosne hydreret hele axoner af Dorsalrodsganglieceller (DRG), aldrig filmede før du bruger cryo- EM eller cryo-ET. DRG-celler blev valgt, fordi de (i modsætning til hippocampale neuroner) udelukkende giver anledning til axoner 34. En protokol til billeddannelse dem ved cryo-EM/cryo-ET kunne være nyttig for dem interesseret i at udlede axon ultrastruktur dvs i sensoriske neuroner. Vi har også til stede og diskutere både optimale og suboptimale resultater, samtde potentielle artefakter, som man kan støde på ved hjælp af cryo-ET for sådanne prøver.

Ved korrekt cellekoncentration (50.000 celler / ml pr skål), afstanden mellem neuroner er sådan, at neuritter tillader fremragende adgang ved hjælp af lys og elektronmikroskopi (figur 3A og 3B) med en eller to neuroner optræder pr grid-square (figur 3B) . Tilstrækkelig adskillelse mellem neuroner er nødvendig for klar visualisering af neuritter via cryo-EM (figurerne 3C og 3D). De neuroner og deres neurites understøttes på en Holey kulstof film af guld nettet, som ses tydeligt i cryo-EM billeder (figur 3C og 3D). Neuron organer, som kan variere fra ~ 15-50 um for hippocampus neuroner og Dorsalrodsganglieceller (DRG) neuroner 30,33 er for tyk til billeddannelse ved hjælp af cryo-EM og synes helt sort, som er typisk for very elektron-tætte objekter og tykke prøver, i forhold til de relativt tyndere fremskrivninger af neuritter (højst 1 um i diameter) udstrålende fra dem (figur 3C og 5).

Harpiks-embedded 3-D hjernevæv ikke afslører neurites der er helt cirkulær i tværsnit 14, i virkeligheden, deres morfologi er variabel. Det er således ikke, om den ikke-cirkulære form neuritter er naturligt eller en prøvepræparation artefakt. Den målte tykkelse af DRG Axon (figur 4) dyrket på TEM-gitter, blottet og afbildes som vist i denne undersøgelse var 0,32 um i z-retningen (i dybden af den glasagtige is) og en gennemsnitlig bredde på 0,53 um xy-planet. Den målte tykkelse af hippocampus neurit (figur 8) dyrket på TEM-gitter, blottet og afbildes som vist i denne undersøgelse var 0,50 um i z-retningen (i dybden af den glasagtige is) og engennemsnit på 0,72 um i xy-planet. Den blotting proces som beskrevet heri kan flade de neurites selvom de forblev hydreret i deres oprindelige buffer under hele processen af ​​blotting og dyk-frysning proces.

Den lille udfladning af neuritter på nettet, som observeret af cryoET synes ikke at påvirke strukturen af ​​sine interne bestanddele, som f.eks vesikler som vist heri, som er næsten perfekt cirkulære og viser ingen tegn på dehydrering. Derimod de kemiske processer, der almindeligvis anvendes i 'traditionelle' EM præparater, navnlig kemisk fiksering med glutaraldehyd og paraformaldehyd efterfulgt af dehydrering i ethanol, resulterer i ukontrolleret væv svind. Potentialet for at støde på sådan en skadelig cellulær effekt elimineres i den metode, vi præsenterer for cryoET i vores manuskript.

Desuden er vores neurites prøver blev straks kaste-frosset i flydende ethan, hvilket resulterer i jegnstant 'indlejring' i glasagtige is. Væv, der er fastfrosset i en glasagtig tilstand fremstå meget mere ligner den fysiologiske tilstand end andre teknikker. Niveauet af ultrastrukturelle detaljer er ikke det eneste aspekt, der gør teknikken beskrevet i vores protokol for at være værdifulde for neuroscience forskere. Teknikken af ​​voksende neuroner på EM-gitre, straks blotting / dyk-frysning dem til at bevare i en glasagtig tilstand til screening / billeddannelse af cryoET er en attraktiv teknik, fordi det åbner op for muligheden for at undersøge ultrastruktur af neuroner under forskellige genetiske, kemiske eller miljømæssige understreger, uden bekymring for potentielle dehydrering artefakter.

De blotting betingelser forud for nedfrysning, som beskrevet i denne protokol, er vigtige for at generere is tynd nok til visualisering af cryo-ET af de ultrastrukturelle funktioner, inklusive interne komponenter såsom mitochondrier, vesikler og mikrotubuli (figur 4, 6, 7A). Mitokondrier, for eksempel, kunne identificeres i vores forberedelser, da de synes strukturelt svarer til, hvad der er set i celler (kanterne af muse embryonale fibroblaster) via cryo-elektron tomografi 20. De viser også cristae, som kan ses i 3-D farve-kommenteret billeder til stede i dette manuskript. Suboptimale billeder kan skyldes tykke is, hvor cryo-EM-billedet vises generelt uigennemsigtig, hvilket forhindrer en vellykket identifikation af sådanne funktioner som mitokondrier og mikrotubuli i neurite. En mangel på tilstrækkelige oplysninger til fremstilling af sådanne prøver, især om, hvordan man producerer optimalt tynd is, næsten helt sikkert bidraget til den begrænsede succes med at definere ultrastruktur neurites 8,10,17,23.

Suboptimale billeder kan også skyldes udpladning for mange neuroner på risten (> 50.000 celler / ml per skål), hvilket resulterer i overfyldte neuritter (fig.0, 7B og 7C). Slørede billeder kan være et resultat af ukorrekt Defocus og skal justeres, det Defocus i billederne vist her blev taget med en målrettet underfocus på 7 um. Billeder blev indsamlet ved at Defocus at sikre højere kontrast og synlighed ultrastrukturelle træk, men kan også bruges en lavere Defocus (dvs. 2-3 um) for at opnå højere detaljer om sådanne træk opløsning.

Andre faktorer kan bidrage til optimale billeder. For eksempel, selv om det kan være fristende at bruge andre funktioner af forglasning maskine, især halvautomatisk blotting funktion, snarere end manuel blotting beskrevet heri, gav dette uønskede resultater. Dobbeltsidet blotting blev oprindeligt forsøgt ved hjælp af denne semi-automatiske funktion, hvor forglasning maskine (i stedet for bruger) blots prøven direkte anvendelse af sådanne parametre som blotting tid og antal klatter som angivet af brugeren. Men ofter billeddannelse disse prøver, blev det konstateret, at alle neuroner havde lyseret åben, løber ud af deres indhold (multivesikulære organer, mv.) Derfor er forglasning maskine bedst anvendes i dette tilfælde for sin temperatur-kontrollerbar fugtighed kammer, hvor prøven er udslettet før springet-frysning. Fastholdelse af prøven i en sådan tilstand (med fugtighed ligger tæt på 100%) minimerer vandtab under tilberedningen og er med til at sikre optimal glasagtige is post-frysning 3,7.

Ideelt for at minimere eksponering af neuroner til eksterne forstyrrelser, skal de dyrkes i en CO2-inkubator (temperatur indstillet til 37 ° C) i umiddelbar nærhed til værelse med forglasning maskine, og temperaturen for dette apparat skal være indstillet til 37 ° C før flash-frysning af neuroner på EM net. Man bør undgå at udsætte neuroner til store udsving i temperatur før blotting. I denne rapport blev temperaturen indstillet til 32 ° Ctil blotting formål neuroner blev dyrket i en anden bygning og en tidsforskydning på ~ 10 min fandt sted mellem transporterer plader af neuroner fra et rum til et andet. Der blev draget omsorg for at beskytte prøver i en vand-resistent, semi-isoleret beholder under transportprocessen. En lignende ændring i temperatur og CO 2-koncentration (som opleves af neuroner inden blotting / dyk-frysning) opstå for neuroner hver • 2 dage, hvor neuronerne er taget ud af rugekammeret for deres medier skal ændres under biosikkerhed hætte, som er typisk gjort for neuronale kulturer. Dette ses ikke at resultere i toksiske virkninger på cellen.

Med hensyn til tilstedeværelsen af ​​det synes at være elektron-tætte granula inden for neuritter mitochondrier findes adskillige modstridende rapporter. Sådanne granuler er fundet i en række forskellige væv, ikke specifikt neuronale celler. De opfattes som en vask af kationer, der regulerer den interne ioniske damiljø af mitokondrier. De synes også at skabe kontakt sites mellem indre og ydre mitochondriemembraner hvor enzymer kan fungere effektivt 16.

Eksperimentelle studier viser, at calcium og andre divalente kationer akkumuleres i mitokondrierne, når disse ioner er til stede i væsken badning enten isolerede mitokondrier eller intakte celler. Det forekommer sandsynligt, at de ioner organisk er bundet til allerede eksisterende intra-mitokondrie granulat. Det foreslås derfor, at disse granulat er knyttet til reguleringen af det indre ioniske miljø i mitokondrie 31.

Desuden neuroner i vores forberedelse blev dyrket på EM-gitre i 14 dage, timingen af hvilket er typisk for formål neuritvækst 15,36 forud for billedbehandling ved cryoEM / ET. Det er blevet rapporteret, at der er en dramatisk stigning i intracellulær calciumkoncentration i alderen neuroner sammenlignet med Youn g neuroner 32.. Derfor er det sandsynligt, at mitokondrierne i neurites disse alderen neuroner ville vise mitokondrie granulat ikke nødvendigvis som et tegn på stress, men snarere fordi de besidder en højere forekomst af intracellulært calcium.

Elektron-tætte mitokondrie granulat er også blevet rapporteret i mus embryonale fibroblaster dyrket i-kulturen og afbildet af samme teknologi (cryo-elektron tomografi), som bruges i vores manuskript 20. Disse celler viste ikke typiske mønstre for ultrastrukturel forandring er forbundet med cellulær skade, såsom cytoskeletal forstyrrelser og vakuolisering af cytoplasmaet. Ligeledes inden for vores neurites som visualiseres ved cryoET, vi ikke observere en forstyrret cytoskelet, der ellers ville være forbundet med cellulær toksicitet. På baggrund af ovenstående overvejelser, vi konkludere, at de neuroner i vores forberedelse ikke vise mitokondrie granulat som følge af stress eller toksicitet.

indhold "> For at sterilisere EM gitter overflade for at forhindre forurening af neuroner, og også til at generere en positiv, hydrofil overflade på EM gitter som poly-L-lysin kan følge flammende EM net forud for udpladning neuroner blev fundet at være en fordel. UV sterilisering blev ikke valgt, da det kræver bestråling af nettet i længere tid (f.eks 20-30 min) i biosikkerhed hætte. Så ville tavlerne nødvendigt at re-eksponerede igen til miljøet, når at blive glød -afladet med henblik på hydrofilisering nettets overflade. Glow-afladning nettet sikrer, at den efterfølgende poly-lysin belægning ville effektivt "pisk" til nettet. Teknikken flammende nettene er en fordel, da det kombinerer både hydrofiliserende skridt og sterilisering skridt i ét. er primære neuroner kendt for at være mere følsomme end tumor-baserede cellelinjer, og det er afgørende at holde deres miljø (gitter, petriskål) i sterilt som muligt.

(figur 3C og 5), som dækker mere af nettet området med henblik på at vælge hvilken neurite til billede . Derefter kan 2-D cryo-EM billeder tages med mellemrum og digitalt syet sammen i en montage (figur 6). Denne teknik kan være nyttige for ultrastrukturelle funktioner, såsom mikrotubuli organisation, over et større areal end en enkelt cryo-EM image.

Tager lavdosis lav forstørrelse billeder (figur 3C og 5) er også nyttige i at identificere områder af neurite der er i overensstemmelse med en diameter på tværs af Holey kulstof film (både i hullerne og på tværs af kulstof) og dermed mere velegnet til billedbehandling og efterfølgende analyser. Udvidelse af neuritter flere huller i carbonfilm typisk ses i større neurites (Figur 5) med klart mere intern materiale end tyndere neurites (figur 3C). Dette fænomen menes at opstå på grund af mangel på fysisk støtte i hullerne af kulstof film. Når EM gitteret fjernes fra skålen, hvor neuronerne voksede og efterfølgende blottet fra bagsiden, neuritter med mere intern masse (figur 5) end andre (figur 3C) har tendens til at udvide og / eller hænge i hullerne. Selv om dette synes at være en artefakt, har det en fordel, at det fremgår mere tydeligt de indre bestanddele af neurite. Ved hjælp af en kontinuerlig carbon film oven på denne Holey kulstof film kan bidrage til at omgå dette problem i fremtidige studier. Denne opsætning blev oprindeligt forsøgt men resulterede i glasagtige is for tyk til billeddannelse. Efterfølgende forsøg med forskellige tykkelser af kontinuerlig kul oven på EM grid kan have brug for yderligere undersøgelser.

En vigtigt fordel af den nuværende metode er, at den rumlige organisering af celle komponenter i neurite kan visualiseres på nanometer skala ved at tage flere 2-D billeder af en enkelt neurite ved forskellige hældningsvinkler, og rekonstruere denne stak billeder i et tomogram. Individuelle strukturelle træk kan derefter manuelt kommenteret for hvert 2-D udsnit af 3-D stak i forskellige farver ved hjælp af passende software (se tabel Materialer og reagenser), som vist for en Axon af en rotte E18 dorsal root ganglion (DRG) neuron (figur 4) og en neurit af en rotte E18 hippocampale neuroner (figur 8).

Ved at vælge at tage et billede hvert 5 grader under tilt serien, snarere end 1 eller 2 °, er færre billeder indsamles, men en højere dosis elektron kan anvendes pr billede. Dette resulterer i højere kontrast og mindre støj i de rå billeder. Det er bedre med henblik på genopbygning (justering af cross-korrelation som en st ep) og efterfølgende tomogram noter, som er udført af hånd for hvert billede omfatter tomogram stakken i z-retningen. Valg af en tilvækst størrelse afhænger også af størrelsen af ​​prøven, mellem forskellige hældningsvinkler vil større prøver ikke varierer så meget. I dette tilfælde blev ved anvendelse af en større trinstørrelsen (5 °), menes at være mere egnet på grund af den relativt store prøvestørrelse af neurit.

Desuden ville tilføje referencemærker guld markører til EM gitter hjælpe for fine billede justering, hvis det ønskes. Fiducial markører blev ikke anvendt, fordi prøven var forholdsvis store i forhold til andre cryo-EM prøver (vira eller proteiner isoleret) og viste høj kontrast med en række strukturelle træk, som kan anvendes til korrekt tilpasning af hver af de 2-D billeder (omfattende 3-D stack) ved krydskorrelation. Det resulterende billedstak var godt afstemt ved hjælp af denne metode, og anvendelige til efterfølgende 3-D farve annotation.

ent "> For fremtidige undersøgelser, ved hjælp af et mikroskop med en energi-filter kan reducere støj forårsaget af uelastisk spredte elektroner, men sådan en funktion er muligvis ikke umiddelbart tilgængelige på de fleste elektronmikroskopi faciliteter. Vores procedure afslører, hvad billeder kan skyldes en standard 200 kV mikroskop med ingen energi-filter, som kan være mere almindeligt tilgængelige for neurovidenskab samfund.

Den her beskrevne protokol er optimeret til at forberede og visualisere både rotte embryonale DRG axoner og hippocampus neurites bruge kommercielt tilgængeligt udstyr til cryo-EM og cryo-ET. En af de vigtigste fordele ved denne teknik er, at det giver strukturel information fra hele neurites, ikke sektioneret, formalet eller behandlet af forskellige kemiske reagenser, for at se deres ultrastruktur. Vi har vist, hvordan cryo-ET er en særlig fremragende metode til brug i fremtidige ultrastrukturelle analyser af neuroner i en tæt-på-native tilstand for behandlingen af ​​virkningerneaf neurologisk sygdom på neurite struktur.

Elektronmikroskopi Databank deponeringsnumre i 3-D tomogrammer som rapporteret i dette papir er som følger: For rotte hippocampus neurit, som vist i figur 8 og i de vigtigste video (fra 8:45 til 09:01), den EMDB tiltrædelsen nummer er EMD-5887. For rotte Dorsalrodsganglieceller neurit, som vist i figur 4 og i de vigtigste video (fra 9:02 til 09:15), det EMDB tiltrædelse nummer er EMD-5885.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning er blevet støttet af NIH tilskud (PN2EY016525 og P41GM103832). SHS blev støttet af et stipendium fra nanobiology Interdisciplinary Graduate Training Program af WM Keck Center for Tværfaglig Bioscience Træning af Gulf Coast konsortier (NIH Grant No T32EB009379).

SHS dissekeret, voksede og forglasset DRG og hippocampus celler opsamlet cryo-EM og cryo-ET data for DRG og hippocampus axoner, rekonstrueret og farve-kommenteret tilt-serien. MRG dissekeret og billede hippocampusceller i MNR laboratorium. SC bistået i tilt-serien anmærkning. SHS blev trænet af CW om, hvordan man dissekere og vokse neuroner. SHS, WCM og toilet udtænkt forsøgene. SHS udarbejdet manuskriptet med input fra andre forfattere.

Denne video blev filmet på Center for Cellulær Imaging og NanoAnalytics (C-CINA) i Biozentrum af than University Basel. C-CINA er integreret i afdelingen for Biosystemer Science and Engineering (D-BSSE) i ETH Zürich, der ligger i Basel, Schweiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample 
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Minigrid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semiautomated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
GlutaMAX Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

Tags

Neuroscience neuroner Cryo-elektronmikroskopi Electron Microscope Tomography Brain rotte primær neuron kultur morfologisk analyse
Udarbejdelse af Primary neuroner til visualisering neurites i frossen hydreret tilstand vha. Cryo-Electron Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., … More

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter