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Neuroscience

क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का प्रयोग एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में neurites दृश्यमान करने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/50783
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2, 3, 4
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Ultrastructural विश्लेषण के लिए neuronal प्रक्रियाओं की रक्षा करने के लिए, हम कांच बर्फ की एक परत में निलंबित नमूने उपज, फ़्लैश ठंड से पीछा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर प्राथमिक न्यूरॉन्स के चढ़ाना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन नमूनों नैनोमीटर पैमाने पर संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जांच की जा सकती.

Abstract

Neurites, दोनों dendrites और axons, न्यूरॉन्स के बीच बिजली के उद्यमी के चालन सक्षम है कि neuronal सेलुलर प्रक्रियाओं हैं. Neurites की संरचना को परिभाषित करने के लिए इन प्रक्रियाओं synaptic संचार का समर्थन करते सामग्री और संकेतों को स्थानांतरित कैसे समझ के लिए महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) पारंपरिक neurites भीतर ultrastructural सुविधाओं का आकलन किया गया है, तथापि, निर्जलीकरण और राल एम्बेडिंग दौरान कार्बनिक विलायक के लिए जोखिम संरचनाओं विकृत कर सकते हैं. एक महत्वपूर्ण unmet लक्ष्य ऐसी कलाकृतियों से प्रभावित नहीं संरचनात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं कि प्रक्रियाओं के निर्माण है. यहाँ, हम बढ़ रही है और क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो ईटी) के साथ अपने परीक्षण के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर विभिन्न प्राथमिक न्यूरॉन्स की फ्लैश ठंड पूरे neurites के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की स्थापना की है. इस तकनीक asse की सुविधा, नैनोमीटर प्रस्ताव पर जमे हुए, हाइड्रेटेड neurites की 3 डी दृश्य के लिए अनुमति देता हैउनके रूपात्मक मतभेद की ssment. हमारे प्रोटोकॉल पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) neurites, और उनके पास देशी राज्य में हिप्पोकैम्पस neurites की एक दृश्य की एक अभूतपूर्व दृश्य पैदावार. जैसे, इन तरीकों सामान्य न्यूरॉन्स और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों से प्रभावित उन दोनों के neurites पर भविष्य के अध्ययन के लिए एक आधार बना.

Introduction

न्यूरॉन्स बहाव के न्यूरॉन्स के साथ संवाद करने के लिए जानकारी और axons, अक्सर काफी लंबा, प्राप्त करने के लिए डेन्ड्राइट विस्तार से मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली के समारोह के लिए जटिल circuitry आवश्यक स्थापना. Neurite परिणाम तंत्रिका तंत्र के लिए गंभीर समारोह का समर्थन करता है भ्रूण विकास और neuronal भेदभाव और neurites के रखरखाव के दौरान एक मौलिक भूमिका निभाता है. Neuritic प्रक्रियाओं को भी neuronal चोट और उत्थान, साथ ही तंत्रिका तंत्र संबंधी विकार में गंभीर रूप से शामिल हैं. neuronal वास्तुकला का अध्ययन दोनों सामान्य और रोगग्रस्त मस्तिष्क को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. सौभाग्य से, physiologically प्रासंगिक neuronal सेल संस्कृति प्रणालियों कि जटिल और विषम सेलुलर संरचनाओं पुनरावृत्ति कर सकते मौजूद हैं. ठोस प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों, neuronal आकारिकी के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण है कि सक्षम प्रभावी दृश्य रणनीतियों की व्याख्या के आधार पर आवश्यक हैं. विशेष रूप से उपयोगी होगानैनोमीटर पैमाने पर neurites, दोनों axons और dendrites दृश्यमान करने के लिए एक सुसंगत मंच प्रदान करता है कि एक विस्तृत कार्यप्रणाली हो.

पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उनकी सही स्थिति से नमूनों में विकृति पैदा कर सकते हैं, जो निर्जलीकरण और राल एम्बेडिंग दौरान कार्बनिक विलायक का उपयोग आवश्यक है. इस प्रकार निष्कर्ष 4,9,25 की व्याख्या सीमित - तिथि करने के लिए, नैनोमीटर स्तर पर सबसे संरचनात्मक अभिलक्षण ऐसे कठोर रसायनों के अधीन हैं कि बड़े कोशिकाओं या ऊतकों पर आधारित हैं. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन बीम प्रवेश के लिए, सेक्शनिंग 1 माइक्रोन 12 से अधिक मोटाई का प्रदर्शन जीवों या सेलुलर protrusions के लिए आवश्यक है. अंत में, neurites की लम्बी फीचर के बोझिल परिभाषा बनाने, असतत टुकड़ा विशेष सेट डेटा के संग्रह में ऊतक परिणाम sectioned या milled. यहां तक ​​कि क्रायो EM के लिए, एक जमे हुए हाइड्रेटेड नमूना सेक्शनिंग संभव है, जिसमें विधि संपीड़न artif का परिचय1 में कार्य करता है.

हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने ईएम ग्रिड और फ्लैश ठंड बाद में क्रायो एट 8,10,18,23 का उपयोग neurites कल्पना करने के लिए तरल एटैन में उन पर सीधे hippocampal न्यूरॉन्स बढ़ने की सीख लिया है. हालांकि, इस तरह के अध्ययन के लिए एक कस्टम बनाया डिवाइस 10,23, या दिनचर्या दृश्य 8,18 के लिए पतली पर्याप्त शीशे बर्फ पैदा करने के लिए सोख्ता कदम पर कमी विवरणों का उपयोग या तो. उदाहरण के लिए, एक अध्ययन ईएम ग्रिड 10 सोख्ता के लिए 30-40 सेकंड के उपयोग की सिफारिश की है, लेकिन, इस मूल्य सामान्य उपयोग के लिए नहीं अनुकूलित लेकिन उस कस्टम बनाया डुबकी ठंड डिवाइस के लिए विशिष्ट है. डुबकी ठंड के लिए नमूना पिछले नमी बनाए रखने के लिए एक कस्टम बनाया डिवाइस के बजाय एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक 17 का प्रयोग बड़े पैमाने पर reproducibility के लिए एक बाधा बन सकता है.

इन अध्ययनों क्रायो ईटी से neurites visualizing में groundbreaking किया गया है, हम एपी का पता लगाने के लिए एक कदम आगे ले लिया हैneuronal नमूनों (हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स) की एक किस्म के लिए क्रायो एट के plicability. इसके अतिरिक्त, हम इष्टतम और suboptimal परिणाम है, साथ ही एक ऐसे नमूनों के लिए क्रायो एट का उपयोग मुठभेड़ सकता है कि संभावित कलाकृतियों दोनों पर चर्चा की.

एक के पास देशी राज्य में संरक्षण और नैनोमीटर पैमाने पर पूरे neurites दृश्यमान करने के लिए एक विस्तृत तकनीक परिभाषित ultrastructural पढ़ाई बाहर ले जाने के लिए अधिक शोधकर्ताओं के लिए क्षमता में वृद्धि होगी. यह अंत करने के लिए, हम neurites कल्पना करने unfixed, बेदाग न्यूरॉन्स तैयार करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर एक प्रभावी और विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. यह स्वस्थ neurites की फैटी ब्यौरा और संरचनात्मक अंतर तंत्रिका तंत्र रोग मॉडल में मौजूद हैं क्या समझ के लिए नींव रखना ओर एक महत्वपूर्ण पहला कदम है. क्रायो एट नैनोमीटर पैमाने पर 3 डी में unfixed, बेदाग neurite सुविधाओं को हल कर सकते हैं, विधि यह संभव कभी नहीं के रूप में हो कर देगाneuritic वास्तुकला 12 को परिभाषित करने के लिए सामने.

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Protocol

1. चढ़ाना प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए EM ग्रिड के साथ व्यंजन तैयार

  1. कम से कम 25x की बढ़ाई पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग सोने के ईएम ग्रिड पर छेददार कार्बन की अखंडता की जाँच करें. यकीन है कि कार्बन छेद> 98% अक्षुण्ण रहे हैं.
  2. प्राथमिक न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए, ईएम ग्रिड फ्लेम बाँझ और समवर्ती उन्हें हाइड्रोफिलिक रेंडर करने के लिए एक लेम्प बर्नर का उपयोग करें. इसके किनारे, नहीं केंद्रीय gridded क्षेत्र से ईएम ग्रिड लेने के लिए चिमटी का प्रयोग करें. चेतावनी: लावारिस पड़े एक जलाया लेम्प बर्नर कभी नहीं छोड़, और इन कदमों का प्रदर्शन करते हुए प्लास्टिक के घटकों के साथ दस्ताने या चिमटी का उपयोग नहीं करते:
    1. लेम्प बर्नर प्रकाश से पहले, एक न्यूनतम खुले स्थान के लिए हवा और गैस समायोजन निर्धारित किया है.
    2. एक स्ट्राइकर चकमक पत्थर या ब्यूटेन लाइटर का उपयोग लेम्प बर्नर लाइट.
    3. एक लम्बे, हल्का नीला / बैंगनी लौ के भीतर एक छोटे, नीले भीतरी लौ को प्राप्त करने के लिए हवा और गैस समायोजन सुधारे. भीतरी लौ की नोक लौ की खास हिस्सा है. के तहत दस्ताबर्नर की नली हवा बर्नर में प्रवेश की राशि को समायोजित करने के लिए दिया जा सकता है, जबकि Neath बर्नर, गैस बर्नर ट्यूब में प्रवेश की राशि को समायोजित कर देता. हवा समायोजन दक्षिणावर्त मोड़ (एक बैंगनी लौ में जिसके परिणामस्वरूप) हवा कम हो जाती है और वामावर्त (एक पीले रंग की लौ में जिसके परिणामस्वरूप) हवा बढ़ जाती है.
    4. कार्बन साइड सामना करना पड़ रहा, दो बार लौ के माध्यम से जल्दी से इसे पारित, ईएम ग्रिड धारण करने के लिए धातु चिमटी (कोई प्लास्टिक भागों) का उपयोग करना. कार्बन ओर अधिक मैट (कम चमकदार) दिखाई देते हैं और दूसरे पक्ष से एक भूरा रंग का अधिक साथ देगा.
    5. तुरंत लेम्प बर्नर की 10 सेमी के भीतर रखा गिलास नीचे डिश के केंद्र में ग्रिड (कार्बन ऊपर की ओर) हस्तांतरण. पकवान प्रति एक ईएम ग्रिड (चित्रा 1) का प्रयोग करें. केवल presterilized रहे हैं कि गिलास नीचे बर्तन, यानी माध्यम से गामा विकिरण का उपयोग करें.
  3. अभी गिलास Bott अंदर ईएम ग्रिड रखने whilst ग्रिड अखंडता (कार्बन छेद बरकरार) की जांच के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोगओम पकवान (संक्रमण से बचने के लिए). न्यूरॉन्स के साथ संपर्क में आ जाएगा कि ग्रिड या कुछ भी पर कोई पदार्थ आवेदन, बाँझ प्रक्रिया और बाँझ विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें.
  4. बाँझ प्रक्रिया का उपयोग कर एक टिशू कल्चर हुड में, पेट्री डिश के केंद्रीय कांच क्षेत्र को धीरे धीरे और सावधानी से उपयुक्त कोटिंग पदार्थ के 250 μl लागू होते हैं. उपयुक्त कोटिंग पदार्थ पूरे ईएम ग्रिड शामिल हैं सुनिश्चित करें.
    1. Hippocampal न्यूरॉन्स के लिए, पहले 19 में वर्णित के रूप में तैयार कोटिंग पदार्थ के रूप में पाली एल lysine (पीएलएल, 1 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग करें. 250 μl पकवान प्रति, ईएम ग्रिड प्रति की जरूरत है,, ताकि तदनुसार बैच पैमाने. पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स के लिए, के रूप में तैयार, कोटिंग पदार्थ के रूप में (सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें) Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक पतला प्रोटीन मिश्रण का उपयोग करें. 250 μl पकवान प्रति, ईएम ग्रिड प्रति की जरूरत है,, ताकि तदनुसार बैच पैमाने.
      1. एक शेयर बोतल पिघलना4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा secreted पतला प्रोटीन मिश्रण की
      2. ठंड रखें Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा कोशिकाओं, और बर्फ पर उन्हें रखने के द्वारा यानी समाधान बनाने के लिए इस्तेमाल सभी घटकों द्वारा स्रावित पतला प्रोटीन मिश्रण.
      3. बर्फ पर, एक 1:20 कमजोर पड़ने उपज के लिए Neurobasal मध्यम में इस पतला प्रोटीन मिश्रण पतला है (यानी Neurobasal के 10 एमएल में पतला प्रोटीन मिश्रण के 500 μl पतला).
      4. फूट डालो 1 मिलीलीटर aliquots में पतला प्रोटीन मिश्रण पतला, और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर कोई अतिरिक्त aliquots की दुकान
      5. धारा 1.4 में वर्णित के रूप में, पकवान प्रति, ईएम ग्रिड प्रति 250 μl लागू करें.
  5. अपने शीर्ष के साथ पेट्री डिश कवर और (हिप्पोकैम्पस नमूनों के लिए या तो पीएलएल के साथ, या डीआरजी नमूनों के लिए पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ) सेते टिशू कल्चर हुड में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए.
  6. ASPI(हिप्पोकैम्पस नमूनों के लिए) सभी पीएलएल या बर्तन से (डीआरजी नमूनों के लिए) पतला प्रोटीन मिश्रण की दर से. ऐसा करने के लिए, टिशू कल्चर हुड में वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करें. वैक्यूम ट्यूब से जुड़ी एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करें. ईएम ग्रिड के साथ सीधे संपर्क से बचें.
  7. ध्यान से ईएम ग्रिड पूरी तरह से पीबीएस द्वारा कवर किया जाता है कि इस तरह के प्रत्येक पेट्री डिश के केंद्रीय कांच क्षेत्र में ईएम ग्रिड को बाँझ पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) के 250 μl लागू करने के लिए एक समायोज्य हवा विस्थापन विंदुक का प्रयोग करें. फिर, प्रत्येक पकवान से पीबीएस महाप्राण. 3x दोहराएँ.
  8. ईएम ग्रिड के साथ बर्तन में 15 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड के नीचे सूखे की अनुमति दें. वे टिशू कल्चर कमरे में प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच से पूरी तरह से सूख रहे हैं सुनिश्चित करें. यकीन है कि ग्रिड में नमी का कोई बुलबुले हैं. यदि हां, तो ध्यान से महाप्राण अगले ईएम ग्रिड के लिए इस अतिरिक्त नमी को खत्म करने के लिए. लेपित ग्रिड न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

2. तैयारी और Plईएम ग्रिड पर ating प्राथमिक न्यूरॉन्स

  1. पहले 19 में वर्णित के रूप में, व्यक्ति की कोशिकाओं में हिप्पोकाम्पी (या 18 दिन पुराने चूहे भ्रूण के पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि) को अलग कर देना प्राथमिक न्यूरॉन्स, पहले काटना Trypsinize (2.5% trypsin का उपयोग) और महीन चुर्ण बनाना थाली करने के लिए.
    1. महीन चुर्ण बनाना विशेष रूप से एक आग पॉलिश टिप के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग करके, व्यक्ति की कोशिकाओं में कोशिकाओं की अलग कर झुरमुटों का वर्णन करने के neurobiologists द्वारा प्रयोग किया जाता एक आम शब्द है. परिणाम ध्यान से और धीरे धीरे पिपेट के माध्यम से (~ 30), ऊपर और नीचे, कई बार कोशिकाओं ड्राइंग और जारी करके हासिल की है.
  2. माउस के लिए अधिक उपयुक्त हैं सुझाव दिया है कि एंजाइमों (papain, collagenase / dispase) का उपयोग करने के बजाय, चूहे DRG न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए (HBSS में) 0.25% trypsin उपयोग करने के लिए नोट लेने, के रूप में पहले डीआरजी विच्छेदन और सेल अलगाव 24 के लिए वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करें DRG न्यूरॉन्स.
  3. (यानी एक hemocytometer का उपयोग) पृथक न्यूरॉन्स की संख्या की गणनाऔर पकवान प्रति 50,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक पकवान लागू करने के लिए कक्षों की उपयुक्त मात्रा की गणना करने के लिए इस मान का उपयोग करें. लागू करने के लिए अधिकतम मात्रा 250 μl है. यह केवल केंद्रीय कांच क्षेत्र नहीं, पूरे पकवान भरता ध्यान दें.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए व्यंजन सेते कोशिकाओं की वसूली और पालन करने की अनुमति.
  5. धीरे धीरे अन्दर ग्रिड को परेशान करने की नहीं ख्याल रख रही है, प्रत्येक पकवान गर्म मीडिया के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. मीडिया के प्रकार के सेल प्रकार (हिप्पोकैम्पस या डीआरजी) पर निर्भर करता है.
    1. उपयोग करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गरम किया जाता है जो hippocampal न्यूरॉन्स 19 या पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स 24, किसी के लिए उपयुक्त मीडिया तैयार करें. सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात व्यंजन सेते हैं.
    2. Hippocampal न्यूरॉन्स के लिए, अगले दिन मीडिया बदल जाते हैं. 14 दिनों के लिए हर दो दिन आगे मीडिया के आधे बदलें. उपयोग करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मीडिया गर्म. DRG न्यूरॉन्स के लिए, विच्छेदन / चढ़ाना अगले दिन, एक विरोधी mitotic एजेंट (uridine और 5'फ्लोरो 2 'deoxyuridine) अलग से, प्रत्येक का एक 10 मिमी शेयर समाधान बनाने के साथ मीडिया की एक ताजा स्टॉक तैयार, एक अंतिम उपयोग प्रत्येक के लिए 10 माइक्रोन की एकाग्रता. डीआरजी मीडिया (875 μl) के आधे से निकालें और विरोधी mitotic एजेंट के साथ ताजा मीडिया के 875 μl जोड़ें.
      1. DRG न्यूरॉन्स के लिए, पहले सप्ताह के लिए हर दो दिन, वैकल्पिक विरोधी mitotic मीडिया और मानक डीआरजी मीडिया के बीच मीडिया से बदल रहा है. दूसरे सप्ताह के लिए, हर दो दिनों मानक डीआरजी मीडिया बदल जाते हैं.

3. ईएम ग्रिड पर न्यूरॉन्स Vitrifying

  1. क्रायोजेनिक तापमान पर सोने ईएम ग्रिड ठंड और भंडारण के लिए उपकरण और सभी सामग्री तैयार: एक आर्द्रता चैम्बर 17 के साथ एक कांच में रूपांतर डिवाइस, तरल नाइट्रोजन के कांच में रूपांतर मशीन, लंबे समय फ्लैट बिंदु चिमटी, देवर (ओं) के लिए ठीक बिंदु विशेष चिमटी (एलएन 2), गoolant कंटेनर, ईएम ग्रिड भंडारण बॉक्स, कैल्शियम मुक्त फिल्टर पेपर.
  2. कांच में रूपांतर डिवाइस को प्रारंभ करें. 32 डिग्री सेल्सियस के 100% और तापमान को नमी सेट "कंसोल" अनुभाग में, शून्य सेकंड के लिए धब्बा समय निर्धारित किया है. यह कांच में रूपांतर मशीन की आर्द्रता चैम्बर के बगल की खिड़की के माध्यम से सोख्ता मार्गदर्शन के लिए अनुमति देता है.
  3. तीन कागजात खड़ी कर रहे हैं कि इस तरह उन्हें लेयरिंग, दस्ताने के साथ कैल्शियम मुक्त फिल्टर पेपर संभाल लेना. ~ 2 सेमी लंबे होते हैं कि 0.5 सेमी चौड़ी स्ट्रिप्स में ढेर काटें. कागज के एक ओर x 0.5 सेमी चेहरा (चित्रा 2) एक 0.5 सेमी है कि इस तरह के एक 90 डिग्री के कोण पर उन्हें झुकना. चिमटी का प्रयोग, मध्य कागज को हटाने और उपयोग करें जब तक एक और कैल्शियम मुक्त फिल्टर पेपर पर रखें.
  4. कांच में रूपांतर कक्ष के भीतर बटन धारक में ग्रिड भंडारण बटन रखा. तरल नाइट्रोजन के साथ शीतलक कंटेनर के भीतरी कक्ष भरें और पूरा वाष्पीकरण तक प्रतीक्षा करें. वें के बाहरी कक्ष भरेंतरल नाइट्रोजन के साथ ई शीतलक कंटेनर यह अगले कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए स्थिर तापमान उपलब्ध हो जाता है जब तक. ठंडा कक्ष के भीतर एक तरल अवस्था को गाढ़ा होगा कि उच्च शुद्धता गैसीय एटैन साथ भीतरी कक्ष भरें.
  5. तत्काल आसपास के क्षेत्र के भीतर कांच में रूपांतर कमरे के लिए परिवहन के लिए एक बड़े 100 मिमी polystyrene पकवान इनक्यूबेटर से (तों) चाल, अगर नहीं. ध्यान से पकवान से ईएम ग्रिड लेने के लिए विशेष कांच में रूपांतर चिमटी का प्रयोग करें. न्यूरॉन्स ईएम ग्रिड पर बढ़ रहे हैं जो की ओर ध्यान दें, स्थिति अगले कदम के लिए बात करेंगे. सुरक्षित रूप से उन्हें ग्रिड पर चिमटी लॉक करने के लिए चिमटी पर काला रपट लॉक का प्रयोग करें.
  6. कांच में रूपांतर मशीन न्यूरॉन्स दूर कांच में रूपांतर मशीन की ओर खोलने छेद से, बाईं ओर चेहरे पालन कर रहे हैं जो पर उन्हें ग्रिड की कि इस तरह के पक्ष में चिमटी डालें. कांच में रूपांतर मशीन में विशेष चिमटी वापस लेना.
  7. उपयुक्त धारक में शीतलक कंटेनर रखेंकांच में रूपांतर मशीन की. यह पर्याप्त एलएन 2 और तरल एटैन से भरा जाना चाहिए. यह नमी कक्ष के नीचे के साथ प्लावित है जब तक कांच में रूपांतर मशीन के उचित स्क्रीन कमांड का प्रयोग, ऊपर की ओर शीतलक कक्ष बढ़ा.
  8. फ्लैट बिंदु चिमटी के साथ, कम पक्ष (0.5 सेमी x 0.5 सेमी चेहरा) चिमटी सीधा करने के लिए है कि इस तरह के फिल्टर पेपर के एक किनारे समझ. यह चेहरा (चित्रा 2B) सोख्ता के लिए EM ग्रिड के साथ सीधे संपर्क में आ जाएगा. ध्यान से कांच में रूपांतर मशीन की आर्द्रता चैम्बर की ओर से छेद (2A चित्रा) में फिल्टर पेपर डालें. Stably 10 सेकंड के लिए (ओर दूर नमूना से सामना करना पड़) द्वारा एम ग्रिड के खिलाफ कागज पकड़. बाद में कागज त्यागें और तुरंत कांच में रूपांतर मशीन के स्वचालन का उपयोग तरल एटैन में नमूना डुबकी फ्रीज.
  9. सावधानी से एक में स्लॉट में से एक के लिए अपने जमे हुए हाइड्रेटेड ईएम ग्रिड हस्तांतरणग्रिड भंडारण बटन. बर्तन में अतिरिक्त ईएम ग्रिड के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. इन प्रयोगों में इस्तेमाल ईएम ग्रिड भंडारण बटन एकाधिक जमी हाइड्रेटेड ईएम ग्रिड स्टोर कर सकते हैं.

4. छवि संग्रह, प्रसंस्करण, और एनोटेशन

  1. 2 डी इलेक्ट्रॉन micrographs और / या एक कम खुराक शर्त के तहत एक क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग neurites की 3 डी झुकाव श्रृंखला 5 इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ें. 2 डी छवियों 3 डी झुकाव श्रृंखला के लिए उपयोगी होने के लिए बर्फ की मोटाई और संभावित क्षेत्रों के लिहाज से ग्रिड की गुणवत्ता का आकलन करना था.
    1. इस मामले में, सभी छवियों / 7 मीटर और 4.4 ए के नमूने की underfocus एक लक्ष्य पर 20k खुर्दबीन बढ़ाई, एक एकल झुकाव तरल नाइट्रोजन क्रायो हस्तांतरण धारक से लैस एक 200 केवी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक 4k एक्स 4k सीसीडी कैमरे का उपयोग कर एकत्र किए गए पिक्सेल.
    2. संवर्द्धित नमूना अल जबकि झुकने नमूना के एक 3 डी रण प्राप्त करने के लिए, प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला लेसंचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) के ओंग एक धुरी. झुकाव कोण और अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग्स को देखते हुए, स्वतः झुकाव श्रृंखला 5 एकत्र करने के लिए उपलब्ध कई अलग अलग सॉफ्टवेयर रहे हैं. यहाँ दिखाया गया है 3 डी झुकाव श्रृंखला ~ 60 ई / ए 2 का संचयी खुराक के साथ 5 डिग्री वेतन वृद्धि पर 60 ° -60 ° की एक सीमा से अधिक अर्द्ध स्वचालित झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण सॉफ्टवेयर 26 का उपयोग करते हुए एक ही माइक्रोस्कोप पर एकत्र किए गए थे.
  2. के रूप में पहले से अन्य नमूनों 5,29 के लिए वर्णित इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर 21 का उपयोग neurites की झुकाव श्रृंखला पुनर्निर्माण किया.
  3. पहले रण segmenting और पहले 5 वर्णित के रूप में एक 3 डी इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक सतह मॉडल बनाकर neurites की 3 डी सुविधाओं रंगीन व्याख्या.

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Representative Results

पिछले क्रायो एट के माध्यम से ठंड और इमेजिंग के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोप छवियों न्यूरॉन्स बढ़ रहे हैं जो पर उन्हें ग्रिड से लिया जाना चाहिए. Neurites एक दूसरे के साथ महत्वपूर्ण ओवरलैप बिना स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए. चित्रा 3 ए में एक रंगीन बॉक्स तेजी से बढ़ी है कि neurites ग्रिड की जाली के पार विस्तार जिसमें चित्रा 3 बी, में एक उच्च वृद्धि दिखाने के लिए एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. ग्रिड के प्रत्येक वर्ग न्यूरॉन्स और उनके neurites का समर्थन करता है कि एक छेददार कार्बन फिल्म से बना है. ये छेद जावक परियोजना neurites जिसमें से एक अपेक्षाकृत बड़े, काले, इलेक्ट्रॉन घने वस्तु (चित्रा -3 सी), के रूप में न्यूरॉन शरीर से पता चलता है जो 4k बढ़ाई, पर लिया एक कम खुराक क्रायो ईएम छवि में स्पष्ट कर रहे हैं.

कार्बन में एक छेद से ऊपर neurite आराम की एक हिस्सा चित्रा -3 सी में एक रंगीन बॉक्स में चयनित है, और तेजी से बढ़ी में चित्रा 3 डी में एक उच्च आवर्धन (20k) पर है. इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए उत्पन्न के रूप में इस बढ़ाई, सूक्ष्मनलिकाएं, पुटिका, और mitochondria सहित स्पष्ट आंतरिक सेलुलर संरचनाओं विशेष रूप से बेहतर बर्फ की पतली परत में, चित्रा (3 डी) स्पष्ट रूप से स्पष्ट किया जाना चाहिए. छवि का केंद्र (चित्रा 3 डी) में काले काले संरचनाओं संदूषण के रूप में माना जाता है और आम तौर पर परहेज किया जाना चाहिए कि हेक्सागोनल बर्फ कण होते हैं, लेकिन वे बहुत ही विरल और neurites खुद के बाहर हैं, यह देखते हुए कि वे साथ हस्तक्षेप नहीं करते पुनर्निर्माण और विश्लेषण और व्याख्या (चित्रा 4) के लिए आंतरिक संरचनाओं का रंग एनोटेशन. एक neurite कई 2 डी छवियों लिया और डिजिटल रूप से एक असेंबल (चित्रा 6) उत्पन्न करने के लिए छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक साथ सिले जा सकता है, जिसके बाद स्थित किया जा सकता है, जहां से एक और कम खुराक, कम बढ़ाई छवि, चित्रा 5 में दिखाया गया है.

प्रारंभिकईएम ग्रिड पर न्यूरॉन्स की कम चढ़ाना एकाग्रता (प्लेट प्रति 50,000 कोशिकाओं / एमएल) अपने neurites (चित्रा -3 सी) के स्पष्ट दृश्य को सुनिश्चित करने के अलावा अभी तक पर्याप्त स्थान दिया गया है कि न्यूरॉन्स के लिए अनुमति देता है, थाली प्रति (> 50,000 कोशिकाओं / एमएल की सिफारिश की सांद्रता अधिक से अधिक ) सेलुलर घटकों (आंकड़े 7B और 7C) का पता लगाने या विशेषता के लिए मुश्किल हो जाता है कि भीड़ neurites की suboptimal छवियों में परिणाम कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. गिलास नीचे व्यंजन के भीतर उन्हें ग्रिड पर न्यूरॉन्स उगाने के लिए योजना. (ए) गिलास नीचे व्यंजन आंशिक रूप से सेल मीडिया (गुलाबी) के साथ भरा, दिखाए जाते हैं. एक करीब देखने से पता चलता है के रूप में (ख) प्रत्येक पकवान, एक सोने ईएम ग्रिड शामिल हैं. ई (सी) कोटिंगपाली lysine साथ एम ग्रिड एक कार्टून पक्ष कटअवे के रूप में दिखाया गया है. गिलास नीचे पकवान मूल रूप से नीचे से बाहर काट दिया गया है कि एक परिपत्र उद्घाटन कवर प्लास्टिक संस्कृति पकवान, के नीचे से जुड़ा हुआ है कि एक वर्ग कांच coverslip से बना है. ये गिलास नीचे व्यंजन गामा निष्फल और व्यावसायिक रूप से premade के रूप में खरीदे जाते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. ईएम का मार्गदर्शन सोख्ता के लिए योजनाबद्ध पालन न्यूरॉन्स के साथ ग्रिड. चिमटी मैन्युअल रूप नमूना दाग डाला जाएगा जिसमें नमी / सोख्ता कक्ष, के लिए कांच में रूपांतर मशीन की रपट प्रविष्टि स्लॉट (काला तीर) (ए) बंद हुआ. (बी)कैल्शियम मुक्त फिल्टर पेपर (0.5 सेमी 0.5 सेमी चेहरा x) द्वारा एम ग्रिड सोख्ता के लिए कांच में रूपांतर मशीन की नमी कक्ष में फ्लैट बिंदु चिमटी का उपयोग कर संभाला और प्रवेश स्लॉट के माध्यम से डाला जाना चाहिए कि कैसे दिखा कार्टून योजना है जिस पर न्यूरॉन्स (गुलाबी सेल मीडिया की छोटी बूंद दिखाया गया है) का पालन कर रहे हैं. ईएम ग्रिड आर्द्रता चैम्बर के अंदर ठीक बिंदु विशेष चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. चूहे प्राथमिक न्यूरॉन्स gro के लिए किया गया है, जिस पर एक EM ग्रिड के मध्य क्षेत्र के 10X बढ़ाई सोने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रिड पर जमे हुए, हाइड्रेटेड न्यूरॉन्स Visualizing. (ए) प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि2 सप्ताह के लिए पंख. (बी) तेजी से बढ़ी में (ए) में दिखाया गया एक्वा बॉक्स का दृश्य, जिसमें न्यूरॉन्स और उनके neurite अनुमानों (गुलाबी तीर) दिखाई दे रहे हैं. न्यूरॉन शरीर (लाल तीर) से जावक पेश एक neurite की 4K बढ़ाई (सी) इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. रेखाचित्र (बी) में दिखाया ग्रिड वर्गों में से एक के भीतर एक क्षेत्र (लाल बॉक्स यानी) से मेल खाती है. Neurite के आंतरिक सुविधाओं स्पष्ट रूप से 20k बढ़ाई दिखाई दे रहे हैं जहां नीले बॉक्स, (डी) में बंद हुआ देखा जाता है (हरी तीर mitochondria, नारंगी तीर सूक्ष्मनलिकाएं, पुटिका नीले तीर). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. एक चूहा डीआरजी अक्षतंतु रण की 3 डी पुनर्निर्माण और एनोटेशन. (ए) एक डीआरजी अक्षतंतु के विभिन्न झुकाव कोण पर लिए गए चित्रों की एक खंगाला ढेर से Tomographic टुकड़ा. (बी) एक ही अक्षतंतु 3 डी एनोटेशन इसी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. 4k बढ़ाई axonal अनुमानों (लाल बॉक्स) के साथ एक चूहे डीआरजी न्यूरॉन (केंद्र बाएँ) के 2 डी क्रायो ईएम छवि. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6 चित्रा 6. एक भी चूहा डीआरजी अक्षतंतु के चार 2 डी क्रायो EM छवियों के असेंबल. प्रत्येक छवि 20k बढ़ाई लिया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. Neurites की 2 डी क्रायो EM छवियों. (ए) एक चूहा डीआरजी अक्षतंतु करीब निकटता में सेल सोमा को imaged. (बी, सी) अधिक भीड़ neurites की वजह से उन्हें ग्रिड पर न्यूरॉन्स के उच्च चढ़ाना एकाग्रता के उदाहरण हैं. सभी neurites सोने ईएम ग्रिड पर चढ़ाना के बाद फ्लैश जमी दो सप्ताह थे. सभी छवियों 20k पर ले जाया गया;. बढ़ाई बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

8 चित्रा
चित्रा 8. एक हिप्पोकैम्पस neurite के विभिन्न झुकाव कोण पर लिए गए चित्रों की एक खंगाला ढेर से एक चूहे के हिप्पोकैम्पस neurite रण की 3 डी पुनर्निर्माण और एनोटेशन. (ए) Tomographic टुकड़ा. (बी) एक ही neurite 3 डी एनोटेशन इसी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

हम चूहे भ्रूण न्यूरॉन्स (पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि और हिप्पोकैम्पस) सोने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रिड पर वृद्धि हुई है और 2 डी क्रायो EM और 3 डी क्रायो का उपयोग imaged किया जा करने के लिए अपने neurites के लिए काफी पतली शीशे बर्फ में जमे हुए किया जा सकता है एट. हिप्पोकैम्पस neurites पहले क्रायो एट 8,10,18,23 का उपयोग imaged किया गया है, एक प्रोटोकॉल कमी की गई है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर सफल प्रतिकृति के लिए पर्याप्त विस्तृत जानकारी दी. उनके शोध हिप्पोकैम्पस neurites दृश्यमान करने के लिए क्रायो एट के प्रयोग का बीड़ा उठाया है, जबकि इसके अलावा, हमारे अध्ययन neuronal नमूना के एक से अधिक प्रकार के लिए क्रायो ईटी की प्रयोज्यता पता लगाएं.

यहाँ, हम उन्हें बेहतर पतली बर्फ को प्राप्त करने के लिए उन्हें सोख्ता, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स या तो साथ ग्रिड की तैयारी एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, और डुबकी ठंड क्रायो एट द्वारा इमेजिंग के लिए उन्हें. इष्टतम सोख्ता समय, घुसना इलेक्ट्रॉन बीम के लिए भी मोटी बर्फ में परिणाम नहीं करता है, जो एक हैन ही शीशे बर्फ छेददार कार्बन के अंतरतम को छेददार कार्बन के किनारे से विशेष रूप से अलग ढाल के साथ भी पतली दिखाई देता है. इसके अलावा, एक कांच में रूपांतर मशीन 17 का उपयोग कर के माध्यम से बेहतर पतली बर्फ को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक परियोजना के लिए थोड़ा अलग हो सकता है, और कांच में रूपांतर मशीन का उपयोग कर मजबूत ठंड एक सीखने की अवस्था की आवश्यकता हो सकती है.

पिछले अनुसंधान भी हमारे अध्ययन में यहाँ का पता लगाया hippocampal न्यूरॉन्स, पर ध्यान केंद्रित किया है, हम पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) का अक्षत, जमे हुए हाइड्रेटेड पूरे axons की नैनोमीटर पैमाने पर छवियों को दिखाने के लिए आगे चले गए हैं, का उपयोग करने से पहले imaged कभी नहीं क्रायो ईएम या क्रायो एट. वे (hippocampal न्यूरॉन्स के विपरीत) विशेष रूप से axons 34 को जन्म देने के बाद से डीआरजी कोशिकाओं चुने गए हैं. Cryo-EM/cryo-ET द्वारा उन्हें इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल संवेदी न्यूरॉन्स में यानी axonal फैटी परिणाम निकालना रुचि रखने वालों के लिए उपयोगी हो सकता है. हम भी उपस्थित और इष्टतम और suboptimal दोनों परिणामों पर चर्चा, के रूप में अच्छी तरह सेऐसा ही एक नमूनों के लिए क्रायो एट का उपयोग मुठभेड़ सकता है कि संभावित कलाकृतियों के रूप में.

उचित सेल एकाग्रता में (पकवान प्रति 50,000 कोशिकाओं / एमएल), न्यूरॉन्स की रिक्ति neurites एक या दो न्यूरॉन्स ग्रिड वर्ग (3B चित्रा) प्रति प्रदर्शित होने के साथ (आंकड़े 3 ए और 3 बी) प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग उत्कृष्ट पहुँच के लिए अनुमति देते हैं कि इस तरह है . न्यूरॉन्स के बीच पर्याप्त जुदाई की अनुमति दे क्रायो ईएम के माध्यम से neurites की स्पष्ट दृश्य (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के लिए आवश्यक है. क्रायो EM छवियों (आंकड़े -3 सी और 3 डी) में स्पष्ट रूप से देखा के रूप में न्यूरॉन्स और उनके neurites, सोने ग्रिड के एक छेददार कार्बन फिल्म पर टिके हुए हैं. वी के लिए विशिष्ट है, के रूप में hippocampal न्यूरॉन्स और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स 30,33 क्रायो ईएम का उपयोग इमेजिंग के लिए भी मोटी हैं और पूरी तरह से काला दिखाई देते हैं के लिए 15-50 माइक्रोन ~ से भिन्न हो सकती हैं जो न्यूरॉन निकायों,ery इलेक्ट्रॉन घने वस्तुओं और मोटी नमूनों, उनमें से radiating (नहीं व्यास में 1 माइक्रोन से अधिक) neurites की अपेक्षाकृत पतली अनुमानों की तुलना में (आंकड़े -3 सी और 5).

राल एम्बेडेड 3 डी मस्तिष्क के ऊतकों पार अनुभाग 14 में पूरी तरह से परिपत्र हैं कि neurites प्रकट नहीं करता है, वास्तव में, उनके आकारिकी चर रहा है. Neurites की noncircular आकार प्राकृतिक या एक नमूना तैयार विरूपण साक्ष्य है अगर यह इस तरह नहीं जाना जाता है. मंदिर ग्रिड पर हो डीआरजी अक्षतंतु (चित्रा 4) के मापा मोटाई, 0.32 z-दिशा में माइक्रोन (कांच बर्फ की गहराई में) और 0.53 मीटर में से एक औसत चौड़ाई था blotted और इस अध्ययन में दिखाया गया है imaged XY विमान. हिप्पोकैम्पस neurite का मापा मोटाई मंदिर ग्रिड पर हो (8 चित्रा), मिट और इस अध्ययन में दिखाया गया है imaged (कांच बर्फ की गहराई में) z-दिशा में 0.50 मीटर था और एकXY विमान में 0.72 मीटर की औसत. वे सोख्ता और डुबकी ठंड प्रक्रिया की पूरी प्रक्रिया के दौरान उनके मूल बफर में हाइड्रेटेड बने रहे हालांकि इस के साथ साथ वर्णित के रूप में सोख्ता प्रक्रिया neurites समतल सकता है.

इस के साथ साथ के रूप में दिखाया cryoET द्वारा मनाया के रूप में ग्रिड पर neurites की मामूली सपाट लगभग पूरी तरह से परिपत्र हैं और निर्जलीकरण का कोई संकेत नहीं दिखा है, जो इस तरह के vesicles के रूप में अपने आंतरिक घटकों की संरचना को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता. इसके विपरीत, आमतौर पर 'पारंपरिक' उन्हें तैयारी, इथेनॉल में निर्जलीकरण द्वारा पीछा glutaraldehyde और paraformaldehyde के साथ विशेष रूप से रासायनिक निर्धारण में इस्तेमाल किया रासायनिक प्रक्रियाओं अनियंत्रित ऊतक संकोचन में परिणाम. इस तरह के एक हानिकारक सेलुलर प्रभाव का सामना करने की क्षमता हम अपने पांडुलिपि में cryoET के लिए वर्तमान पद्धति में समाप्त हो रहा है.

इसके अलावा, हमारे neurites नमूने तुरंत मैं, जिसके परिणामस्वरूप तरल एटैन में डुबकी-जमे हुए थेnstant शीशे बर्फ में 'एम्बेडिंग'. एक कांच का राज्य में जमे हुए हैं कि ऊतकों और अधिक समान शारीरिक स्थिति के लिए अन्य तकनीकों की तुलना में दिखाई देते हैं. ultrastructural विस्तार के स्तर हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक तंत्रिका विज्ञान शोधकर्ताओं को मूल्यवान बनाता है कि केवल पहलू नहीं है. यह अलग तहत न्यूरॉन्स के फैटी की जांच की संभावना को खोलता है क्योंकि उन्हें ग्रिड पर न्यूरॉन्स बढ़ रही है की तकनीक, तुरंत सोख्ता / डुबकी ठंड cryoET द्वारा स्क्रीनिंग / इमेजिंग के लिए एक कांच का राज्य में संरक्षित करने के लिए उन्हें एक आकर्षक तकनीक है आनुवंशिक, रासायनिक या पर्यावरण संभावित निर्जलीकरण कलाकृतियों की चिंता किए बिना जोर दिया है.

पूर्व ठंड के लिए सोख्ता की स्थिति, इस प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में, इस तरह के mitochondria, vesicles और सूक्ष्मनलिकाएं (आंकड़े 4, 6 के रूप में आंतरिक घटकों सहित ultrastructural सुविधाओं के क्रायो ईटी से दृश्य के लिए काफी पतली बर्फ उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं 7A). वे क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 20 के माध्यम से (माउस भ्रूणीय fibroblasts के किनारों) कोशिकाओं में देखा गया है क्या करने के लिए संरचना की दृष्टि से समान दिखाई देते हैं क्योंकि mitochondria, उदाहरण के लिए, हमारी तैयारी में पहचाना जा सकता है. उन्होंने यह भी इस पांडुलिपि में मौजूद 3 डी रंग से एनोटेट छवियों में देखा जा सकता है, cristae प्रदर्शित करते हैं. Suboptimal छवियों क्रायो ईएम छवि neurite भीतर mitochondria और सूक्ष्मनलिकाएं के रूप में ऐसी सुविधाओं का सफल पहचान को रोकने, आम तौर पर अपारदर्शी दिखाई देता है जिसमें मोटी बर्फ से परिणाम कर सकते हैं. विशेष रूप से लगभग निश्चित रूप से neurites 8,10,17,23 के फैटी परिभाषित करने में सीमित सफलता के लिए योगदान दिया, बेहतर बर्फ की पतली परत का निर्माण करने के बारे में कैसे, इस तरह के नमूनों की तैयारी के लिए पर्याप्त विवरण की कमी है.

Suboptimal छवियों भी neurites (आंकड़े की भीड़ में जो परिणाम (> 50,000 पकवान प्रति कोशिकाओं / एमएल) के ग्रिड पर भी कई न्यूरॉन्स चढ़ाना से परिणाम कर सकते हैं0; 7B और 7C). Blurry छवियों गलत defocus का परिणाम हो सकता है और समायोजित किया जाना चाहिए, यहाँ दिखाए गए चित्रों में defocus 7 माइक्रोन के एक लक्षित underfocus साथ लिया गया था. छवियाँ उच्च विपरीत और ultrastructural सुविधाओं की दृश्यता सुनिश्चित करने के लिए कि defocus पर एकत्र किए गए थे, लेकिन, एक कम defocus (यानी 2-3 माइक्रोन) भी ऐसी सुविधाओं के उच्च संकल्प विवरण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अन्य कारकों suboptimal छवियों के लिए योगदान कर सकते हैं. यह कांच में रूपांतर मशीन, विशेष रूप से अर्द्ध स्वचालित सोख्ता सुविधा के बजाय, यहाँ बताया पुस्तिका सोख्ता की अन्य सुविधाओं का उपयोग करने के लिए आकर्षक हो सकता है उदाहरण के लिए, यह अवांछनीय परिणाम दे दी है. दो तरफा सोख्ता शुरू में (बल्कि उपयोगकर्ता की तुलना में) कांच में रूपांतर मशीन सीधे उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट समय और blots की संख्या सोख्ता के रूप में इस तरह के मापदंडों का उपयोग नमूना जो blots में, इस अर्द्ध स्वचालित सुविधा का उपयोग करने का प्रयास किया गया था. हालांकि, वायुसेनाआतंकवाद इमेजिंग ऐसे नमूने, यह सब न्यूरॉन्स उनकी सामग्री (multivesicular निकायों, आदि) बाहर spilling, खुला lysed था कि पाया गया था. इसलिए, कांच में रूपांतर मशीन सबसे अच्छा नमूना ठंड डुबकी पूर्व मिट जाता है जिसमें उसके तापमान चलाया आर्द्रता चैम्बर के लिए इस मामले में प्रयोग किया जाता है. (करीब 100% के लिए सेट नमी के साथ) इस तरह के एक राज्य में नमूना बनाए रखने की तैयारी के दौरान पानी की कमी को कम करता है और यह सुनिश्चित करने में मदद करता है इष्टतम शीशे बर्फ के बाद ठंड 3,7.

आदर्श रूप में, बाहरी perturbations के न्यूरॉन्स के जोखिम को कम करने के लिए, वे कांच में रूपांतर मशीन के साथ कमरे के पास एक सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट तापमान), और इस उपकरण के लिए तापमान में विकसित किया जाना चाहिए करने के लिए सेट किया जाना चाहिए 37 डिग्री सेल्सियस से पहले फ्लैश ठंड के लिए उन्हें ग्रिड पर न्यूरॉन्स. एक पूर्व सोख्ता को तापमान में भारी उतार चढ़ाव के न्यूरॉन्स को उजागर करने से बचना चाहिए. इस रिपोर्ट में, तापमान 32 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थापित किया गया थाप्रयोजनों सोख्ता के लिए, न्यूरॉन्स एक अलग इमारत में बड़े हो रहे थे और 10 मिनट ~ की एक समय व्यतीत हो जाने के एक कमरे से दूसरे में न्यूरॉन्स की प्लेटें ले जाने के बीच हुई. केयर परिवहन प्रक्रिया के दौरान एक पानी प्रतिरोधी, अर्द्ध अछूता कंटेनर में नमूनों की रक्षा करने के लिए लिया गया था. उनके मीडिया जैव सुरक्षा के तहत बदला जा करने के लिए न्यूरॉन्स ऊष्मायन कक्ष से बाहर ले जाया जाता है जब तापमान और सीओ 2 एकाग्रता में एक समान परिवर्तन (पूर्व सोख्ता / डुबकी ठंड न्यूरॉन्स द्वारा अनुभवी के रूप में) हर ~ 2 दिनों न्यूरॉन्स होते हैं हुड, आम तौर पर neuronal संस्कृतियों के लिए किया जाता है. इस सेल के लिए विषाक्त प्रभाव में परिणाम को देखा नहीं है.

इलेक्ट्रॉन घने neurites 'mitochondria अंदर कणिकाओं क्या प्रकट की उपस्थिति के बारे में, कई परस्पर विरोधी रिपोर्टों में मौजूद हैं. इस तरह कणिकाओं विभिन्न ऊतकों की एक किस्म है, नहीं विशेष रूप से neuronal कोशिकाओं में पाए जाते हैं. वे आंतरिक आयनिक कि विनियमित फैटायनों के एक सिंक के रूप में माना जाता है एनमाइटोकांड्रिया की vironment. उन्होंने यह भी एंजाइमों कुशलता से 16 कार्य कर सकते हैं जिसमें आंतरिक और बाहरी mitochondrial झिल्ली के बीच संपर्क साइट बनाने के लिए दिखाई देते हैं.

प्रायोगिक अध्ययन के लिए इन आयनों तरल पदार्थ स्नान पृथक mitochondria या कोशिकाओं बरकरार या तो में मौजूद हैं जब कैल्शियम और अन्य द्विसंयोजक फैटायनों mitochondria में जमा संकेत मिलता है कि. यह आयनों बवाल पूर्व मौजूदा अंतर mitochondrial कणिकाओं के लिए बाध्य कर रहे हैं कि संभावना दिखाई देती है. यह इन कणिकाओं माइटोकांड्रिया 31 की आंतरिक आयनिक पर्यावरण के नियमन से जुड़े होते हैं, इसलिए, सुझाव दिया है.

इसके अलावा, हमारे तैयारी में न्यूरॉन्स 14 दिनों के लिए उन्हें ग्रिड पर सुसंस्कृत थे, जिनमें से समय से पहले cryoEM / ईटी द्वारा इमेजिंग के लिए neurite परिणाम 15,36 के प्रयोजनों के लिए विशिष्ट है. यह यूँ की तुलना में वृद्ध न्यूरॉन्स में intracellular कैल्शियम एकाग्रता में एक नाटकीय वृद्धि हुई है बताया गया है कि जी 32 न्यूरॉन्स. इसलिए, यह वे intracellular कैल्शियम की एक उच्च उपस्थिति के अधिकारी, क्योंकि इन आयु वर्ग के न्यूरॉन्स की neurites में mitochondria जरूरी नहीं कि तनाव की निशानी के रूप में, बल्कि mitochondrial कणिकाओं प्रदर्शित होता है कि प्रशंसनीय है.

इलेक्ट्रॉन घने mitochondrial कणिकाओं में भी संस्कृति हो गई है और हमारे पांडुलिपि 20 में उपयोग के रूप में उसी तकनीक (क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी) ने उतारी माउस भ्रूणीय fibroblasts में सूचित किया गया है. इन कोशिकाओं को इस तरह की कोशिका द्रव्य की cytoskeletal विघटन और vacuolization के रूप में सेलुलर चोट के साथ जुड़े ultrastructural परिवर्तन के विशिष्ट पैटर्न, नहीं दिखा था. CryoET द्वारा कल्पना के रूप में इसी तरह, हमारे neurites भीतर, हम अन्यथा सेलुलर विषाक्तता के साथ संबद्ध किया जाएगा कि एक बाधित cytoskeleton का पालन नहीं किया. ऊपर कारणों को देखते हुए, हम हमारे तैयारी में न्यूरॉन्स तनाव या विषाक्तता का एक परिणाम के रूप में mitochondrial कणिकाओं प्रदर्शित नहीं किया था कि समाप्त.

सामग्री "> न्यूरॉन्स के लिए प्रदूषण को रोकने के लिए उन्हें ग्रिड सतह बाँझ, और भी पूर्व न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए उन्हें ग्रिड ज्वलंत, जो पाली एल lysine पालन कर सकता है के लिए उन्हें ग्रिड पर एक अनुकूल, हाइड्रोफिलिक सतह उत्पन्न करने के लिए पाया गया था चमक जा रहा है जब लाभप्रद हो. यह जैव सुरक्षा हुड में एक लंबे समय (उदाहरण के लिए 20-30 मिनट) के लिए ग्रिड के विकिरण की आवश्यकता के बाद से यूवी बंध्याकरण नहीं चुना गया था. फिर, ग्रिड में पर्यावरण के लिए फिर से फिर से उजागर करने की आवश्यकता होगी -छुट्टी दे दी. ग्रिड ग्लो निर्वहन ग्रिड की सतह hydrophilizing के प्रयोजनों के लिए यह hydrophilizing कदम और नसबंदी कदम दोनों को जोड़ती है, क्योंकि बाद में पाली lysine कोटिंग ग्रिड से होगा प्रभावी ढंग से 'छड़ी'. ग्रिड ज्वलंत की तकनीक फायदेमंद है कि यह सुनिश्चित करता है एक में. प्राथमिक न्यूरॉन्स ट्यूमर आधारित सेल लाइनों की तुलना में अधिक संवेदनशील होने के लिए जाना जाता है और यह संभव के रूप में बाँझ के रूप में अपने पर्यावरण (ग्रिड, पेट्री डिश) रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

(आंकड़े -3 सी और 5), पर एक कम बढ़ाई छवि लेने के लिए बेहतर है छवि को जो neurite . फिर, 2 डी क्रायो EM छवियों अंतराल पर लिया जा सकता है और डिजिटल (चित्रा 6) एक असेंबल में एक साथ सिले. इस तकनीक को एक एकल क्रायो ईएम छवि की तुलना में एक अधिक से अधिक क्षेत्रफल में, इस तरह के microtubule संगठन के रूप में ultrastructural सुविधाओं, के लिए उपयोगी हो सकता है.

कम खुराक, कम बढ़ाई छवियों (आंकड़े -3 सी और 5) लेने (छेद में और कार्बन भर दोनों) और इमेजिंग के लिए इसलिए अधिक आदर्श छेददार कार्बन फिल्म में व्यास में संगत कर रहे हैं कि neurite के क्षेत्रों की पहचान करने में भी उपयोगी है और बाद के विश्लेषण. कार्बन फिल्म के छेद पर neurites के विस्तार आमतौर पर बड़े neur में देखा जाता हैआईटीईएस पतले neurites (चित्रा -3 सी) की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक आंतरिक सामग्री के साथ (चित्रा 5). इस घटना की वजह से कार्बन फिल्म के छेद में भौतिक समर्थन की कमी के कारण हो जाता है. ईएम ग्रिड न्यूरॉन्स बढ़ रहे थे, जिसमें पकवान से हटा दिया, और बाद में पीठ से मिट जाता है, दूसरों की तुलना में अधिक आंतरिक द्रव्यमान (चित्रा 5) (चित्रा -3 सी) के साथ neurites छेद में विस्तार और / या शिथिलता के लिए करते हैं. यह एक विरूपण साक्ष्य प्रतीत होता है, यह अधिक स्पष्ट रूप से neurite के आंतरिक घटकों को दिखाने के लिए के रूप में एक लाभ है. इस छेददार कार्बन फिल्म पर मढ़ा एक निरंतर कार्बन फिल्म का उपयोग भविष्य के अध्ययनों में इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए मदद मिल सकती है. इस सेटअप शुरू में कोशिश की लेकिन इमेजिंग के लिए भी मोटी कांच का बर्फ के परिणामस्वरूप किया गया था. ईएम ग्रिड पर मढ़ा निरंतर कार्बन के विभिन्न मोटाई के साथ बाद में परीक्षण आगे की जांच की जरूरत हो सकती है.

एक महत्वपूर्णवर्तमान पद्धति के उग्रवादी लाभ neurite भीतर सेल घटकों के स्थानिक संगठन अलग झुकाव कोण पर एक एकल neurite के कई 2 डी छवियों ले रही है, और एक रण में छवियों के इस ढेर के पुनर्निर्माण से नैनोमीटर स्तर पर देखे जा सकते हैं. एक चूहे E18 पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि की एक अक्षतंतु (डीआरजी) के लिए दिखाया गया है के रूप में व्यक्तिगत ढांचागत सुविधाओं तो स्वयं (सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें) उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अलग अलग रंग में 3 डी ढेर में से प्रत्येक 2 डी टुकड़ा के लिए एनोटेट किया जा सकता है न्यूरॉन (चित्रा 4) और एक चूहे E18 हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन के एक neurite (8 चित्रा).

बल्कि 1 या 2 डिग्री की तुलना में, झुकाव श्रृंखला के दौरान एक छवि हर 5 डिग्री लेने के लिए चयन करके, कम छवियों एकत्र कर रहे हैं लेकिन एक उच्च इलेक्ट्रॉन खुराक छवि प्रति इस्तेमाल किया जा सकता है. यह उच्च विपरीत और कच्चे छवियों में कम शोर में यह परिणाम है. यह एक सेंट के रूप में पार सहसंबंध द्वारा पुनर्निर्माण (संरेखण के प्रयोजनों के लिए बेहतर है ईपी) और z-दिशा में रण ढेर जिसमें प्रत्येक छवि के लिए द्वारा हाथ से किया जाता है जो बाद में रण एनोटेशन,. एक वेतन वृद्धि आकार का चयन भी नमूना के आकार पर निर्भर करता है, विभिन्न झुकाव कोण के बीच, बड़ा नमूनों के रूप में ज्यादा भिन्न नहीं होगा. इस मामले में, एक बड़ा वेतन वृद्धि आकार (5 °) का उपयोग होने के कारण neurite के अपेक्षाकृत बड़े नमूना आकार के लिए अधिक उपयुक्त माना गया था.

अगर वांछित इसके अलावा, ईएम ग्रिड को असंदिग्ध सोने मार्करों जोड़ने ठीक छवि संरेखण के लिए सहायता करेगा. नमूना अन्य क्रायो ईएम नमूने (अलगाव में वायरस या प्रोटीन) की तुलना में अपेक्षाकृत बड़ी थी और 2 डी छवियों में से प्रत्येक की उचित संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ढांचागत सुविधाओं की एक किस्म के साथ उच्च विपरीत दिखाया क्योंकि मापकला मार्करों इस्तेमाल नहीं किया गया पार सहसंबंध (3 डी पर ढेर शामिल). परिणामस्वरूप छवि पर ढेर अच्छी तरह से इस दृष्टिकोण का उपयोग गठबंधन, और बाद में 3 डी रंग एनोटेशन के लिए useable गया था.

ईएनटी "> भविष्य के अध्ययन के लिए, एक ऊर्जा फिल्टर के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग inelastically बिखर इलेक्ट्रॉनों लेकिन ऐसी सुविधा सबसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुविधाओं पर आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है की वजह से शोर कम हो सकता है. हमारी प्रक्रिया छवियों को एक मानक 200 केवी माइक्रोस्कोप से परिणाम कर सकते हैं क्या पता चलता है कोई ऊर्जा फिल्टर के साथ, जो बड़े पैमाने पर तंत्रिका विज्ञान समुदाय के लिए अधिक सामान्य रूप से उपलब्ध हो सकता है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल तैयारी और क्रायो EM और क्रायो एट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग चूहा भ्रूण डीआरजी axons और हिप्पोकैम्पस neurites दोनों दृश्यमान करने के लिए अनुकूलित है. इस तकनीक का मुख्य लाभ में से एक यह sectioned नहीं पूरे neurites से संरचनात्मक जानकारी, उनके फैटी देखने के क्रम में milled या विभिन्न रासायनिक अभिकर्मकों द्वारा इलाज है कि पैदावार है. हम क्रायो एट प्रभाव की जांच के लिए एक बंद करने वाली देशी राज्य में न्यूरॉन्स के भविष्य ultrastructural विश्लेषण में उपयोग के लिए एक विशेष रूप से शानदार तरीका है कैसे दिखा दिया हैneurite संरचना पर स्नायविक रोग की.

इस प्रकार इस पत्र में रिपोर्ट के रूप में 3 डी tomograms के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा बैंक परिग्रहण नंबर हैं: चूहे के हिप्पोकैम्पस neurite लिए EMDB, (8:45-9:01 से) 8 चित्र में और मुख्य वीडियो में दिखाया गया है परिग्रहण संख्या ईएमडी-5887 है. चित्रा 4 में और (9:02-9:15 से) मुख्य वीडियो में दिखाया गया है चूहे पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि neurite के लिए, EMDB परिग्रहण संख्या ईएमडी-5885 है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस शोध एनआईएच अनुदान (PN2EY016525 और P41GM103832) द्वारा समर्थित किया गया है. एसएचएस खाड़ी तट भागीदारी (एनआईएच अनुदान सं T32EB009379) के अंतःविषय बायोसाइंस प्रशिक्षण के लिए WM उबकना केंद्र की Nanobiology अंतःविषय स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

एसएचएस, विच्छेदित हुआ और डीआरजी और हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं vitrified, क्रायो EM और डीआरजी और हिप्पोकैम्पस axons की क्रायो एट डेटा एकत्र; खंगाला और झुकाव श्रृंखला रंग से एनोटेट. MRG विच्छेदित और MNR प्रयोगशाला में हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं प्रदान की है. अनुसूचित जाति झुकाव श्रृंखला एनोटेशन में सहायता प्रदान की. एसएचएस न्यूरॉन्स काटना और कैसे विकसित करने पर CW द्वारा प्रशिक्षित किया गया था. एसएचएस, WCM और WC प्रयोगों की कल्पना की. एसएचएस अन्य लेखकों से इनपुट के साथ पांडुलिपि तैयार.

इस वीडियो टी के Biozentrum के सेलुलर इमेजिंग और NanoAnalytics (सी Cina) के लिए केंद्र में फिल्माया गया थाविश्वविद्यालय बेसल वह. सी Cina बेसल, स्विट्जरलैंड में स्थित ETH ज्यूरिख, के Biosystems विज्ञान और इंजीनियरिंग (डी BSSE) के लिए विभाग में एकीकृत है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample 
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Minigrid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semiautomated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
GlutaMAX Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 84 न्यूरॉन्स क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप टोमोग्राफी मस्तिष्क चूहे प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति रूपात्मक परख
क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का प्रयोग एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में neurites दृश्यमान करने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी
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Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., … More

Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

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