Summary
Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.
Abstract
Neuritos, ambos os dendritos e axônios, são processos celulares neuronais que permitem a condução de impulsos elétricos entre os neurônios. Definir a estrutura de neurites é fundamental para a compreensão de como esses processos mover materiais e sinais que suportem comunicação sináptica. A microscopia eletrônica (EM) tem sido tradicionalmente usada para avaliar as características ultra-estruturais dentro de neurites, no entanto, a exposição a solventes orgânicos durante a desidratação e resina incorporação podem alterar as estruturas. Um objetivo importante não atendida é a formulação de procedimentos que permitam avaliações estruturais não impactadas por tais artefatos. Aqui, nós estabelecemos um protocolo detalhado e reprodutível para o cultivo e de congelamento de flash neurites inteiros de diferentes neurônios primários em grades de microscopia eletrônica, seguido por seu exame com tomografia crio-elétron (crio-ET). Esta técnica permite a visualização 3-D de congelados, neurites hidratados com resolução nanométrica, facilitando assessment de suas diferenças morfológicas. Nosso protocolo produz uma visão sem precedentes da raiz dorsal (DRG) gânglio neurites, e uma visualização de neurites hipocampo em seu estado quase original. Como tal, estes métodos de criar uma base para futuros estudos sobre neurites de ambos os neurônios normais e aqueles afetados por distúrbios neurológicos.
Introduction
Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizmente, existem sistemas de cultura de células neuronais fisiologicamente relevantes que podem recapitular estruturas celulares complexos e heterogêneos. Com base na elucidação de plataformas experimentais sólidos, estratégias eficazes de visualização que permitem análises qualitativas e quantitativas da morfologia neuronal são necessários. Especialmente útil seriaser uma metodologia detalhada que fornece uma plataforma consistente para a visualização de neurites, ambos os axônios e dendritos em escala nanométrica.
Microscopia tradicional elétron requer o uso de solvente orgânico durante a desidratação e incorporação de resina, o que pode induzir distorções nas amostras de seu verdadeiro estado. Até à data, a maioria das caracterizações estruturais em escala nanométrica são baseados em células ou tecidos maiores, que são submetidos a tais produtos químicos - limitando, assim, a interpretação dos resultados 4,9,25. Além disso, para a penetração do feixe de electrões, de corte é necessária para que os organismos celulares ou saliências que apresentam uma espessura superior a 1 um 12. Finalmente, os resultados de tecido seccionados ou branqueado no conjunto de conjuntos de dados discretos específico slice, tornando complicada a definição da característica alongada de neurites. Mesmo para crio-EM, em que o corte de um espécime congelado hidratado é possível, o método apresenta compressão ArtifAtos 1.
Nos últimos anos, os pesquisadores aprenderam a crescer neurônios do hipocampo diretamente em grades e EM-los em etano líquido para visualizar posteriormente neurites usando crio-ET 8,10,18,23 de congelamento flash. No entanto, tais estudos ou usar um dispositivo feito sob medida 10,23, ou detalhes de falta na etapa mata-borrão para a geração de gelo vítreo suficientemente fina para visualização rotina 8,18. Por exemplo, um estudo recomenda o uso de 30-40 segundos para secar a grade EM 10, no entanto, este valor não é otimizado para uso geral, mas é específico para esse dispositivo de congelamento mergulho feito por encomenda. Usando um dispositivo feito sob medida, em vez de um comercialmente disponível um 17 para a manutenção de umidade antes de mergulhar de congelamento da amostra pode representar um obstáculo para a reprodutibilidade generalizada.
Embora esses estudos têm sido inovador em visualizar neurites por crio-ET, demos um passo à frente para explorar a applicability de crio-ET para uma variedade de amostras (neuronais do hipocampo e do gânglio da raiz dorsal, neurónios). Além disso, discute-se ambos os resultados ótimos e subótimos, bem como os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes.
Definindo uma técnica detalhada para a preservação e visualizar neurites inteiros em escala nanométrica em um estado quase nativo iria aumentar a capacidade para mais pesquisadores para realizar estudos ultra-estruturais. Para este efeito, descrevem um protocolo eficaz e detalhado usando equipamentos disponíveis comercialmente para preparar a não fixadas, os neurónios não-coradas para visualizar as neurites. Este é um primeiro passo importante para detalhar a ultra-estrutura das neurites saudáveis e estabelecer as bases para a compreensão do que estão presentes em modelos de doenças do sistema nervoso diferenças estruturais. Desde crio-ET pode resolver não corrigidos, características neurite não coradas em 3-D em escala nanométrica, o método, será possível, como nunca serantes de definir a arquitetura neuritic 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparar pratos com EM Grids para Galvanização primárias Neurônios
- Examine a integridade do carbono perfurado nas grades EM ouro usando um microscópio de luz com ampliação de pelo menos 25X. Certifique-se que buracos de carbono são> 98% intacto.
- Para chapeamento neurônios primários, use um bico de Bunsen para inflamar-esterilizar as grades EM e ao mesmo tempo torná-los hidrofílico. Use uma pinça para pegar a grade EM pelas bordas, e não a área em grade central. CUIDADO: Nunca deixe um bico de Bunsen aceso autônoma, e não use luvas ou pinças com componentes de plástico durante a execução destes passos:
- Antes de acender o bico de Bunsen, definir os ajustes de ar e gás para uma posição minimamente aberto.
- Acenda o bico de Bunsen usando uma pederneira atacante ou butano isqueiro.
- Modifique os ajustes de ar e gás para conseguir uma chama interior pequeno, azul dentro de um mais alto, mais leve chama azul / violeta. A ponta da chama interior é a parte mais quente da chama. O botão sobSob o queimador ajusta a quantidade de gás que entra no tubo do queimador, enquanto o tambor do queimador pode ser rodado para ajustar a quantidade de ar que entra no queimador. Virando o horário de ajuste do ar diminui o ar (resultando em uma chama roxa) e anti-horário aumenta o ar (resultando em uma chama amarela).
- Com uma pinça de metal (sem peças de plástico) para manter a grade EM, passá-la rapidamente através da chama duas vezes, voltados para o lado de carbono para cima. O lado de carbono aparece mais mate (menos brilhante) e com mais de uma tonalidade acinzentada que o outro lado.
- Transferir imediatamente a rede (lado do carbono para cima) para o centro do prato de fundo de vidro colocadas dentro de 10 cm do bico de Bunsen. Use uma grade EM por prato (Figura 1). Só use pratos com fundo de vidro que são pré-esterilizado, ou seja, através de irradiação gama.
- Use um microscópio de luz para verificar a integridade da rede (buracos de carbono intacta), enquanto ainda mantém a grade EM dentro do-bott vidroprato om (para evitar contaminação). Ao aplicar qualquer substância no grid ou qualquer coisa que vai entrar em contato com os neurônios, utilize procedimento estéril e pontas de pipetas estéreis.
- Num capuz de cultura de tecidos usando o procedimento de estéril, aplicar 250 ul da substância de revestimento apropriado, lentamente e com cuidado para a área central de vidro da placa de Petri. Certifique-se que a substância de revestimento apropriado abrange toda a grade de EM.
- Para os neurónios do hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como a substância de revestimento, preparado tal como anteriormente descrito 19. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo. Para gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios, use uma mistura gelatinosa de proteína secretada pela Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato (ver Tabela de Materiais e reagentes) como a substância de revestimento, preparar o seguinte. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo.
- Descongelar um frasco de estoqueda mistura de proteínas segregadas por gelatinoso Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), as células de sarcoma de rato durante a noite a 4 ° C.
- Manter frio a mistura gelatinosa proteína secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato, e todos os componentes utilizados para tornar a solução, isto é, mantendo-as em gelo.
- Enquanto sobre gelo, dilui-se esta mistura de proteína gelatinoso em meio Neurobasal para dar uma diluição de 1:20 (ou seja, diluir 500 uL da mistura de proteína gelatinoso em 10 ml de Neurobasal).
- Divide diluída mistura proteína gelatinoso em aliquotas de 1 mL e imediatamente armazenar quaisquer alíquotas adicionais a -20 ° C.
- Aplicar 250 mL por grade EM, por prato, conforme descrito na Seção 1.4.
- Para os neurónios do hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como a substância de revestimento, preparado tal como anteriormente descrito 19. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo. Para gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios, use uma mistura gelatinosa de proteína secretada pela Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato (ver Tabela de Materiais e reagentes) como a substância de revestimento, preparar o seguinte. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo.
- Cobrir a placa de Petri, com o seu topo e incubar (ou com PLL em amostras de hipocampo, ou com a mistura de proteína gelatinoso para espécimes DRG) durante 1 hora à temperatura ambiente, na capa de cultura de tecido.
- Aspiclassificar todos PLL (para amostras de hipocampo) ou a mistura de proteína gelatinosa (para amostras de DRG) dos pratos. Para fazer isso, use o sistema de vácuo na capa de cultura de tecidos. Utilizar uma ponta de pipeta estéril, ligada ao tubo de vácuo. Evite o contato direto com a grade de EM.
- Usar uma pipeta de deslocamento de ar ajustável para aplicar cuidadosamente 250 ul de PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) para a grelha de EM na área central de vidro de cada caixa de Petri, de tal modo que a grelha de EM é totalmente coberto pela PBS. Em seguida, aspirar o PBS de cada prato. Repita 3x.
- Permitir que os pratos com grelhas EM secar sob o capuz de cultura de tecidos durante 15 min. Certifique-se de que estão completamente secos, marcando sob o microscópio de luz na sala de cultura do tecido. Certifique-se de que não haja bolhas de umidade na grade. Se assim for, cuidadosamente aspirado ao lado da grelha de EM para eliminar esta humidade adicional. A grade revestida deve ser usado imediatamente para chapeamento os neurônios.
2. Preparação e Plating primária Neurônios na EM Grids
- Para placa neurônios primários, primeiro dissecar, trypsinize (usando 2,5% de tripsina) e triturar dissociar a hipocampo (ou gânglio da raiz dorsal de 18 dias de idade embriões de ratos) em células individuais, como descrito anteriormente 19.
- Triturar é um termo comum usado por neurobiologists para descrever dissociação aglomerados de células em células individuais, particularmente por utilização de uma pipeta de vidro com uma ponta polida ao fogo. O resultado é conseguido com cuidado e lentamente desenho e liberar as células, para cima e para baixo, várias vezes (~ 30), por meio da pipeta.
- Siga os procedimentos como descritos anteriormente para dissecção DRG e isolamento de células 24, tomando nota de utilizar 0,25% de tripsina (em HBSS) para isolar os neurônios DRG de ratos, ao invés de usar as enzimas sugeridas (papaína, a colagenase / Dispase), que são mais adequados para rato neurônios DRG.
- Calcule o número de neurônios isolados (ou seja, utilizando um hemocitômetro)e usar este valor para calcular o volume adequado de células para aplicar a cada prato para obter uma concentração de 50.000 células / ml por placa. O volume máximo a aplicar é de 250 mL. Note que isto só preenche a área de vidro central, e não todo o prato.
- Incubar os pratos durante 30 minutos em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Permitir células para recuperar e aderir.
- Lentamente, adicionar 1,5 ml de meio aquecido para cada prato, tomando cuidado para não perturbar a grade EM. O tipo de mídia depende do tipo celular (hipocampo ou DRG).
- Preparar os meios de comunicação apropriada para quer neurónios do hipocampo 19 ou neurónios do gânglio da raiz dorsal 24, que é para ser aquecido num banho de água a 37 ° C antes de usar. Incubar os pratos durante a noite na incubadora de CO 2.
- Para os neurônios do hipocampo, alterar a mídia no dia seguinte. Mude metade dos media a cada dois dias em diante, durante 14 dias. Aqueça a mídia em um 37 ° C banho de água antes do uso. Para os neurónios DRG, o dia seguinte dissecação / chapeamento, preparar um material fresco de meios de comunicação com um agente anti-mitótico (uridina e 5 '-fluoro-2'-desoxiuridina) fazer uma solução estoque de 10 mM de cada um, separadamente, usar um definitivo concentração de 10 uM para cada. Retirar metade dos meios de DRG (875 mL) e adicionar 875 mL de meio fresco com o agente anti-mitótico.
- Para neurônios DRG, a cada dois dias para a primeira semana, alternativo mudando media entre a mídia anti-mitóticas e mídia DRG padrão. Para a segunda semana, altere mídia DRG padrão a cada dois dias.
3. Vitrificação Neurônios na EM Grids
- Preparar o equipamento e todos os materiais para congelar e armazenar as grelhas EM ouro à temperatura criogénica: um dispositivo de vitrificação com uma câmara de humidade 17, uma pinça fina especializados pontos para a máquina de vitrificação, pinças ponto longo plana, Dewar (s) de azoto líquido (LN 2), crecipiente oolant, caixa de armazenamento rede EM, papel de filtro sem cálcio.
- Inicie o dispositivo de vitrificação. Ajuste a umidade para 100% e temperatura de 32 ° C. Na seção "Console", defina o tempo blot para zero segundos. Isso permite que o manual borrando através da janela lateral de câmara de umidade da máquina de vitrificação.
- Manuseie o papel de filtro sem cálcio com luvas, mergulhá-los de tal forma que três trabalhos são empilhados. Corte a pilha em 0,5 centímetros de largura tiras que são ~ 2 cm de comprimento. Dobrá-los a um ângulo de 90 ° de tal forma que um dos lados do papel tem de 0,5 cm x 0,5 cm da face (Figura 2). Com uma pinça, retire o papel do meio e colocá-lo em outro papel de filtro isento de cálcio até o uso.
- Coloque o botão de armazenamento de rede no porta-botão dentro da câmara de vitrificação. Encher a câmara interior do recipiente do líquido de arrefecimento com azoto líquido e esperar até completa evaporação. Encha a câmara externa do the recipiente de líquido de arrefecimento com azoto líquido até atingir uma temperatura estável para prosseguir para o passo seguinte. Encher a câmara interior com elevado grau de pureza de etano gasoso que irá condensar a um estado líquido no interior da câmara refrigerada.
- Mova o prato (s) da incubadora para um grande prato de 100 mm de poliestireno para o transporte para a sala de vitrificação, se não nas imediações. Use a pinça de vitrificação especializados para escolher com cuidado a grade EM do prato. Observe que lado os neurónios estão crescendo na grelha EM; posição importa para a próxima etapa. Usar o bloqueio de deslizamento preto sobre as pinças para bloquear com segurança as pinça sobre a grelha de EM.
- Inserir a pinça para dentro da máquina de vitrificação de tal modo que o lado da grade de EM em que os neurónios são aderidas caras para a esquerda, para longe do orifício da máquina de vitrificação de abertura lateral. Recolha os pinças especializados na máquina de vitrificação.
- Coloque o recipiente do líquido de arrefecimento no suporte apropriadoda máquina de vitrificação. Deve ser preenchido com LN adequada 2 e etano líquido. Usando o comando de tela apropriada da máquina de vitrificação, levante a câmara de líquido refrigerante para cima até que ele seja liberado com a parte inferior da câmara de umidade.
- Com as pinças ponto plana, agarrar uma extremidade do papel de filtro de tal forma que o lado mais curto (os 0,5 cm x 0,5 centímetros da face) é perpendicular às pinças. Esse cara vai entrar em contacto directo com a grade EM para secar (Figura 2B). Insira cuidadosamente o papel de filtro para o lado buracos de câmara de umidade da máquina de vitrificação (Figura 2A). Estável segurar o papel contra a grade de EM (o lado virado para longe da amostra) por 10 segundos. Descarte o papel depois e imediatamente mergulhe-congelar as amostras no etano líquido usando a automação da máquina de vitrificação.
- Transferir cuidadosamente sua grade EM frozen-hidratado a uma das vagas em uma dasbotões de armazenamento de rede. Repita o processo para as redes EM adicionais nos pratos. Os botões de armazenamento grade EM utilizados nesses experimentos pode armazenar vários grades EM congelados hidratado.
4. Coleção de imagens, Processamento e Anotação
- Prossiga para coletar 2-D microscopia eletrônica e / ou 3-D inclinação série 5 das neurites, utilizando um microscópio crio-eletrônico de sob uma condição de baixa dose. As imagens de 2-D foi concebido para avaliar a qualidade da rede em termos de espessura do gelo e as áreas possíveis de ser útil para o 3-D série de inclinação.
- Neste caso, todas as imagens foram coletadas usando uma câmera CCD 4k x 4k acoplada a um microscópio de 200 kV elétron equipado com um único titular tilt nitrogênio líquido transferência crio, a 20k ampliação microscópio em um alvo underfocus de 7 mM e amostragem de 4,4 Å / pixel.
- Para obter uma tomografia 3D da amostra, tirar uma série de imagens de projeção, enquanto progressivamente a inclinação do al amostraong um eixo do microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Dados os ângulos de inclinação e outras configurações experimentais, existem vários softwares diferentes disponíveis para coletar automaticamente a série de inclinação 5. A série de inclinação 3-D mostrado aqui foram coletados no mesmo microscópio usando semi-automatizado software aquisição série de inclinação 26 em uma faixa de -60 ° a 60 ° em incrementos de 5 ° com uma dose cumulativa de ~ 60 E / A 2.
- Reconstruir a série de inclinação das neurites, utilizando software de processamento de imagem 21, tal como anteriormente descrito para outras amostras de 5,29.
- Cor-anotar as características 3-D de neurites pelo primeiro segmentando o tomograma e criação de um modelo de superfície utilizando um software de processamento de imagem 3-D, conforme descrito anteriormente 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antes de congelamento e de imagens via crio-ET, devem ser tomadas da rede de EM em que os neurônios estão crescendo imagens de microscópio de luz. Neuritos deve ser claramente visível, sem sobreposição significativa com o outro. Uma caixa colorida na Figura 3A representa uma área que é ampliada em mostrar um maior ampliação na Figura 3B, em que as neurites se estendem através da treliça da grade. Cada grade quadrados é composto por uma película de carbono perfurado que suporta os neurônios e suas neurites. Estes furos são visíveis na imagem de um crio-EM de baixa dosagem feita a ampliação de 4k, que mostra o corpo como um neurónio, escura, de electrões denso objecto relativamente grande (Figura 3C), a partir do qual as neurites projecto para o exterior.
Uma parte do descanso neurite acima de um buraco no carbono é selecionado em uma caixa colorida na Figura 3C, e zoom-in com uma ampliação superior (20k) na Figura 3D. Neste ampliação, estruturas celulares internas claras incluindo microtúbulos, mitocôndrias e vesículas, deve ser claramente evidente (Figura 3D), em particular na forma óptima gelo fino como gerada de acordo com este protocolo. As estruturas preto escuro no centro da imagem (Figura 3D) são partículas de gelo hexagonais que são considerados como contaminação e tipicamente devem ser evitados, no entanto, dado que eles são muito escasso e fora das próprias neurites, que não interfiram com a reconstrução e cor-anotação das estruturas internas para análise e interpretação (Figura 4). Outra imagem de baixa ampliação da dose, de baixo é mostrado na Figura 5, a partir do qual um de neurites pode ser localizado, depois de que várias imagens de 2-D pode ser feita e digitalmente costuradas utilizando software de processamento de imagem para gerar uma montagem (Figura 6).
A inicialbaixa concentração de chapeamento (50.000 células / ml por placa) de neurônios nas grades eletromagnéticas permite neurônios que são separados o suficiente para garantir a visualização nítida das suas neurites (Figura 3C); concentrações superiores às recomendadas (> 50.000 células / ml por placa ) pode resultar em imagens com qualidade inferior de neurites lotados que são difíceis de rastrear ou atributo componentes celulares (Figuras 7B e 7C).
Figura 1. Esquema para o crescimento de neurônios em grades eletromagnéticas dentro de pratos com fundo de vidro. (A) pratos com fundo de vidro são mostrados, parcialmente preenchido com a mídia celular (rosa). (B) Cada prato contém uma grade EM ouro, como uma visão mais de perto revela. (C) de revestimento do EGrade M com poli-lisina é mostrado como um desenho em corte lateral. O prato de fundo de vidro é composta por uma lamela de vidro quadrada que está ligado ao fundo de uma placa de cultura de plástico, que cobre uma abertura circular, que foi originalmente cortada da parte inferior. Estes pratos com fundo de vidro são gamma esterilizados e comercialmente comprado como premade. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Esquema de blotting manual EM grades com os neurônios aderiram. (A) Close-up de deslizamento ranhura de entrada da máquina de vitrificação (seta preta) para o / câmara absorvente de umidade, em que uma pinça será inserido para apagar a amostra manualmente. (B)Esquema dos desenhos animados que mostra como o papel de filtro sem cálcio (0,5 cm x 0,5 centímetros face) devem ser tratadas usando a pinça de ponto plana e inserido através do slot de entrada para a câmara de umidade da máquina de vitrificação para secar a grade EM em que os neurônios são respeitados (gota de mídia celulares rosa mostrado). A grade EM é realizada por pinças de ponta fina especializadas no interior da câmara de umidade. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Visualizando congelados, neurônios hidratados em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades. (A) Imagem de microscópio de luz em aumento de 10x da área central de uma rede de EM em que neurônios primários de ratos foram groasa, durante 2 semanas. (B)-zunidas em vista da caixa de água mostrada em (A), em que os neurónios e as suas projecções de neurites são visíveis (setas cor de rosa). (C) Micrografia eletrônica em 4K ampliação de uma neurite projetando para fora do corpo do neurônio (seta vermelha). Esquematicamente corresponde a uma área (isto é, a caixa vermelha) dentro de uma das quadrículas mostrado em (B). Caixa azul é visto em close-up (D), onde os recursos internos da neurite são claramente visíveis na ampliação 20k (seta verde mitocôndrias; microtúbulos seta laranja; vesícula seta azul). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Reconstrução 3-D e anotação de um axônio tomografia DRG rato. (A) fatia tomográfica de uma pilha reconstruído de imagens tiradas em diferentes ângulos de inclinação de um axônio DRG. (B) correspondente anotação 3-D do mesmo axônio. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 5. 2-D imagem crio-EM de um neurônio DRG rato (centro-esquerda) com projeções axonais (caixa vermelha) em 4k ampliação. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 6. Montagem de quatro 2-D imagens crio-EM de um único axônio DRG rato. Cada imagem foi tomada no 20k ampliação. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 7. Imagens 2-D crio-EM de neurites. (A) Um axônio DRG de rato fotografada perto de proximidade com a soma das células. (B, C) Exemplos de superlotação de neurites, devido à alta concentração de chapeamento de neurônios em redes de EM. Todas as neurites eram de flash congelado duas semanas após o plaqueamento em grids EM ouro. Todas as imagens foram obtidas em 20k,. Ampliação Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 8. Reconstrução 3-D e anotação de uma neurite tomografia do hipocampo de ratos. (A) fatia tomográfica de uma pilha reconstruído de imagens tiradas em diferentes ângulos de inclinação de uma neurite do hipocampo. (B) correspondente anotação 3-D do mesmo neurite. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós mostramos que ratos neurônios embrionários (gânglio da raiz dorsal e hipocampo) podem ser cultivadas em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades e congelado em gelo vítreo fina o suficiente para as suas neurites a ser fotografada usando 2-D crio-EM e 3-D crio- ET. Enquanto neurites hipocampo foram previamente visualizados utilizando crio-ET 8,10,18,23, um protocolo detalhado para a replicação suficiente de sucesso utilizando dispositivos comercialmente disponíveis tem faltado. Além disso, enquanto a pesquisa foi pioneira no uso de crio-ET para a visualização de neurites hipocampo, nossos estudos explorar a aplicabilidade da crio-ET para mais de um tipo de espécime neuronais.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado preparando EM grades com ou hipocampo dorsal e raiz gânglio (DRG) neurônios, apagando-os a alcançar de forma otimizada gelo fino, e mergulhar-congelá-los para geração de imagens por crio-ET. Tempo blotting ideal é aquela que não resulta em gelo muito grosso para o feixe de elétrons para penetrar,nem muito fino que o gelo vítreo aparece com gradiente notavelmente diferente da borda do carbono perfurado para a mais interna do carbono perfurado. Além disso, a realização de forma otimizada gelo fino através da utilização de uma máquina de vitrificação 17 pode ser um pouco diferente para cada projeto, e congelamento robusto de usar a máquina de vitrificação requer uma curva de aprendizado.
Enquanto pesquisas anteriores se concentrou em neurônios do hipocampo, também explorado aqui em nossos estudos, ter ido mais longe para mostrar imagens em escala nanométrica de intactas, congelados hidratado axônios inteiras do gânglio da raiz dorsal (DRG), nunca imaginado antes de usar crio- EM ou crio-ET. Células de DRG foram escolhidos uma vez que (em contraste com os neurónios do hipocampo) exclusivamente dar origem a 34 axónios. Um protocolo para a imagem deles por cryo-EM/cryo-ET poderia ser útil para os interessados deduzir ultraestrutura axonal ou seja, em neurônios sensoriais. Nós também apresentar e discutir os resultados tanto ótimos e subótimos, bemcomo os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes.
Na concentração de células adequada (50.000 células / ml por prato), o espaçamento dos neurônios é tal que neurites permitem um excelente acesso usando microscopia óptica e eletrônica (Figuras 3A e 3B) com um ou dois neurônios aparecendo por grade quadrada (Figura 3B) . Permitindo separação suficiente entre os neurônios é necessário para melhor visualização das neurites via crio-EM (Figuras 3C e 3D). Os neurónios e as suas neurites está suportado num filme de carbono perfurado da grelha de ouro, como pode ser visto com clareza nas imagens crio-EM (Figuras 3C e 3D). Os corpos de neurônios, que podem variar de ~ 15-50 mm para os neurônios do hipocampo e gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios 30,33 são muito grosso para a imagem usando Cryo-EM e aparecer completamente preto, como é típico para very objectos densos em electrões e espécimes de espessura, em comparação com as projecções relativamente mais finas de neurites (não superior a 1 um de diâmetro) que irradiam a partir deles (Figuras 3C e 5).
3-D tecido cerebral incorporado de resina não revela neurites que são completamente circular em secção transversal 14, na verdade, a sua morfologia é variável. Assim, não se sabe se a forma não-circular de neurites é natural ou uma preparação artefato espécime. A espessura medida do axónio de DRG (Figura 4) cultivadas na grelha TEM, apagados e trabalhada como mostrado neste estudo, foi de 0,32 mM no sentido z (na profundidade do gelo vítreo) e uma largura média de 0,53 mM em o plano xy. A espessura medida do hipocampo de neurites (Figura 8) cultivadas na grelha TEM, apagados e trabalhada como mostrado neste estudo, foi de 0,50 mM no sentido z (na profundidade do gelo vítreo) e ummédio de 0,72 mM no plano xy. O processo de hibridação tal como aqui descrito poderia achatar as neurites embora permanecessem hidratado na sua tampão original durante todo o processo de hibridação e processo de congelação de imersão.
O ligeiro achatamento das neurites no grid como observado por cryoET não parece afetar a estrutura dos seus constituintes internos, tais como vesículas, como mostrado aqui, que são quase perfeitamente circular e não mostram sinais de desidratação. Em contraste, os processos químicos normalmente utilizados em preparações EM "tradicionais", em particular a fixação química com glutaraldeído e paraformaldeído, seguido por desidratação em etanol, resultar na contracção de tecido descontrolada. O potencial de encontrar um efeito celular como prejudicial é eliminado no método que apresentamos para cryoET em nosso manuscrito.
Além disso, os nossos exemplos de neurites foram imediatamente congeladas em mergulhar-etano líquido, resultando em instant 'encaixar' em gelo vítreo. Os tecidos que estão congelados em um estado vítreo aparecer muito mais parecido com o estado fisiológico do que outras técnicas. O nível de detalhe ultraestrutural não é o único aspecto que torna a técnica descrita em nosso protocolo para ser valiosa para pesquisadores de neurociência. A técnica de cultivo de neurônios em redes de EM, imediatamente borrando / os a preservar em um estado vítreo para triagem / imagiologia por cryoET de congelamento mergulho é uma técnica atraente porque abre a possibilidade de examinar ultra-estrutura de neurônios em diferentes genético, químico ou ambiental sublinha, sem a preocupação de possíveis artefatos de desidratação.
As condições de mata-borrão antes da congelação, conforme detalhado neste protocolo, são importantes para gerar gelo fino o suficiente para visualização por crio-ET das características ultra-estruturais, incluindo componentes internos, tais como mitocôndrias, vesículas e microtúbulos (Figuras 4, 6, 7A). As mitocôndrias, por exemplo, pode ser identificado na nossa preparação, uma vez que parecem estruturalmente semelhantes ao que foi observado em células (as arestas de fibroblastos embrionários) através de tomografia crio de electrões 20. Eles também exibem cristas, que pode ser visto nas imagens anotada-cor 3-D apresentam neste manuscrito. Imagens subóptimas pode resultar de gelo de espessura em que a imagem de crio-EM aparece geralmente opaco, impedindo a identificação bem sucedida de tais características como as mitocôndrias e microtúbulos no neurites. A falta de detalhes suficientes para a preparação de tais espécimes, nomeadamente sobre como produzir de forma otimizada gelo fino, quase certamente contribuiu para o sucesso limitado na definição da ultra-estrutura das neurites 8,10,17,23.
Imagens subóptimas também pode resultar a partir de muitos neurónios plaqueamento da grelha (> 50.000 células / ml por placa), o que resulta na aglomeração de neurites (Figuras0; 7B e 7C). Imagens borradas pode ser um resultado de desfocagem incorreta e deve ser ajustada, a desfocagem das imagens mostradas aqui foi tirada com uma underfocus alvo de 7 m. As imagens foram recolhidas em que desfocagem para garantir maior contraste e visibilidade de características ultra-estruturais, no entanto, uma desfocagem inferior (isto é, 2-3 mm), também poderia ser usado para obter dados de resolução mais elevados de tais características.
Outros fatores podem contribuir para imagens com qualidade inferior. Por exemplo, embora possa ser tentador usar outras características da máquina de vitrificação, particularmente a característica de transferência semi-automática, em vez de blotting o manual aqui descrito, este deu resultados indesejáveis. Dupla face blotting foi inicialmente tentada usando este recurso semi-automatizado, no qual a máquina de vitrificação (em vez de o utilizador) apaga a amostra directamente usando parâmetros tais como o tempo e o número de manchas de mata-borrão, tal como especificado pelo utilizador. No entanto, afimagiologia ter essas amostras, verificou-se que todos os neurônios tinham lisadas aberto, derramando-os seus conteúdos (corpos multivesiculares, etc.) Assim, a máquina de vitrificação é melhor usado neste caso para a sua câmara de humidade a temperatura controlável, em que a amostra é apagado antes de mergulhar-congelamento. Manter a amostra em tal estado (com umidade situado perto de 100%) minimiza a perda de água durante a preparação e ajuda a garantir gelo vítreo ideal pós-congelamento 3,7.
Idealmente, para minimizar a exposição dos neurónios a perturbações externas, eles devem ser cultivadas num incubador de CO2 (a temperatura ajustada para 37 ° C) em estreita proximidade com o quarto, com a máquina de vitrificação, e a temperatura para o aparelho deve ser configurado para 37 ° C, antes de flash-congelamento dos neurónios nas grelhas EM. Deve-se evitar a exposição de neurônios a grandes flutuações de temperatura antes de mata-borrão. Neste relatório, a temperatura foi ajustada para 32 ° Cpara fins de mata-borrão, os neurônios foram cultivadas em um prédio diferente e um lapso de tempo de ~ 10 min ocorreu entre carregando as placas de neurônios a partir de uma sala para outra. Cuidado foi tomado para proteger as amostras em um recipiente semi-isolamento à prova de água durante o processo de transporte. Uma mudança semelhante na temperatura e concentração de CO 2 (vivida pelos neurônios antes blotting / mergulhar-congelamento) ocorrem aos neurônios a cada ~ dois dias, quando os neurônios são levados para fora da câmara de incubação de seus meios de comunicação a ser alterado sob a biossegurança capa, como geralmente é feito para as culturas neuronais. Este não é visto para resultar em efeitos tóxicos para a célula.
No que diz respeito à presença do que parecem ser grânulos dentro das mitocôndrias neurites densos em electrões, vários relatos contraditórios existir. Tais grânulos são encontrados numa variedade de diferentes tecidos, as células não especificamente neuronais. Eles são vistos como um dissipador de cátions que regulam o iônico interno enbiente da mitocôndria. Eles também parecem criar sites de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa em que as enzimas podem funcionar de forma eficiente 16.
Estudos experimentais indicam que o cálcio e outros catiões divalentes acumular nas mitocôndrias quando estes iões estão presentes no fluido de banho mitocôndrias isoladas ou de células intactas. Parece provável que os iões são organicamente ligado aos grânulos intra-mitocondrial pré-existentes. Sugere-se, portanto, que estes grânulos são ligados à regulação do ambiente iónico interna da mitocôndria 31.
Além disso, os neurônios em nossa preparação foram cultivados em grelhas EM, por 14 dias, o momento de o que é típico para fins de desenvolvimento de neurites 15,36, antes de imagiologia por cryoEM / ET. Tem sido relatado que há um aumento dramático da concentração de cálcio intracelular em neurónios envelhecidas em comparação com Youn g neurônios 32. Portanto, é plausível que as mitocôndrias nas neurites desses neurônios com idade exibiria grânulos mitocondriais não necessariamente como um sinal de estresse, mas sim porque eles possuem uma presença maior de cálcio intracelular.
Grânulos mitocondriais elétron-denso também foram relatados em fibroblastos de rato embrionárias cultivadas em cultura e fotografada pela mesma tecnologia (tomografia crio-elétron) utilizada em nosso manuscrito 20. Estas células não mostraram padrões típicos de alteração ultraestrutural associados com lesão celular, como rompimento do citoesqueleto e vacuolização do citoplasma. Da mesma forma, dentro de nossas neurites como visualizado por cryoET, não observamos um citoesqueleto perturbado que seriam associados a toxicidade celular. Dadas as considerações acima, podemos concluir que os neurônios em nossa preparação não apresentam grânulos mitocondriais, como resultado de estresse ou toxicidade.
conteúdo "> Para esterilizar a superfície de grelha EM para evitar a contaminação aos neurónios, e também para gerar uma superfície favorável, hidrófila sobre a grelha de EM para que o poli-L-lisina pode aderir, ardor as grelhas EM antes do plaqueamento neurónios foi encontrado para ser vantajoso. esterilização UV não foi escolhida uma vez que requer a irradiação da grelha para um tempo mais longo (por exemplo, 20-30 minutos) na campânula de biossegurança. Em seguida, as grelhas que precisa de ser re-expostos novamente ao ambiente em que ser brilho descarregada para fins de hidrofilizante superfície da grelha. Glow-descarregando a rede garante que o subseqüente poli-lisina revestimento efetivamente faria 'stick' para a rede. A técnica de flamejante redes é vantajoso, uma vez que combina o passo hidrofilizante e esterilização passo em um. neurónios primários são conhecidos por serem mais sensíveis do que as linhas de células de tumor à base e é crucial para manter o seu meio ambiente (grade, caixa de Petri) tal como estéril quanto possível.(Figuras 3C e 5), que cobre mais de área da grelha para fins de selecção, que a imagem de neurites . Em seguida, 2-D imagens crio-EM pode ser tomado em intervalos e digitalmente costurados juntos em uma montagem (Figura 6). Esta técnica pode ser útil para características ultra-estruturais, tais como a organização de microtúbulos, por uma área maior do que a de uma única imagem de crio-EM.
Tomar uma dose baixa de, imagens de baixa ampliação (Figuras 3C e 5) também é útil na identificação de áreas de neurite que são consistentes em diâmetro em todo o filme de carbono holey (ambos nos buracos e em todo o carbono) e, portanto, mais ideal para imagens e análises subseqüentes. Ampliando de neurites mais buracos do filme de carbono é normalmente visto em maior neurites (Figura 5) com o material claramente mais interna do que as neurites mais finas (Figura 3C). Este fenómeno é provavelmente ocorrer devido à falta de suporte físico nos orifícios do filme de carbono. Quando a grelha de EM é removido do prato na qual os neurónios foram crescendo, e subsequentemente destruídos pelo lado de trás, as neurites com massa mais interno (Figura 5) do que os outros (Figura 3C), tendem a expandir-se e / ou queda nos orifícios. Embora este parece ser um artefacto, que tem como uma vantagem para mostrar mais claramente os componentes internos da neurite. Usando um filme de carbono contínua sobreposta neste filme de carbono holey pode ajudar a contornar esta questão em estudos futuros. Esta configuração foi inicialmente tentada, mas resultou em gelo vítreo muito grosso para a imagem latente. Testes subsequentes com diferentes espessuras de carbono contínuo sobrepostos na grade EM podem precisar de mais investigações.
Um importante benefício do método atual é que a organização espacial dos componentes celulares dentro da neurite podem ser visualizados em escala nanométrica, tomando várias imagens 2-D de um único neurite em diferentes ângulos de inclinação, e reconstruir esta pilha de imagens em uma tomografia. Características estruturais individuais podem então ser anotados manualmente para cada fatia de 2-D da pilha de 3-D, em cores diferentes, utilizando o software apropriado (ver Tabela de Materiais e reagentes), conforme mostrado por um axónio de um rato E18 gânglio da raiz dorsal (DRG) neurónios (Figura 4) e uma de neurites de um rato E18 neurónios do hipocampo (Figura 8).
Ao optar por ter uma imagem a cada 5 graus durante a série de inclinação, em vez de 1 ou 2 graus, menos imagens são coletadas, mas uma dose maior de elétrons pode ser usado por imagem. Isso resulta em maior contraste e menos ruído nas imagens raw. Isto é melhor para fins de reconstrução (alinhamento por correlação cruzada como uma rua ep) e anotação tomografia subseqüente, que é feito por mão de cada imagem que inclui a pilha de tomografia na direção z. A escolha de um tamanho de incremento também depende do tamanho da amostra, entre os diferentes ângulos de inclinação, os espécimes maiores não irá variar muito. Neste caso, utilizando-se um tamanho maior incremento (5 °) foi considerado como sendo mais adequado devido ao tamanho relativamente grande do espécime de neurites.
Além disso, a adição de marcadores de ouro fiduciais à rede EM ajudaria para o alinhamento de imagem fina, se desejar. Marcadores fiduciais não foram utilizados porque a amostra relativamente grande em comparação com as outras amostras de crio-EM (vírus ou proteínas em isolamento) e mostrou alto contraste com uma variedade de características estruturais que possam ser utilizados para o alinhamento adequado de cada uma das imagens de 2-D (compreendendo a pilha de 3-D) de correlação cruzada. A pilha de imagem resultante foi bem alinhadas usando essa abordagem, e utilizável para anotação cor posterior 3-D.
ent "> Para estudos futuros, utilizando um microscópio com um filtro de energia pode reduzir o ruído causado por elétrons inelasticamente espalhados, mas esse recurso pode não estar prontamente disponível na maioria das instalações de microscopia eletrônica. Nosso procedimento revela o que as imagens podem resultar de um padrão de 200 kV microscópio sem filtro de energia, que pode ser mais comumente disponíveis para a comunidade da neurociência em geral.O protocolo descrito aqui é otimizado para preparar e visualizar ambos os ratos axônios DRG embrionárias e neurites hipocampo utilizando equipamentos disponíveis comercialmente para crio-EM e crio-ET. Uma das principais vantagens desta técnica é que ela produz informações sobre a estrutura de neurites inteiros, não seccionada, moído ou tratado por diversos reagentes químicos, a fim de ver a sua ultra-estrutura. Nós demonstramos como crio-ET é particularmente excelente método para uso em análises ultra-estruturais futuros de neurônios em um estado próximo do nativo para examinar o impactode doença neurológica em estrutura neurite.
Os números de acesso de Microscopia Eletrônica do Banco de Dados para as tomografias em 3-D, conforme relatado neste artigo são os seguintes: Para o hipocampo neurite rato como mostrado na Figura 8 e no vídeo principal (a partir de 8:45-09:01), o EMDB número de acesso é EMD-5887. Para a raiz dorsal de rato de neurite do gânglio como mostrado na Figura 4 e na video principal (de 9:02-09:15), o número de acesso é BDME EMD-5885.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada pelos NIH bolsas (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS foi apoiado por uma bolsa do Programa do Centro Keck WM Interdisciplinar de Biociências de Formação da Costa do Golfo Consórcios (NIH Grant No. T32EB009379) Formação de Pós-Graduação Interdisciplinar Nanobiologia.
SHS dissecado, cresceu e vitrificados DRG e células do hipocampo; coletadas crio-EM e dados crio-ET de DRG e axônios do hipocampo; reconstruído e cor-anotada a série de inclinação. MRG dissecado e desde as células do hipocampo no laboratório do MNR. SC assistida em anotação série de inclinação. SHS foi treinado por CW sobre como dissecar e crescer neurônios. SHS, WCM e WC concebeu os experimentos. SHS preparou o manuscrito com a entrada de outros autores.
Este vídeo foi filmado no Centro de Imaging and Cellular NanoAnalytics (C-CINA) do Biozentrum de tele Universidade de Basel. C-CINA está integrada no Departamento de Ciência e Engenharia Biosystems (D-BSSE) da ETH Zürich, localizada em Basileia, Suíça.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al.
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al.
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al.
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G.
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al.
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).
